一种测定MDR肿瘤细胞内外阿霉素浓度的方法
盐酸阿霉素及其制剂的荧光分析
盐酸阿霉素及其制剂的荧光分析李妮妮;南叶飞;张洵立;唐璇【摘要】建立了盐酸阿霉素的直接荧光分析方法,浓度在9.90×10-8～1.97×10-5 mol/L,荧光强度和浓度呈良好的线性关系,相关系数0.994 5,检测限4.37×10-11 mol/L,回收率98.99％,避光下保存稳定性良好.方法灵敏度高,检测限低,适合用于盐酸阿霉素的分析.【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2015(044)001【总页数】3页(P178-180)【关键词】盐酸阿霉素;盐酸阿霉素注射剂;荧光分光光度法【作者】李妮妮;南叶飞;张洵立;唐璇【作者单位】西安石油大学化学与化工学院,陕西西安710065;西安石油大学化学与化工学院,陕西西安710065;西安石油大学化学与化工学院,陕西西安710065;西安石油大学化学与化工学院,陕西西安710065【正文语种】中文【中图分类】TQ016阿霉素(ADM)是一种抗癌抗生素，其结构中含有糖苷和蒽环，广泛用于治疗肿瘤疾病。
临床研究表明，它对白血病、骨肉瘤、乳腺癌及小细胞肺癌具有很好的疗效［1-3］。
在这些相关研究和药物质量控制工作中，阿霉素检测方法有高效液相色谱法、放射免疫法等［4-5］，操作步骤复杂、价格昂贵。
本文利用ADM 本身有天然荧光，采用荧光分光光度计建立直接荧光分析方法，检测盐酸阿霉素原料药及其注射制剂的含量。
1 实验部分1.1 试剂与仪器盐酸阿霉素原料药(＞99.5%)，工业品;注射用盐酸阿霉素;去离子水。
F97 荧光分光光度计;BSA224S 型分析天平。
1.2 溶液配制盐酸阿霉素80.0 mg，用蒸馏水溶解至100 mL容量瓶中，作为盐酸阿霉素储备液，其浓度为2.76×10－3 mol/L。
1.3 实验方法取盐酸阿霉素储备液，加水稀释，配制不同浓度的溶液，用荧光分光光度计测定阿霉素的荧光激发波长和荧光发射波长。
免疫组化的在病理中的临床意义
13、意义：标记物--作用--阳性部位--临床意义耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。
性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。
蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。
阳性率高者对VP16尤其有效。
预后越好。
预后越好。
C-erbB-2--癌基因产物--胞浆--阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。
ER、PE阳性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效果不好。
Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。
PCNA(增埴细胞核抗原)。
P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。
野生型半衰期很短于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。
几乎所有的研究都表明，nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率相对较低，存活期相对较长。
胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。
判断的指标之一。
CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。
阳性反应弱阳性或阴性。
乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。
道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。
Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。
乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。
