2011CB504700-重要病毒跨种间感染与传播致病的分子机制研究

项目名称：重要病毒跨种间感染与传播致病的分子

机制研究

首席科学家：高福中国科学院微生物研究所起止年限：2011.1至2015.8

依托部门：中国科学院

二、预期目标

总体目标

本项目根据国家新发人类传染病防治上的战略需求，聚焦国际上病毒病研究的前沿，立足于我国重要病毒性传染病发生与流行的现状，选择新型冠状病毒、乙脑病毒、登革病毒、狂犬病毒和流感病毒等对我国具有严重危害或潜在危害的代表性病毒为主要研究对象，运用病毒学、分子生物学、细胞生物学和结构生物学等现代生命科学技术手段，揭示重要病毒尤其是新型病毒在动物宿主中的生态分布特征；解析病毒基因变异和进化规律，阐明病毒跨种间感染与致病的分子基础，在病毒跨种间传播研究基础理论方面有突破，进一步推动我国在该领域的研究达到国际先进水平，为我国新发传染病的防治提供科学支撑。通过该项目的实施，将不仅培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干，形成具有国际竞争力的团队，而且将建立分子病毒学、分子免疫学和病毒生态学研究等科研基地，为我国新发人传染病的预防与控制水平的持续提升奠定稳固的科学基础。

五年预期目标

１．建立自然贮存宿主重要病毒病原生态学研究平台从野生动物中分离新型冠状病毒、尼帕或类似副粘病毒、汉坦病毒、流感病毒；弄清楚SARS病毒直接动物溯源和生态传播链；阐明我国境内蝙蝠体内感染和携带的几种已知人类重要病毒的种类、分布和病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理，揭示乙脑病毒在不同动物宿主之间的传播机制与传播关系；明确高致病性禽流感病毒主要疫源地（青海湖流域、洞庭湖）生态的分布、储存方式、生存及消长规律，以及流感病毒在家禽和哺乳动物的生态分布，建立自然宿主动物病毒资源库。

２．阐明重要病毒分子变异和进化的规律以及生物学特性通过对新型冠状病毒、乙脑病毒、尼帕或类似副粘病毒、流感病毒等进行病毒的全基因组序列测定，揭示功能基因组的遗传变异特征；通过基因组信息学特征分析，揭示病毒基因组进化规律。确定登革病毒在蚊子细胞中复制所必须的5’UTR和3’UTR顺势作用元件，鉴定出在登革病毒复制过程中起重要作用的种属特异顺势作用元件和细胞因子。阐明重要病毒尤其是新型病毒的生物学特性，包括病毒的致病性、传播性和感染性，揭示病毒基因变异对病毒致病性与传播性的影响等，奠定病毒种间传播研究的分子基础。

3、揭示跨种间传播中病毒配体与受体的作用机制用现代分子生物学技术和反向遗传操作

技术构建系列假病毒及嵌合病毒，结合蛋白质生物大分子相互作用研究，阐明病毒配体与不同物种宿主细胞受体的相互作用机制，病毒侵入宿主细胞过程的囊膜蛋白－受体结合与融合机制；揭示部分新型冠状病毒的受体类型及性质，奠定型冠状病毒跨物种感染研究的基础；通过体外真核表达病毒识别宿主细胞受体蛋白，弄清基因重要结构位点的改变，对其受体结合功能和侵入细胞功能的影响，以及与病毒高致病力的关系；应用细胞转染等现代技术，在不操作活病毒的基础上，找寻黄病毒受体。

4、解析重要病毒在不同宿主细胞中的复制机制利用现代生命组学等技术解析新型冠状病毒、乙型脑炎病毒等基因组复制、转录、表达以及组装的机理，弄清病毒蛋白在不同宿主细胞复制过程中的作用基础；解析病毒在不同宿主细胞复制过程中病毒及宿主细胞MicroRNA 表达谱改变，以及MicroRNA表达谱对不同病毒复制转录的影响与结构基础，探讨病毒感染的种属与组织嗜性及复制的共性与特性；鉴定出和登革热病毒的蚊子细胞蛋白因子，确定它们在病毒RNA复制过程中的作用。解析流感病毒聚合酶基因突变、插入、缺失等对病毒复制和致病性的影响。

