迭代饱和突变提高卤醇脱卤酶HheAAM催化制备6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活
n-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体高通量筛选方法及迭代饱和定点突变研究
核糖转移酶Ⅱ，技术路线如图 ３所示。
·４９·
图 ３ ＮＤＴ性质改造的技术路线
３ ＮＤＴ活性检测
催化下，３７℃摇床 中 进 行 反 应。 反 应 结 束 后，将 反 应 液 于 沸 水
全细胞催化在工业生产中应用比较广泛，无需繁琐的酶纯 中保温 ５ｍ０倍，
化过程，生产成本低。由于脱氧核苷和嘌呤类物质可以自由进 并用 ０．４５μｍ的滤器过滤上清液，用于 ＨＰＬＣ的上样检测。
附近 ６?的氨基酸残基，分析氨基酸残基所在位置结构，通过序 （图 ５）显示这些关键的底物结合位点具有高度保守性，Ｌｈ．ＮＤＴ
列比对与丙氨酸突变确定关键活性位点（丙氨酸突变的方法见 对应的亲核中心与底物结合位点分别为：Ｇｌｕ９９、Ａｓｐ９３、Ａｓｎ１２、
图 １ ＮＤＴ催化合成 ２＇－脱氧胞苷
２ 迭 代 饱 和 定 点 突 变 （Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＩＳＭ）
Ｒｅｅｔｚ等［２］于 ２００６年首次提出迭代饱和定点突变概念，该 方法是在已知酶三维结构的前提下，合理选择某几个关键位置 的 １～３个氨基酸进行饱和定点突变，筛选出活性提高的突变 体。以活性提高的突变体作为模板，在选择的其他关键位置再
进行下一轮突变，持续到获得目的性质的突变体为止。如图 ２
图 ２ 迭代饱和定点突变模型［４］
收稿日期：２０１９－１２－１６ 作者简介：宋健（１９９９—），山东农业大学生命科学学院 ２０１７级生物技术专业本科生 。
第 ６期
宋 健：Ｎ－脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体高通量筛选方法及迭代饱和定点突变研究
本研究计划通过迭代饱和定点突变（ＩＳＭ）联合全细胞高通 量筛选的方法，得到合成 ２＇－脱氧胞苷转化率提高的 Ｎ－脱氧
图 ４ ＮＤＴ全细胞催化合成 ２＇－脱氧胞苷的 ＨＰＬＣ检测图
工业催化作业 卤醇脱卤酶的研究综述1
多功能生物催化剂――卤醇脱卤酶的研究综述摘要:光学纯的环氧化物及β-取代醇是一类高价值中间体,在手性药物及精细化工合成领域具有十分重要的应用前景。
卤醇脱卤酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶,可以高效高选择地催化环氧化物和邻卤醇之间的转化,因而可以用来合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等化合物。
本文着重介绍了卤醇脱卤酶的催化机理及其应用研究进展,并对研究的发展方向提出了一些设想。
关键词:卤醇脱卤酶; 生物催化; 亲核试剂; 光学纯环氧化物与β-取代醇1 .卤醇脱卤酶研究概述及发展现状有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一,主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。
在自然界中,大部分异生质卤化物自降解能力很差,同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。
因此,应用微生物降解有机卤化物已引起人们广泛的关注。
从1968年Castro等[1]首次发现以2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobateriumsp。
) 菌株至今,人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物[2-8]。
其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)菌株AD1和节杆菌(Arthrobactersp?)菌株AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌(Corynebacteriumsp。
) 菌株N-1074等。
它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异,但是卤醇脱卤酶作为关键酶之一, 催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。
卤醇脱卤酶也叫卤醇-卤化氢裂解酶,通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢,是微生物降解此类化合物的关键酶之一。
大部分已知的卤醇脱卤酶都已经被克隆并在大肠杆菌中进行重组表达,并根据其序列同源性分为HheA、HheB、HheC3类。
相关的研究表明,卤醇脱卤酶与依赖NAD(P)H的短链脱氢酶/还原酶家族(SDR)具有一定的序列相似性,同时蛋白质三级结构的研究进一步揭示卤醇脱卤酶与SDR 家族成员有一定的进化相关性[9]。
基于组合设计策略提高卤醇脱卤酶hhec降解2，3-dcp的活性
