【精华】华西-新药药理学实验设计文稿
新药药理学
——支气管哮喘病特效药研究方案及临床前筛选和实验方法概述
四川大学华西药学院
2012级 8班
周鹏翔
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一、研究背景概述
1．选题及意义
支气管哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与气道慢性炎症性疾患。这种慢性炎症导致气道高反应性的产生，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和（或）凌晨发作、多数患者可自行缓解或经治疗缓解[1]。而有关支气管哮喘，众多细胞因子参与其发作，其中白介素23（IL23）水平和哮喘发作密切相关。IL-23是2000年发现的细胞因子，具有多种生物学功能，并在多种疾病中发挥重要作用。近年来，IL-23 在支气管哮喘中的作用得到了关注。因此，以IL-23为作用靶点的药物可能对支气管哮喘产生积极的疗效。
2.作用因子及靶点
IL-23由p19和IL-12中的p40 两个亚基组成，它们之间以二硫键相联结。人和鼠的p19 相应蛋白质中均含有5个半胱氨酸残基，无N-糖基化位点，两者有70％同源，其蛋白质组成大部分与IL-12p35、IL-6和G-CSF相近，因而在小鼠体内的药理学实验结果对人有一定的借鉴意义。IL-23的受体由IL-12R中的一个亚基IL-12Rβ1和IL-23R两个亚基组成。人IL-23R的基因定位于人1号染色体距离IL-12Rβ2大约150 kb的地方。人T细胞、自然杀伤细胞（NK）包括NK白血病细胞均可以表达IL-23R[2]。因此，本“新药X”（下称X药）选择以肺组织细胞中IL-23R为作用靶点，特异性竞争性地抑制IL-23和其受体结合，减少其表达蛋白产物的生成，从而缓解支气管哮喘。
3．靶点选择的文献依据
通过构建动物模型，分为正常组、哮喘组，应用ELISA 法检测两组小鼠外周血IL-23 水平、RT-PCR 法检测肺组织中IL-23p19mRNA 表达、免疫组化法检测肺组织中IL-23 表达;分离小鼠脾脏T淋巴细胞进行体外培养，应用RT-PCR 法检测小鼠脾脏T淋巴细胞IL-23p19mRNA 表达水平、Western blot检测IL-23p19蛋白表达情况[3]（图片以及表格数据均引用于该文章）。结果表明哮喘小鼠中，IL-23 在血清、肺组织、脾脏T淋巴细胞中表达均较正常小鼠明显增高（P<0.01）。另一篇文献也做了类似的研究，将45只雌性C57/6J小鼠随机分为哮喘组、肥胖哮喘组（肥哮组）和对照组各15只。卵白蛋白激发致敏和高脂饮食制作肥胖哮喘模型，计
[1]引自百度百科“支气管哮喘”词条
[2]李艳春，鲁继荣.白介素-23的生物学功能.临床儿科杂志。2010.3：295-299
[3]李艳春，孙萌，赵丽娜，鲁继荣.白细胞介素23在哮喘小鼠动物模型中表达的研究.中国免疫学杂
数支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数并分类，酶联免疫吸附法法测定肺组织匀浆中白细胞介素（IL）-17、IL-23和8-异前列腺素2α（8-iso-PGF2α）水平。结果表明：肥哮组肺组织匀浆的IL-17、IL-23和8-iso-PGF2α水平分别为(65.83±5.69)pg/ml、(141.52±14.62)pg/ml和（61.33±7.75）pg/ml均高于哮喘组和对照组（P<0.05）[4]。
二、针对特定靶点离体筛选的方法
X药拟特异性阻断肺组织细胞的IL-23R，从而发挥治疗支气管哮喘的作用。由于细胞因子必需通过与其相应的受体结合后才能具有生物活性，因此以炎症细胞因子受体为靶位建立受体拮抗剂的筛选模型，对不同来源化合物(组合化学库、天然产物等)进行筛选，有可能获得相应受体的拮抗剂，这些拮抗剂通过和受体天然配基(炎症细胞因子)竞争结合受体，从而可以达到降低细胞因子活性治疗炎症等疾病的目的[5]。
离体建立基本的药物筛选的总体思路是，从天然产物中选择适当的筛选模型，筛选得到一系列化合物，进一步优化后得到先导化合物，随后进行高通量筛选（High-throughput screening, HTS），最终得到目标几种有效的化合物，进而利用现代仪器分析的各种手段鉴定这几种化合物的结构，依据药物化学等方法的构效关系对该化合物进行结构修饰以从理论上完善其分子结构，从而指导该类化合物的全合成或半合成的进行，并且以有利于其在体内[4]王伟，高倩，唐平华.IL-17和IL-23在肥胖哮喘小鼠气道炎症中的作用及其与氧化应激的关系.当代医学.2012.5第18卷第13期
[5]李元.以炎症相关细胞因子受体为靶位的受体拮抗剂筛选模型构建及受体拮抗剂研究.Bull Med Res.