因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不可能为乳腺来源。
其他villin免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。
间皮瘤也经常为villin阴性表达，因此在一些情况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌使用抗体的一种。
汉防己甲素注射液在肿瘤、矽肺、肝炎等临床治疗中使用指南
汉防己甲素注射液说明汉防己甲素是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基喹啉类生物碱，是一种天然非选择性钙通道阻滞剂，主要作用于钙离子通道，影响钙离子的跨膜转运以及在细胞内的分布利用。
研究发现汉防己甲素具有降血压、消炎、镇痛、抗纤维化、抗癌和逆转耐药等多种药理作用，临床上用于治疗肿瘤、矽肺、关节炎、高血压等疾病。
此外，汉防己甲素在保护肝细胞、抗肝纤维化、降低门静脉高压及防治门脉高压等方面具有良好治疗效果。
【成份】本品主要成份为汉防己甲素，为防己科植物粉防己（石蟾蜍）Stcphania Tctrandra Smoorc 的根中提取得到的一种生物碱。
【药理毒理】1.药理抗肿瘤药及镇痛药。
本品能提高实验动物的痛阀，具有明显的镇痛作用。
本品可使大鼠甲醛性足肿胀和关节肿胀有抑制作用。
可使大鼠急性炎症血管通透性降低，减少嗜中性白细胞游出。
其机理与抑制炎症前列腺素E的合成或释放有关。
本品可使大鼠实验性硅肺模型肺内苏丹IV及PAS阳性物明显减少和消失，肺泡间隔蛋白多糖荧光强度减弱，矽结节中心填充物减少。
本品还能通过抑制肿瘤耐药细胞表面P-糖蛋白的过度表达功能，增加化疗药物在肿瘤细胞内的积聚，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
2.毒理本品最小致死量：蟾蜍前淋巴囊注射时为1000mg/㎏～1200 mg/㎏；小鼠腹腔注射时为700mg/㎏～800 mg/㎏；家兔注射时为40mg/㎏～42 mg/㎏。
汉防己甲素可引起小鼠精子畸形率及微核率增高，对姐妹染色单体交换频率影响不大。
【抗肿瘤的临床研究】1、直接抗肿瘤作用田晖等采用MTT法测得汉防己甲素对人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／Adr和人口腔上皮癌耐长春新碱株KBv200及其敏感株均有程度不等的细胞毒作用，对耐药株的IC50较对应的敏感株IC50分别高2．4和1．9倍。
何琪扬等采用合盼兰计数法发现汉防己甲素对敏感急性白血病细胞株HL-60和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用，对抗性细胞的抑制作用强于敏感HL-60，表明抗药性细胞对汉防己甲素没有交叉抗性。
原发性肝癌MDR耐药性逆转的研究进展
的单抗 Ｌ Ｐ一 ６ 抗 ＭＲ Ｒ ５， Ｐ的单抗 ＭＲ ｍｌ ＭＲ ｒ Ｐ 、 Ｐｌ等均 可用
于 ＭＤ 的逆 转 。 Ｒ
免疫靶导向用免疫毫微 粒能包裹 和缓 释药物 ， 在细胞 内 药物释放而 逆转 ＭＤ Ｒ。有 研究 应用 免 疫毫 微 粒包 裹 阿霉
播性和可 遗传 性 的分 子 生物 学 特征 ６。 自从 ２０ １ ］ ０ １年 Ｅ． １ ｂｓｉ等首次报道 ｓ Ｎ ｓ ａｈｒ ｉ Ａ 在哺乳动 物体外培养 细胞 内成功 Ｒ
泵 至细胞外 ， 使细胞内化疗 药物达不 到有效作用浓度而产 生
耐药性 。实验测定发 现 ， Ｒ肝癌 组织及 其细 胞 ＭＤ 扩 ＭＤ Ｒ１
增 明显 ， Ｒ Ａ和 Ｐｇ ｍＮ — Ｐ表达增 高 。表 达量 与耐药 性呈 正相
关 ， ＭＤ １阳性患者 ， 且 Ｒ 术后局部化疗差 ， 阴性 者药 物疗效 明 显 。 目前 认 为 肝 癌 多 药 耐 药 最 主要 原 因 是 Ｐｇ —ｐ的过 表 达 … 。２ 多药 耐药 相 关蛋 白（ ｈｄｕ ｅｉａｃ—ｓｏｉｅ ． Ｍｕ ｉｒｇｒｓｔｎｅａｓ ａ ｄ ｓ ｃｔ ｐｏｅ ， Ｐ 与 肺 耐 药 相关 蛋 白 （ ｕ ｇｒｓ ｔ ｃ ｒｔｉ ＭＲ ） ｎ Ｌ ｎ ｅｉａ ｅ—ｒ ａ ｄ ｓｎ ｅ ｔ ｌｅ ｐｏ ｉ，Ｒ ） 达增强 。３ 谷胱 甘 肽及 谷胱 甘肽一． ｒｅ Ｌ Ｐ 表 ｔｎ ． Ｓ转移 酶
MTT法体外测定胃癌化疗药物敏感性