摘要摘要1,2,3-三氯丙烷(TCP)作为表氯醇工业生产中的主要副产物，已经成为一种持久性的地下水污染物，对人体具有潜在致癌性，急需建立一种廉价高效的技术将TCP 从污染源中清除。
相比传统的手段，生物降解环境污染物的方法更加环保高效，同时也能节约成本带来更多的效益。
卤醇脱卤酶（HHDHs）是一种能够催化卤代醇的碳-卤键断裂的裂解酶，因此可以降解环境中的TCP。
同时，它们也可以在亲核试剂存在的情况下催化逆向的环氧化物开环反应，可以用来制备多种具有重要应用价值的手性卤代醇、环氧化物和β-取代醇。
改造卤醇脱卤酶的脱卤活性和立体选择性是本论文研究的两个重要方面。
最新研究显示，在生物降解1,2,3-三氯丙烷(TCP)的多酶体系中，HheC酶催化中间产物2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP）发生脱卤反应的活性极低，严重制约了TCP 的生物转化。
为此，本论文借助组合式改造策略来提高HheC酶对2,3-DCP的催化活性。
首先运用分子动力学模拟获得HheC在对2,3-DCP进行脱卤时相关的氨基酸残基信息，预测筛选出得到可能发挥作用的10个关键位点；然后借助半理性设计的策略，将这10个位点进行合理组合构建了6个饱和突变文库；筛选约8200个克隆子后，最终获得了30个针对底物2,3-DCP脱卤活性提高的突变体，其中突变体P84A活性提高了21.8倍，F86I提高16.7倍，F12Q/F186L和W249P分别提高17.4倍和16.9倍。
筛选得到对映体选择性提高的突变体F86S/L142Y（由E R=7.6提高到E R＝200），W139A（由野生态的E R=7.6提高到E R=184），P84A也从E R=7.6提高到E R=72。
通过分子对接和MD分析进一步探究上述突变体催化特性大幅改进的结构基础。
结果表明：P84、F86、F12、F186和W249这些位点对提高HheC降解2,3-DCP 的活性至关重要，且这些位点突变为小侧链氨基酸时活性更高；氨基酸P84，F86，L142，T134，N176和W139在调控HheC酶对底物的立体选择性方面也起着关键作用，P84，F86和W139突变成小侧链氨基酸时，卤醇脱卤酶HheC对(R)-2,3-DCP 有很强的偏好性，而当T134和N176发生突变时，HheC酶对(R)-2,3-DCP的偏好性全部丧失，有逆转HheC偏好性的趋势。
定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活
定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活周海岩;李会帅;王培;柳志强【摘要】为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h 的P4H进行三维结构模拟和\"热点\"氨基酸分析,选择了7个位于\"疏水口袋\"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K.采用F137R和Y205K催化转化0.35 g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09 mg/L和52.29 mg/L),比野生型酶分别提高了58％和50％.经过分子对接比较发现,突变型P4 H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的.该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2018(047)004【总页数】6页(P193-198)【关键词】L-脯氨酸4-羟化酶;反式-4-羟基-L-脯氨酸;生物催化;定点饱和突变【作者】周海岩;李会帅;王培;柳志强【作者单位】浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州 310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州 310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州 310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014【正文语种】中文【中图分类】Q814.9反式－4－羟基－L－脯氨酸（4－Hyp）是一种应用广泛的高附加值非天然氨基酸［1］。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第32卷第5期高校化学工程学报No.5 V ol.32 2018 年10月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Oct. 2018文章编号：1003-9015(2018)05-1127-07迭代饱和突变提高卤醇脱卤酶HheA AM催化制备6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活王露, 徐刚, 杨立荣, 吴坚平(浙江大学化学工程与生物工程学院, 浙江杭州 310027)摘要：(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯 (A7) 是合成降血脂药物阿托伐他汀钙的关键手性中间体，利用卤醇脱卤酶催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯 (D3) 的脱卤氰化反应制备A7是很有潜力的合成方法。