的药效学和药动学性质，若有明显毒性或副作用的结构则淘汰，这为进一步的临床前研究做好理论准备。
X药采用受体配体结合技术的离体筛选模型，即从细胞、分子水平进行药物筛选，其基本机制是X药阻断IL-23与其IL-23R的特异性结合，从而筛选出高效专一的肺组织细胞
IL-23R拮抗剂。
具体方法可以概述为：通过文献调研，从大量土壤（四川、云南、贵州等地）真菌代谢产物中提取出具有舒张支气管平滑肌、止咳、抗肺部炎症等临床疗效的成分，将小鼠的离体肺组织细胞膜受体作为筛选模型，利用高灵敏度的放射性同位素标记X药，利用X药与
IL-23R高度特异性结合形成受体-配体复合物，并通过测量该复合物的放射性，从而筛选出目标先导化合物群。进一步利用HTS技术（是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型，根据样品与靶点结合的表现，判断化合物的生物活性的一种技术），更为精确地筛选出有效化合物，然后通过各种光谱手段和合成手段确定各种化合物的结构，结构修饰并进一步筛选，最后得到几种可能的有效化合物，进行进一步的临床前研究。
三、新药临床前药理学研究实验方案
1.主要药效学研究方案
1.1 药效学实验方案
1.1.1 实验动物
模型I： 2~3周龄昆明小鼠30只，均为雌性，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。
模型II：2~3周龄昆明小鼠30只，均为雌性，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。
(注明：模型I和II均为诱发性动物模型，如有条件也可选用模型III：自发性哮喘小鼠模型。) 模型III: 2~3周龄患有自发哮喘的昆明小鼠20只，均为雌性，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。)
1.1.2主要试剂和仪器
模型I：卵白蛋白(ovalbumin，OVA，GradeV，美国Sigma 公司)；胆固醇（广州金锐化工）；一定浓度的X药液；生理盐水；小鼠白细胞介素IL-23 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（ADL 公司）；雾化器（德国PARI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本 Olympus
公司）[6]；RT-PCR检测仪器；组织抗修复液；SP试剂盒、DAB显色试剂盒。
模型II：橄榄花粉提取物溶液；一定浓度的X药液；生理盐水；小鼠白细胞介素IL-23 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（ADL 公司）；雾化器（德国PARI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）[6]；RT-PCR检测仪器；组织抗修复液；SP试剂盒、DAB显色试剂盒。
模型III：一定浓度的X药液；生理盐水；小鼠白细胞介素IL-23 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（ADL 公司）；雾化器（德国PARI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）[6]；RT-PCR检测仪器；组织抗修复液；SP试剂盒、DAB显色试剂盒。
1.1.3方法
1.1.3.1动物分组与造模：
模型I: 将30只小鼠实验前饲养1周后随机分为3组，每组10只。哮喘给药组：清洁级环境，普通饲料。第10天和第20天小鼠腹腔注射致敏液（0.08%，OVA）0.25ml/10g。第30天~50天小鼠于密闭容器中以1%的OVA溶液雾化吸入30min，第30~40天每日雾化，第40~50天隔日雾化，第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。哮喘非给药组：清洁级环境，普通饲料。OVA致敏液处理同哮喘给药组，但第60天则以生理盐水雾化吸入10min。对照组：清洁级，普通饲料，生理盐水致敏激发，于第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。
