工业催化作业 卤醇脱卤酶的研究综述1

多功能生物催化剂――卤醇脱卤酶的研究综述摘要:光学纯的环氧化物及β-取代醇是一类高价值中间体,在手性药物及精细化工合成领域具有十分重要的应用前景。

卤醇脱卤酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶,可以高效高选择地催化环氧化物和邻卤醇之间的转化,因而可以用来合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等化合物。

本文着重介绍了卤醇脱卤酶的催化机理及其应用研究进展,并对研究的发展方向提出了一些设想。

关键词:卤醇脱卤酶; 生物催化; 亲核试剂; 光学纯环氧化物与β-取代醇1 .卤醇脱卤酶研究概述及发展现状有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一,主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。

在自然界中,大部分异生质卤化物自降解能力很差,同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。

因此,应用微生物降解有机卤化物已引起人们广泛的关注。

从1968年Castro等[1]首次发现以2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobateriumsp。

) 菌株至今,人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物[2-8]。

其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)菌株AD1和节杆菌(Arthrobactersp?)菌株AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌(Corynebacteriumsp。

) 菌株N-1074等。

它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异,但是卤醇脱卤酶作为关键酶之一, 催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。

卤醇脱卤酶也叫卤醇-卤化氢裂解酶,通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢,是微生物降解此类化合物的关键酶之一。

大部分已知的卤醇脱卤酶都已经被克隆并在大肠杆菌中进行重组表达,并根据其序列同源性分为HheA、HheB、HheC3类。

相关的研究表明,卤醇脱卤酶与依赖NAD(P)H的短链脱氢酶/还原酶家族(SDR)具有一定的序列相似性,同时蛋白质三级结构的研究进一步揭示卤醇脱卤酶与SDR 家族成员有一定的进化相关性[9]。

SDR是一类依赖于NAD(H)或NADP(H)并在功能上具有多样性的一组酶类,主要催化醇、糖类、类固醇和一些异生质的氧化还原反应[10-11]。

由于辅酶结合位点在卤醇脱卤酶中被卤离子结合位点取代,因而卤醇脱卤酶是一类不需要辅酶参与的脱卤酶。

同SDR家族一样,在卤醇脱卤酶中严格保守的丝氨酸、酪氨酸和精氨酸在催化过程中起着关键作用。

其催化机制(图1)为:保守的丝氨酸通过与底物羟基氧原子之间形成氢键,稳定了底物的结合;精氨酸可用以降低酪氨酸的pKa值;酪氨酸从底物的羟基中夺取一个质子,然后以底物上的氧原子作为亲核试剂,进攻邻位卤素取代的碳原子,进而释放卤离子,形成环氧化物[9,12]。

卤醇脱卤酶备受关注的另一个原因是其在生物催化领域的应用,可以用来合成具有光学纯的高价值中间体。

这些化合物在手性药物、手性农药以及各类手性合成的合成领域中具有传统化学合成法所无法比拟的优越性。

其中光学纯的环氧化物以及用来合成该类化合物的前体邻卤醇在有机合成中具有特别重要的应用价值。

因为环氧化物环具有非常活泼的化学特性,易与亲核试剂发生反应生成一类重要的手性合成单元―――不对称醇类。

因此,多种合成光学纯环氧化物的生物学方法已被广泛研究,其中包括人们熟知的脂肪酶、环氧化物水解酶等。

卤醇脱卤酶催化邻卤醇生成环氧化物将成为高效合成光学纯的环氧化物的主要方法之一。

本文将重点介绍卤醇脱卤酶在催化合成环氧化物、短链β-取代醇以及叔醇类化合物方面的研究进展。

2 .卤醇脱卤酶的应用研究及发展特点技术优势卤醇脱卤酶的催化特性显示这是一类具有广阔应用前景的多功能生物催化剂。

主要体现在催化邻卤醇与环氧化物之间的转化反应不依赖于辅助因子;卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应,而且可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂,如N-3、NO-2、CN-等所介导的环氧化物开环反应,用以生成一系列光学纯的β-取代醇[13-14]。