现有研究存在的主要问题是卤醇脱卤酶种类少，对底物D3的催化活性很低，且鲜见有关脱卤酶分子改造提高其对D3催化活性的报道。
本研究利用基因挖掘技术获得了一个对D3表现出较高催化活力的卤醇脱卤酶HheA AM (来源于Agromyces mediolanus sp.)，运用定向进化和半理性设计方法确定了4个影响酶活的关键位点(84、88、136、144位)，然后使用迭代饱和突变(ISM)策略对这4个位点进行组合突变，突变株M4-HheA AM(84S-88L-136T-144C)的比酶活为0.89 U·mg-1，是野生型HheA AM(Wt-HheA AM)的13倍，对D3的催化活性得到了显著的提高。
关键词：卤醇脱卤酶；脱卤氰化反应；酶活；迭代饱和突变；(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中图分类号：TQ465.92 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-9015.2018.05.018Enhancement of HheA AM Activity via Iterative Saturation Mutagenesis for tert-Butyl6-Cyano-3,5-Dihydroxyhexanoate SynthesisWANG Lu, XU Gang, YANG Li-rong, WU Jian-ping(College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)Abstract: tert-butyl (3R,5R)-6-cyano-3,5-dihydroxyhexanoate (A7) is a key chiral synthon of the cholesterol- lowering drug atorvastatin. Application of halohydrin dehalogenases for dehalogenation and cyanogenation of tert-butyl (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate (D3) to prepare A7 is a promising approach. However, the main problems are lack of halohydrin dehalogenases, low catalytic activity and not enough research on improving catalytic activity towards D3. In this study, a halohydrin dehalogenase from Agromyces mediolanus sp. was obtained by gene mining, which showed relatively high activity to D3. Four key sites affecting enzyme activity are found (site 84, 88, 136 and 144) using directed evolution and semi-rational design methods. M4-HheA AM (84S-88L-136T-144C) is obtained (specific activity of M4-HheA AM is 0.89 U·mg-1) with 13-fold activity enhancement to wild type (Wt-HheA AM) after applying iterative saturation mutagenesis at these four sites.Key words: halohydrin dehalogenase; dehalo-cyanogenation; enzyme activity; iterative saturation mutagenesis; tert-butyl (3R,5R)-6-cyano-3,5-dihydroxyhexanoate1前言他汀类药物具有良好的降血脂疗效[1]，其中的代表性品种阿托伐他汀钙是唯一一个全球年销售额连续多年过百亿美元的药物[2-3]。
近年来，文献报道了多种阿托伐他汀钙的合成方法[1,4]，具有光学活性的侧链 (3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯 (A7) 是其合成的关键手性砌块(图1)。
收稿日期：2018-02-06；修订日期：2018-03-30。