模型II: 将30只小鼠实验前饲养1周后随机分为3组，每组10只。哮喘给药组：清洁级环境，普通饲料。第10天和第20天小鼠皮下注射致敏液（0.08%，橄榄花粉提取物）0.25ml/10g。第30天~50天小鼠于密闭容器中以1%的橄榄花粉提取物溶液雾化吸入30min，第30~40天每日雾化，第40~50天隔日雾化，第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。哮喘非给药组：清洁级环境，普通饲料。橄榄花粉提取物致敏液处理同哮喘给药组，但第60天则以生理盐水雾化吸入10min。对照组：清洁级，普通饲料，生理盐水致敏激发，于第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。
模型III：将20只小鼠实验前饲养1周后随机分为2组，每组10只。哮喘给药组：清洁级环境，普通饲料。第10天和第20天小鼠皮下生理盐水，0.25ml/10g。第30天~50天小鼠于密闭容器中以生理盐水雾化吸入30min，第30~40天每日雾化，第40~50天隔日雾化，第60天以[6]实验试剂和仪器和部分方法参考文献：王伟，高倩，唐平华.IL-17和IL-23在肥胖哮喘小鼠气道炎症中的作用及其与氧化应激的关系.当代医学.2012.5第18卷第13期
1%的X药溶液雾化吸入10min。哮喘非给药组（对照组）：清洁级环境，普通饲料。生理盐水处理同哮喘给药组，但第60天则以生理盐水雾化吸入10min。
1.1.3.2采集标本于末次激发后48h内，小鼠10%水合氯醛麻醉后称重，仰卧位固定小鼠，分离颈部组织，暴露气管，打开胸腔，分离肺脏，结扎右侧肺门后取右肺。气管插管以PBS 液缓慢反复灌洗左肺，回收率80%以上，重复灌洗3次，收集BALF 1ml置于EP管中。右肺上叶置于10%中性福尔马林液中固定，右肺下叶至于冰块上保持待用[6]。
1.1.3.3小鼠哮喘发作表现 OVA激发时，观察哮喘非给药组小鼠，应出现明显头面部瘙痒、烦躁不安、呼吸急促、弓背直立、前肢缩抬等哮喘急性发作表现；哮喘给药组小鼠应没有哮喘剂型发作的表现或表现不明显。对照组小鼠应观察记录其出现的特别反应，从而为X药的不良反应提供体外动物实验依据。实验结束前3组小鼠应均无死亡。
1.1.3.4肺组织匀浆IL-23含量测定取右下肺组织研磨后匀浆离心取上清液0.1ml，用ELISA法测定IL-23的含量。
1.1.3.5病理检查右肺上叶于福尔马林固定液中固定48h后进行石蜡包埋切片，所得石蜡切片进行HE染色。观察组织形态、气道上皮损伤情况，气管及血管周围炎性细胞浸润情况。
1.1.3.6 RT-PCR检测肺组织中IL-23mRNA表达提取肺组织总mRNA进行RT-PCR反应，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统分别测定各扩增条带的吸光度值。将目的条带与内参GAPDH 带的比值作为其mRNA 水平的指标。
1.1.3.7免疫组化法检测肺组织中IL-23表达（方法略）最后检测标准为：在高倍视野下，细胞胞浆和( 或) 细胞膜呈棕黄色着染为阳性细胞，计数10个视野下阳性细胞数，取平均值作为测定结果。
（注明：模型I和II小鼠模型建立采用不同的致敏原，模型III为自发性动物模型，上述实验现象观察、病理组织观察和其他检验指标对三种模型的小鼠均进行，因此具体方法仅在此统一叙述。）
1.1.4结果分别观察三种动物模型中各组小鼠给药后的行为变化与给X药的关系；观察病理组织切片，对比各组小鼠的肺部组织形态及损伤情况等，并且采用定性分级指标加以描述，从而分X药的效果；利用统计学原理，分析IL-23的含量、IL-23mRNA和肺组织中IL-23的表达情况，得出X药竞争性结合作用的特异性大小等药效学结论。
1.2 药效学实验中的量效关系
1.2.1实验动物及试剂： 2~3周龄的雌性昆明小鼠50只，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。试剂为10个梯度浓度的X药喷雾剂，生理盐水，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)（模型I），橄榄花粉提取物溶液（模型II），模型III为自发性哮喘小鼠，指标同上。