尤其在催化CN-介导的环氧化物开环反应中,不但可以合成一类具有光学纯的高价值中间体β-羟基腈,而且生成了新的C―C键。

因此,除了已知的转醛酶、转酮酶和羟基腈裂解酶外,卤醇脱卤酶也可以作为化学合成中的一种工具酶用于C―C键的合成中。

2.1 高选择催化邻卤醇的脱卤反应卤醇脱卤酶在催化由邻卤醇合成环氧化物方面具有很高的立体选择性,因而通过动力学拆分可以直接合成具有光学活性的环氧化物和卤代醇类。

其中光学纯的邻卤代醇是合成光学纯的环氧化物的前体,环氧化物环具有极其活跃的反应特性,易于和卤素、碳、氮、氧或硫等亲核试剂反应,因此可以制备很多相关的衍生物。

尤其是具有光学活性的C3环氧化物及其衍生物,如表氯醇、缩水甘油2,3-二氯-1-丙醇和3-氯-1,2-丙二醇等,由于它们都具有甘油的骨架,因而在手性化合物合成方面极具潜力。

例如缩水甘油衍生物与胺的转化是制备多种β-阻断剂中非常重要的一步[15]。

目前,应用单加氧酶和环氧化物水解酶来合成光学纯的环氧化物也有相关报道。

来源于放射形土壤杆菌(A?radiobacter)菌株AD1的卤醇脱卤酶HheC可以高选择性地催化不同的芳香族邻卤醇的转化,生成相应的R型环氧化物和S型邻卤醇。

动力学分析显示HheC的高对映体选择性主要取决于酶对不同对映体的绑定和化学反应步骤。

卤醇脱卤酶的这一催化特性也在相关的X射线的晶体学研究中得到了解释[16]。

三级结构数据显示,对映体(R/S-pNSO)在活性位点的空间结合位置存在着明显的区别。

主要体现在环氧化物环上的氧原子及β碳原子的位置不同。

其中S对映体以非产物形式结合于其上,即环氧化物上的氧原子取向错误,以至于无法与催化氨基酸残基酪氨酸Tyr145形成氢键,亲核试剂无法对β碳原子进行亲核攻击。

因此,只有R构型的对映体才能转化为相应的β取代的醇。

自由能的计算显示二者之间只有很小的差异,这同R构型结合有两个氢键而S构型的结合只有一个氢键相一致。

上述研究结果为该酶的改造奠定了良好的理论基础。

可以应用定点突变技术对酶的底物结合口袋进行改造,来调控HheC的对映体选择性[17]。

通过将该区域的139位酪氨酸突变为较小残基,突变体HheC完全失去了野生态酶对(R)型对映体的高选择性。

稳态动力学研究表明,这主要是由于突变体对(S)型底物的亲和力大大提高,而对(R 型底物的亲和力有所降低的缘故。

另外,通过对酶催化反应的限速步进行改造可以大大提高酶的催化活性。

突变体HheC如Y187F和W249F在催化对-硝基-2-溴-1-苯基乙醇(p-nitro-2-bromo-1- phenyl-ethanol)和1,3-二氯丙醇的转化过程中其活性得以提高。

主要是因为增加了卤离子的释放速度,该步骤为这些底物转化的限速步骤[18]。

这些研究表明定点突变在调控卤醇脱卤酶的活性与对映体选择性方面是一种值得推广的好方法。

卤醇脱卤酶在选择性催化邻卤醇转化为环氧化物反应中,由于反应热动力学平衡的存在,使得反应难以完全进行。

闭环反应是否完全进行,主要取决于底物中卤素取代的类型。

对于氯取代的邻卤醇,平衡更倾向于形成卤醇,并遵循以下顺序Cl->Br->I-。

为了避免由此而造成较低的对映体过剩值(e?e?),Lutje等[19]通过加入过量的环氧化物水解酶来提高产物的光学纯度,并获得光学纯S型2,3-二氯-1-丙醇和2-氯-1,3-苯基乙醇(e?e?值均大于99%),且E 值分别为>100 和73。