基金项目：国家自然科学基金 (21076187)；国家“973”计划资助项目(2011CB710800)。
作者简介：王露(1993-)，女，浙江台州人，浙江大学硕士生。
通讯联系人：吴坚平，E-mail：wjp@1128 高校化学工程学报2018年10月图1 阿托伐他汀关键中间体A7的合成方法Fig.1Synthetic route of atorvastatin intermediate (A7)传统化学合成路线先由(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(A5)经二异丙基氨基锂(LDA)介导的克莱森缩合制备 (5R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(A6)，再经NaBH4选择性还原获得A7，反应涉及超低温，工业化应用难度大，且能耗很高[1-2]。
现工艺采用羰基还原酶(KRED)催化A6到A7的不对称还原反应，但仍涉及A5到A6的化学反应步骤[2-3]，而利用卤醇脱卤酶催化 (3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)的脱卤氰化反应制备A7反应条件温和，副反应少，极具应用潜力。
2013年，陈少云[5]首次利用卤醇脱卤酶HHDH[6]催化D3制备A7，之后王金玉[7]对此HHDH进行分子改造得到突变酶Mut-HHDH(W86I)，比酶活约为0.65U·mg-1(37℃、pH7.0)。
2017年，Luo Yu等[8]对HheC2360[9] 进行分子改造得到突变酶Mut-HheC2360(V84G/W86F)，其对D3的催化效率提高了15倍，比酶活约为0.02 U·mg-1(45℃，pH 7.0)。
目前卤醇脱卤酶筛选和改造研究中关于催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(A4)制备A5的比较多[5, 9-10]，但是由于底物差异比较大，针对A4筛选和改造得到的卤醇脱卤酶并不适合催化D3制备A7，改造策略基本没有可以借鉴的地方。
因此通过筛选和分子改造提高卤醇脱卤酶催化D3制备A7的酶活具有重要的研究意义。
本研究使用基因挖掘技术来筛选对D3有较高催化活性的卤醇脱卤酶，发现来源于Agromyces mediolanus sp.的卤醇脱卤酶HheA AM酶活较高，然后运用定向进化和半理性设计方法确定影响酶活的关键位点，并使用迭代饱和突变(ISM)策略对这些位点进行组合突变以进一步提高酶活，希望获得优势突变酶，为后续研究奠定良好的基础。
2材料与方法2.1 菌株和质粒大肠杆菌E. coli BL21(DE3)和表达质粒pET-28a(+) 均为本实验室保藏。
2.2 在线工具与软件用BLAST (http: //) 进行基因挖掘，用Clustal X进行多序列比对，用Swiss-Model (http: //) 进行蛋白结构模拟，用Discovery Studio 4.0软件进行分子对接。
2.3 卤醇脱卤酶基因的合成、克隆与表达基因均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(针对E. Coli内表达密码子优化)，上下游引物均由擎科梓熙生物技术(杭州)有限公司合成。
目的基因构建至pET-28a(+)载体的Bam H I和Hind III酶切位点之间。
将成功转化的单克隆接种于5 mL LB液体培养基(50 μg·mL-1 Kan)中，37℃、200 r⋅min-1条件下培养8 h，然后转接到50 mL LB液体培养基(50 μg·mL-1 Kan)中，培养至OD600为0.8~1.0，添加IPTG至终浓度0.5 mmol⋅L-1，18℃下诱导过夜。
2.4突变文库的构建2.4.1 易错PCR文库构建以pET-28a(+)-HheA AM为模板，利用Trans EasyTaq DNA Polymerase试剂盒在HheA AM全长基因上引入随机突变，PCR体系和PCR程序见说明书，以2.3的方式构建重组突变质粒，转化大肠杆菌感受态细胞得到突变体库。
第32卷第5期 王露等： 迭代饱和突变提高卤醇脱卤酶HheA AM 催化制备6-氰基-3,5-二羟 基己酸叔丁酯的酶活 11292.4.2 ISM 文库构建以pET-28a(+)-HheA AM 为模板，利用全质粒PCR 方法在HheA AM 基因上引入特定位点的突变，Dpn I 消化后转化大肠杆菌感受态细胞得到突变体库，筛选获得文库中最优突变体，以其质粒作为下一轮PCR 的模板，引入新位点的突变。
2.5 高通量筛选方法[5,7]在96浅孔板(母板)的每孔中加200 μL LB 液体培养基(50 μg·mL -1 Kan)，用灭菌牙签从野生型HheA AM (Wt-HheA AM )平板上挑取单菌落接种到图2中黑色位置，将突变菌株接种到图2中空白位置，37℃、200 r ⋅min -1条件下培养8 h 。
在96深孔板(子板)的每孔中加400 μL LB 液体培养基(50 μg·mL -1 Kan)，再将母板中的种子液按对应位置转接到子板中(接种量为50 μL)，37℃、200 r ⋅min -1培养条件下3 h 左右，添加IPTG 至终浓度0.5 mmol ⋅L -1，18℃下诱导过夜。