1.2.2实验方法：将50只小鼠（已致敏或为自发性哮喘小鼠）随机分配10组，每组5只小鼠，于密闭容器中依浓度梯度依次雾化吸入10min，后观察记录每组小鼠的哮喘缓解情况以及死亡数，将数据输入软件中计算出LD50和ED50，从而反应出有效剂量范围和安全指数等指标。
1.3 给药途径实验
1.3.1实验动物及试剂： 2~3周龄的雌性昆明小鼠40只，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。试剂为治疗剂量浓度的X药液，生理盐水，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)（模型I），橄榄花粉提取物溶液（模型II），模型III为自发性哮喘小鼠，指标同上。
1.3.2实验方法：将40只小鼠（已致敏或为自发性哮喘小鼠）随机分配4组，每组10只小鼠，每组又分别设立给药组5只和对照组5只。分别采用气雾吸入、灌胃法（口服）、皮下注射和腹腔注射4种给药方式，给药组给治疗剂量的X药，而对照组给等剂量的生理盐水，后观察记录每组小鼠的哮喘缓解快慢或有无缓解，从而给出最佳给药途径。
2.一般药理学研究
一般药理学研究是指新药主要药效作用以外广泛药理作用的研究，尤其是对心血管系统、呼吸系统和神经系统(我国新药注册管理办法规定重点观察这三个系统）的影响，为临床提供更多的信息[7]。
本新药作用于呼吸系统，其基本机制是特异性竞争性地抑制IL-23和其受体结合，作用水平为分子细胞水平。对呼吸系统的不良反应主要在呼吸抑制等方面，在离体实验中应得以观察和记录；另外，可能改善心血管系统，不良反应可能会有心悸、心律失常、血压变化等；神经系统应关注其中枢抑制和神经毒性反应；另外IL-23为免疫因子，其免疫效应分布于全身，因而在特异性阻断肺部IL-23R时也应考虑X药引起的其他组织细胞的效应和对其
他免疫因子的作用，这是需要长期的实验验证，以避免严重的免疫反应。
3.药代动力学研究
了解药物在体内的吸收、分布、转化和排泄。对药效学评的作用：提供药物浓度(血或组织)或药动学参数和药效相互关系的资料，为合理用药提供依据。并使给药方案个体化；寻找药效反应种属性差异在药动学方面的原因；提供药物分布与药效关系的资料；解释不同给药途径时剂量与药效的关系[7]。
X药为呼吸系统的免疫抑制药，应在药物临床前实验中充分考虑其与呼吸道中物质的相互关系，并完善其在体内转化和排泄过程，X药特异性应很高，不会和其他受体结合而发挥作用，但因其本身结构导致的血药浓度、半衰期与和其他物质（如该药的抑制酶）结合情况应在药代动力学实验中阐明。
4.作用机制研究
X药选择以肺组织细胞中IL-23R为作用靶点，特异性竞争性地抑制IL-23和其受体结合，减少其表达蛋白产物的生成，从而缓解支气管哮喘。本机制应该从大量的文献数据中得以证实，并且在药物筛选和药效学阶段得以应用和证实（前已叙述）。
5. 新药的临床前毒理学评价
5.1毒理学评价是新药安全性评价的主要内容和手段，必须在符合国家规定的机构进行。毒理学评价的总要求一般有：
（1）找出毒性剂量：测出急性毒性的LD50和连续长期给药产生毒性的剂量。
（2）确定安全剂量范围：单次或多次给药在多大范围内不仅有效而且不产生毒副反应，越大越好。
（3）发现毒性反应：通过动物的毒性反应症状为临床用药的安全性监护提供依据。
（4）毒性靶器官的寻找
（5）毒性的可逆与否：一般来讲，可逆件毒性反应不影响新药审批，不可逆性损伤，一般不批准上临床。
(6) 解救措施：如对心脏和呼吸系统的毒性，必须有相应解救措施[7]。
5.2急性毒性实验
5.2.1急性毒性实验是指动物一日内单次或多次给药后在7天或14天连续观察动物所产生的毒性反应及死亡情况。
5.2.1.1实验动物和试剂: 2~3周龄的雌性昆明小鼠50只，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。试剂为10个梯度浓度的X药喷雾剂，生理盐水，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)（模型I），橄榄花粉提取物溶液（模型II），模型III为自发性哮喘小鼠，指标同上。
