2012色谱技术实验讲义

实验一中药提取液HPLC梯度洗脱条件的优化

一、目的

1．掌握高效液相色谱分析中，梯度洗脱条件的决定因素。

2．熟悉HPLC梯度洗脱条件优化的思路。

二、提要

对于成分复杂的中药提取液，测定其HPLC指纹图谱一般采用梯度洗脱的方法。而梯度洗脱条件主要受梯度范围（梯度起始浓度和终止浓度）、梯度斜度及强溶剂种类的影响。其中梯度范围和梯度斜度决定流动相的洗脱强度，可以通过调整梯度范围和梯度斜度，使样品组分的k’值符合1＜k’＜20范围；而强溶剂的种类决定流动相的选择性。本实验主要考察不同洗脱系统的溶剂强度对于梯度分离条件的影响。

三、实验条件

1．高效液相色谱仪；

2．ODS柱（C18, 4.6mm×150mm, 5µm或4.6mm×250mm, 5µm）；

3．流动相：乙腈－水；流速：1ml/min。

4．检测器：DAD检测器，检测波长254nm。

5．样品：大黄70%甲醇超声提取液

6.进样量：20 μL

7. 柱温：35 ℃。

四、操作步骤

1．以乙腈—水（5:95），90min至乙腈（100%），保持10min，观察样品分离效果。

2．根据分离结果，调整梯度范围和斜度，即调整乙腈的起始浓度和终止浓度，及浓度变化速率，使中药提取液各主要组分的K’分布范围在1～20之间。观察各组分的分离度。

3．分析实验结果，观察流动相起始浓度、终止浓度及浓度变化速率对各组分保留时间及分离度的影响。

五、思考题

1．梯度洗脱中，如果色谱峰集中在整个分析时间的中间段，即在洗脱的开始和结束的时间里没有组分出现，应如何调整梯度范围？

答：初始浓度高点，中间段浓度变化速率慢点，终止浓度变小。

实验二中药挥发油气相色谱分析条件的选择

一、目的

１．练习气相色谱仪的使用，了解气相色谱仪的基本结构。

２．掌握柱温的变化对组分保留时间及分离度的影响。

３．掌握程序升温对复杂样品分离度及分析时间的影响。

二、提要

对于宽沸程的样品分析，采用程序升温（单阶程序升温、多阶程序升温），在分析过程中柱温随时间而变化，通常是升高柱温。它的优点是减少分析时间。程序升温条件选择是确定初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间。

三、仪器与试剂

（1）气相色谱仪（FID检测器）；

（2）微量注射器（1µl）；

（3）样品：中药挥发油-当归挥发油

四、操作步骤

１．设置实验条件：色谱柱：甲基苯基交联硅烷柱(30m×0.32mm, 0.52μm)；检测室300℃，气化室250℃；载气流量：N2 1.0ml/min；分流比80 : 1。

程序升温条件（初始试验条件）：初始温度50℃，以3℃/min 升至110℃（保持3 min）；以2℃/min 升至200℃（保持5 min）；再以8℃/min 升至240℃（保持5 min）。

2．根据试验结果，调整初始温度、终止温度以及升温速率，可根据需要设置阶梯形程序升温分离。

五、思考题

程序升温的初始温度、终止温度及升温速率的对分离度会有什么影响？

实验三液相色谱-质谱分析（HPLC-MS）

一、目的

1．练习液相色谱-质谱仪的操作，熟悉液质工作站的使用。

2．掌握HPLC-MS常用的离子源和质量分析器的类型及应用。

二、提要

液质联用技术发挥了色谱分离的长处和质谱能进行定性结构分析的优势，可用于不挥发性、极性和热不稳定性化合物的测定，还可以对大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定。

根据化合物的性质，选择离子源：分子量、极性、挥发性、热稳定性等。样品分子极性强（如有机酸碱），建议采用ESI电离方式。化合物极性低，可采用APCI电离方式（如甾体化合物）。

离子监测模式有正离子模式和负离子模式，有机酸及含有较多强电负性基团的物质，用负离子模式电离，可以观察到不同的分子离子；有机碱（如生物碱），采用正离子模式电离，用甲酸或乙酸酸化，可能会观察到不同的分子离子

三、试剂与仪器

（1）液相色谱-质谱仪（离子阱检测器）；

（2）质谱工作站；

（3）样品溶液：黑附子水提液

四、操作步骤

1．实验条件：

色谱参数：进样口250℃，分流进样，分流比30:1，色谱柱：甲基苯基硅烷柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气流量：1.2ml/min（He），接口温度280℃，柱温：60℃，保持1min，15℃/min，升到200℃，保持1min。

质谱参数：溶剂延迟1min，SCAN：30-400质量数，SIM：自选参数

进样量：0.1 µl

2. 仪器稳定后作自动调谐；

3. 调谐完成后，分别用SCAN及SIM采集样品的色谱图，通过气质工作站检索各色谱峰可能的结构，讨论、比较两种方法的差异及特点。

五、注意事项：

1.流动相中不能含有非挥发性盐类（如磷酸缓冲盐和离子对试剂）

实验四混合染料T L C分离条件的三角形优化

一、目的

1．掌握溶剂极性参数与展开剂洗脱强度之间的关系；

2．掌握溶剂的三角形分组对展开剂选择性的影响；

3．熟悉三角形优化法在TLC分离条件选择中的应用。

二、提要

溶剂与溶质分子之间主要考虑其偶极作用力和氢键作用力，按它们的大小，即给出质子的能力、接受质子的能力、偶极矩的大小，把常用的溶剂分为8类。处于同一组的溶剂，在色谱分离中具有相似的选择性；在分组三角形中相差较远的组中的溶剂，其选择性相差较大。为改善选择性，要根据组分的性质，选择合适的溶剂；而利用多元溶剂，既可调节K值，又可调节选择性。用统计方法可以帮助确定溶剂强度及选择性的多组分样品的分离条件，例如Glajch三角形优化法。

图4-1 溶剂选择性分类图

表4-1 溶剂选择性分类表

组别溶剂名称

I 脂肪族醚、三烷基胺

II 脂肪醇

III 吡啶衍生物、THF、酰胺（除甲酰胺外）、乙二醇醚、亚砜