５、揭示宿主限制性因子在病毒跨种间传播中的作用机制筛选鉴定出与流感病毒、汉坦病毒、狂犬病毒和逆转录病毒蛋白互作的宿主细胞限制性因子；通过研究不同种属的宿主限制性因子对病毒感染性的影响，阐明宿主限制性因子在病毒感染、致病及跨种属感染中的分子机制。并通过研究病毒蛋白与宿主细胞内蛋白的相互作用，筛选与病毒相关蛋白发生相互作用的细胞内靶蛋白，探讨相关新蛋白与靶蛋白之间的相互作用对病毒机能的影响，并为将来研制小分子药物奠定理论基础。

6、建立新型病毒感染动物模型建立不同生理和免疫状态下流感病毒或新型冠状病毒等病毒感染动物模型，揭示实验动物病毒感染、复制、传播能力、机体免疫应答水平变化、机体病变和进程等，结合感染前生理和免疫状态的本底情况，揭示免疫应答水平的不同与病毒致病能力的关系，解析不同免疫状态导致病毒不同致病能力的分子作用机制。建立人MHC转基因小鼠感染模型；揭示CD8+T和CD4+T淋巴细胞比例及分布规律、细胞因子释放情况等免疫反应变化规律，阐明MHC限制性在病毒跨种间传播中的作用；建立新型病毒体内分布实时监测小鼠模型。

7、人才培养与基地建设培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干，形成具有国际竞争力的团队，造就一支跨学科、跨领域、精诚合作、团结奋进的科研队伍，而且将建立分子病毒学、分子免疫学和病毒生态学研究等科研基地，在新型病毒生态学、病毒生理与病理学、病毒结构学、病毒基因组学等研究领域取得重大突破，发表百篇以上具有国

际前沿水平的科研论文，为我国重要传染病的防治提供理论和科学支撑。

三、研究方案

学术思路:

本项目立足于我国重要病毒传染病产生与跨种间传播的现状与国家在传染病防控方面的重大需求，综合现代病毒生态学、分子病毒学、分子生物学、生物信息学、细胞生物学和生物化学等，以解析病毒跨种间传播机理为目标，以新型冠状病毒、黄病毒、狂犬病毒、流感病毒等为重点研究对象，利用学科交叉，发挥多学科优势，从病毒的生态分布、遗传变异与进化、病毒与宿主细胞相互作用等层面揭示重要病毒跨种间传播与致病的分子机制（见图1）。通过本项目实施，造就一支在病毒跨种间传播研究领域具有国际竞争力的优秀团队，在新发传染病发生机制研究方面取得重大突破，为国家应对突发公共卫生事件、构筑公共安全体系、保障人民健康提供理论依据和技术支撑。

技术路线：

详见流程图（图1）。本研究将系统地研究新型冠状病毒、乙脑病毒、狂犬病毒、流感病毒等重要病毒的生态分布、变异进化规律、病毒与受体的识别、病毒在细胞内的复制机制、宿主限制性因子对病毒复制的影响等，围绕病毒跨种间感染传播与致病的分子机制开展研究工作。

四、年度计划

一、研究内容

1、重要病毒在自然宿主中的生态分布

在前期对我国不同地域、不同时间、不同宿主动物病毒如新型冠状病毒、乙脑病毒和汉坦病毒研究的调查研究基础上，进一步扩大地域与宿主调查，确定我国境内蝙蝠体内感染和携带的几种已知人类重要病毒的种类、分布和病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理，研究乙脑病毒在不同动物宿主之间的传播机制与传播关系；研究生态环境因素对病毒感染宿主范围的影响；评价新型病毒对人与动物的潜在危害；调查流感病毒在野禽、家禽和哺乳动物的生态分布，研究侯鸟迁徙与疫病流行的关系，为疫病防控政策的制定提供理论依据；建立病毒在自然宿主的生态分布数据库，奠定重要病毒跨种间传播研究与分析的物质基础。