2.2 亲核试剂介导的环氧化物开环反应卤醇脱卤酶的多功能性主要体现在亲核试剂所介导的环氧化物开环反应中。

Lutje等[14]以对硝基苯乙烯氧化物为底物的反应中测验了卤醇脱卤酶与一系列的离子和非离子亲核试剂参与反应的能力, 发现酶可以接受Br-、Cl-、N3-、NO-2和CN- 等阴离子作为亲核试剂,并且具有较高的区域与对映体选择性。

新近研究表明,除了上述亲核试剂, 卤醇脱卤酶还可以接受其余4种阴离子亲核试剂, I-、SCN-、OCN-和HCOO-[20-21]。

在环氧化物开环反应中,卤醇脱卤酶可以高选择性地催化9种不同的亲核试剂所介导的反应。

因此,可以通过动力学拆分手段制备多种具有光学纯的β-取代醇和环氧化物,充分显示出卤醇脱卤酶的广阔应用前景。

2.2.1 环氧化物的叠氮化最早生物法催化环氧化物叠氮化反应是由红球菌Rhodococcussp.的酶粗提液参与完成的[22],其终产物叠氮化醇具有很低的e?e?值,并且人们对粗提液中真正起催化作用的酶了解甚少。

此外,可以接受N-3作为亲核试剂的生物酶种类也很少。

卤醇脱卤酶可以接受N-3 作为亲核试剂,而且反应表现出极高的立体选择性[13]。

如HheC在催化对-硝基氧化苯乙烯(p- nitro-styreneoxide,pNSO)进行叠氮化反应,其终产物(R)-1-对-硝基苯基-2-叠氮化乙醇的e?e? 值为96%,同时没有反应的(S)型环氧化物的e?e?值高于99%。

除了对-硝基氧化苯乙烯外, HheC对对-氯环氧苯乙烯也显示出极高的立体选择性(E>200)。

对氧化苯乙烯的选择性却一般, 主要是由于后者化学性环氧化物叠氮化反应很快。

通常,化学性环氧化物叠氮化反应是α位的区域选择,而酶催化的反应显示出了很高的β区域选择性。

因此,化学性环氧化物叠氮化反应的存在,在某种程度上降低了该反应的立体选择性。

上述动力学拆分的最大不足之处是其最高产量只能达到50%,而动态动力学拆分则利用了非偏好对映体可以发生外消旋反应这一特性,可以使最终产量高达100%。

Lutje等[23]正是利用这一特性, 以表溴醇为底物对其叠氮化反应进行了研究。

反应体系中加入一定浓度的溴离子,表溴醇除了可以发生叠氮化反应外还可以生成1,3-二溴丙醇。

由于HheC对1,3-二溴丙醇闭环反应具有较低的对映体选择性,而对表溴醇的叠氮化反应具有很高的对应体选择性,因此,表溴醇可以通过该反应进行外消旋化。

在一定条件下,以表溴醇为底物,通过动态动力学拆分可以使得e?e?值大于99%的(S)-1- 叠氮基-3-溴-2-丙醇的产量提高到77%。

总之,环氧化物的叠氮化开环反应可以用于合成具光学活性的叠氮醇,该产物是极具应用价值的生物活性物质―――胺醇的直接前体。

2.2.2 环氧化物的亚硝酸化HheC催化的以NO-2作为亲核试剂的环氧化物开环反应较上述的叠氮化反应复杂,主要是由于NO-2的兼性离子特性,即氧原子和氮原子都可以对环氧化物环上的C原子进行亲核攻击。

虽然NO2介导的环氧化物开环反应同叠氮化反应一样具有较高的区域选择性(β位进攻为主),仍然可以产生两种取决于亲核试剂的N/O选择性攻击而得到的异构体产物。