5.2.1.2实验方法：将50只小鼠（已致敏或为自发性哮喘小鼠）随机分配10组，每组5只小鼠，于一日内多次给药（每次雾化吸入10min）后，分别在15天内连续观察记录小鼠的毒性反应以及死亡情况，并解剖中毒小鼠，观察中毒小鼠的毒件靶器官、损伤性质以及可逆程度（定性观察）；观察药物毒性反应与计量关系，主要侧重LD50(小动物)（同前述药效学研究）。
5.2.2长期毒性实验指反复多次给药于动物，观察药物对动物的毒性反应，一般是指连续给药14天以上。
5.2.2.1实验动物和试剂： 2~3周龄的雌性昆明小鼠30只，清洁级，体重10~15g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。试剂为3个梯度浓度的X药喷雾剂，生理盐水，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)（模型I），橄榄花粉提取物溶液（模型II），模型III为自发性哮喘小鼠，指标同上。
5.2.2.2实验方法：将30只小鼠（已致敏或为自发性哮喘小鼠）随机分配3组，每组10只小鼠，分别连续给药15天（每次雾化吸入10min），观察该药对动物的毒性反应。
5.3特殊毒性实验为防止药物发生不可逆的特殊的严重不良反应，特殊毒性实验也应该重视，从而保证药物的安全性。主要包括：致突变实验、生殖毒性实验（含一般生理毒性实验、致畸敏感期实验、围产期毒性实验）、致癌实验等。另外，也应该进行其他毒性实验，比如皮肤刺激实验、过敏性实验和溶血性实验等，对于与免疫因子有关的X药，应该重视起过敏性等免疫反应的安全性。
四、临床前其他药学研究内容
除了临床前药理学和毒理学方面的研究外，新药也应该进行其他方面的研究：原料药工艺研究、制剂处方及工艺研究、确证化学结构或组分的试验、药品质量试验、药品标准起草及说明、样品检验、辅料、稳定性试验、包装材料和容器有关试验、药剂学方面实验等[8]。
注：新药除临床前研究，也应进行临床药理实验，具体包括I期临床实验、II期临床实验、III期临床实验、IV期临床实验。（本概述重点是临床前药效学实验方案，临床研究具体要求和方案不在此赘述）
五、新药申报需提交材料
X药根据其来源(土壤微生物代谢产物)可判定为天然药物，新药申报时应按照中药、天然药物分类及申报要求（《药品注册管理办发》附件1）进行申报。具体需要提交的材料如下[2]：综述资料
1、药品名称。
2、证明性文件。
3、立题目的与依据。
4、对主要研究结果的总结及评价。
5、药品说明书样稿、起草说明及最新参考文献。
6、包装、标签设计样稿。
药学研究资料
7、药学研究资料综述。
8、药材来源及鉴定依据。
9、药材生态环境、生长特征、形态描述、栽培或培植（培育）技术、产地加工和炮制方法等。
10、药材标准草案及起草说明，并提供药品标准物质及有关资料。
11、提供植、矿物标本，植物标本应当包括花、果实、种子等。
12、生产工艺的研究资料及文献资料，辅料来源及质量标准。
13、确证化学结构或组分的试验资料及文献资料。
14、质量研究工作的试验资料及文献资料。
[8]引用自《药事管理学》人民卫生出版社第七版P133
15、药品标准草案及起草说明，并提供药品标准物质及有关资料。
16、样品检验报告书。
17、药物稳定性研究的试验资料及文献资料。
18、直接接触药品的包装材料和容器的选择依据及质量标准。
药理毒理研究资料
19、药理毒理研究资料综述。
20、主要药效学试验资料及文献资料。
21、一般药理研究的试验资料及文献资料。
22、急性毒性试验资料及文献资料。
23、长期毒性试验资料及文献资料。
24、过敏性（局部、全身和光敏毒性）、溶血性和局部（血管、皮肤、粘膜、肌肉等）刺激性、依赖性等主要与局部、全身给药相关的特殊安全性试验资料和文献资料。
25、致突变试验资料及文献资料。
26、生殖毒性试验资料及文献资料。
27、致癌试验资料及文献资料。
28、动物药代动力学试验资料及文献资料。
临床试验资料
29、临床试验资料综述。
30、临床试验计划与方案。
31、临床研究者手册。
32、知情同意书样稿、伦理委员会批准件。
33、临床试验报告。