２．重要病毒分子变异、进化规律及其生物学特性

在对重要病毒进行生态学和流行病学调查研究的基础上，以新型冠状病毒、乙脑病毒、狂犬病毒、流感病毒等重要病毒为研究对象，进行病毒的全基因组序列测定研究，研究功能基因组的变异和进化特征；同时研究重要病毒尤其是新型病毒的生物学特性，包括病毒的致病性、传播性和感染性，研究病毒基因变异对病毒种间传播作用的影响等。由于近年来的研究发现病毒非结构蛋白和病毒非编码区在致病性和传播性也起到非常重要的作用，因而在全基因组序列研究中，要注重研究病毒非编码区变异和进化特征，观察病毒非编码区变异对病毒生物学特性的影响。

3、病毒跨种间传播中病毒与受体的相互作用

以乙型脑炎、流感病毒等为突破口，研究病毒与受体的亲和特性以及细胞受体和配体的相互作用机制；用现代分子生物学技术和反向遗传操作技术构建系列假病毒及嵌合病毒。结合蛋白质生物大分子相互作用研究，研究病毒与不同物种宿主细胞的相互作用；同时利用昆虫细胞表达病毒表面蛋白及各种突变体蛋白，从结构层面研究受体与配体的作用，以此为基础，用物理方法（SPR）和生物学检测手段研究病毒表面蛋白的突变对受体结合能力的影响。并利用反向遗传学技术包装病毒，在细胞及动物水平评价病毒的变异对宿主嗜性及致病力的影响，以此揭示病毒跨种间的传播机制。

4、重要病毒在不同宿主中的复制机制

以新型人冠状病毒、登革热病毒和流感病毒为突破口，利用反向遗传学平台，采用分子生物学、细胞生物学等各种手段，研究病毒蛋白在不同宿主细胞复制过程中调控、变异、重

组、嗜性的作用基础，研究病毒在不同宿主细胞复制过程中病毒及宿主细胞MicroRNA表达谱改变，以及MicroRNA表达谱对不同病毒复制转录的影响与结构基础，探讨病毒感染的种属与组织嗜性及复制的共性与特性；研究登革热病毒在蚊细胞系中复制的顺式作用元件，确定它们在病毒RNA复制过程中的作用。

5、宿主限制性因子在病毒跨物种传播中的作用

运用酵母双杂交和病毒学研究技术，探索宿主限制性因子在流感病毒复制过程中的调控机制；比较不同种属的宿主限制性因子对流感病毒感染、致病影响的差异，研究分析宿主限制性因子在流感病毒感染、致病及跨种属感染中的作用及分子机制。筛选与汉坦病毒、狂犬病病毒重要蛋白相互作用的宿主细胞因子，追踪宿主限制性因子与病毒核蛋白相互作用后对病毒复制、装配及成熟释放的影响和生物学意义，分析病毒感染细胞后包涵体形成的分子机制及免疫病理意义，探讨不同种属宿主细胞限制性因子对病毒感染及致病的分子基础和调控机制。

6、新型病毒跨物种感染的动物模型

以不同年龄的小鼠（成年鼠和老年鼠）为实验对象，明确生理和免疫基础水平的差异，选择流感病毒或新型冠状病毒等对小鼠进行感染，建立不同生理和免疫状态动物感染模型；研究病毒感染、复制、传播能力、机体免疫应答水平变化、机体病变和进程等，结合感染前生理和免疫状态的本底情况，分析生理和免疫状态、免疫应答水平的不同与病毒致病能力的关系，阐述不同免疫状态导致病毒不同致病能力的分子作用机制。建立人MHC转基因小鼠感染模型。动态检测CD8+T和CD4+T淋巴细胞比例及分布规律、细胞因子释放情况等免疫反应变化规律，分析MHC限制性在病毒跨种传播中的作用。