文章编号:1005-6947(2003)01-0047-03·简要论著·M T T法体外测定胃癌化疗药物敏感性陈亚军1,叶古祥1,孙国娣2(上海市杨浦区中心医院普外科,上海200090) 摘要:采用MTT法测定89例胃癌细胞对10种化疗药物的体外敏感性,并运用免疫组化法检测30例肿瘤细胞的多药耐药基因(MDR1)。
结果显示89例胃癌细胞对化疗药物的敏感性依次为52FU>MMC>ADM>HCPT>CBP>CDDP>MXT>MTX>Ara2C>VP16。
30例患者中15例MDR1阳性。
笔者认为以MTT法检测胃癌细胞对化疗的敏感性有助于指导临床选用肿瘤敏感性化疗药物,并可避免盲目选用肿瘤非敏感性化疗药对机体造成的毒性反应。
在检测肿瘤对化疗药物敏感性的同时,应检测多药耐药基因,及时发现耐药病人,以便采用其他有效的治疗方法。
关键词:胃肿瘤/药物疗法;药物筛选试验,抗肿瘤;MTT法,肿瘤多药耐药基因中图分类号:R735.2;R965.1 文献标识码:B 大多数胃癌患者术后需要化疗,有效的化疗药物与化疗方案有助于提高胃癌的总体疗效,因此建立体外抗癌药物敏感性试验来筛选化疗药物,一直是临床化疗中备受瞩目的问题。
Mosman(1983)建立的噻唑兰(MTT)显色法优于其他体外化疗药物敏感性试验。
本研究用MTT法检测胃癌对体外化疗药物的敏感性,并探讨与肿瘤多药耐药基因(MDR1)之间的关系,为临床选择化疗药物提供参考。
1 材料与方法1.1 临床资料本组89例,男54例,女35例。
年龄平均为(58.3±12.8)岁。
均病理证实为胃癌,其中腺癌52例,低分化腺癌26例,黏液细胞癌6例,印戒细胞癌5例。
采用免疫组化二步法———优选即用型一抗加EnVision(DA KO公司提供的EnVision抗体)检测MDR1。
1.2 胃癌细胞制备术中切取胃癌部分肿瘤组织于无菌条件下快速送实验室。
肿瘤的多药耐药及其逆转剂研究进展
综述肿瘤的多药耐药及其逆转剂研究进展安徽省肿瘤医院桂留中化疗仍是恶性肿瘤的重要治疗手段之一，然而肿瘤细胞的耐药常使化疗最终失败。
根据肿瘤细胞的耐药特点，耐药可分为原药耐药（Primary drug resistance,PDR）和多药耐药（Multidrug resistance ,MDR）。
PDR只对诱导药物产生耐药而对其他药物不产生交叉耐药性，如抗代谢药类；MDR 则是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生抗药性的同时，对其他结构和作用机制不同的抗肿瘤药产生交叉耐药性。
MDR的表现十分复杂，既可有原发性（天然性）耐药，也可有诱导性（获得性）耐药；还有典型性和非典型性耐药之分。
由于MDR给化疗带来了困难，近年人们对其产生的机制以及试图寻找逆转剂做了大量的工作。
本文简介MDR产生的机制并着重介绍近年逆转剂的研究进展。
1.MDR产生的机制1.1膜糖蛋白介导的机制1.1.1 P-gp与MDR 1976年Ling等首先在抗秋水仙碱的中国仓鼠卵巢细胞株上发现了一种能调节细胞膜通透性的糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）,因其相对分子量为170kd，又称P-170。
[1]。
P-gp主要分布在有分泌功能的上皮细胞的细胞膜中，在人类正常组织中有不同程度的表达，其中肾上腺、肺脏、胃肠、胰腺等组织中表达较高，而在骨髓中表达较低。
P-gp属于ATP结合盒家族的转运因子，其生理功能为在ATP供能下将细胞内的毒性产物泵出细胞，对组织细胞起保护作用。
P-gp由mdr1基因编码产生。
人类mdr1基因位于7号染色体长臂2区一带一亚带（7q21.1）。
1986年，Gros将编码P-gp的mdr1cDNA直接转染敏感细胞后，转染细胞表现出完全的MDR表型，从而提供了P-gp能够导致多药耐药的有力证据。
现已证明，许多肿瘤原发性或获得性耐药均与P-gp过量表达有关。
P-gp随mdr1基因扩增而增加。
P-gp有多个药物结合位点，因而具有多种药物泵出功能，不过其底物多为天然性抗癌药如长春碱类、蒽环类、紫杉醇类和鬼臼毒素类等。
第二章-药物转运及转运体教学文稿
➢ 因此，ABCC2在药物的吸收、分布和排泄过程中起着非常重要的作用。
ABCC2与多药耐药
1. ABCC2能将多种化疗药物从细胞内泵出细胞以降低细胞内药物浓度和减轻细胞毒 作用，进而可使机体对肿瘤药物产生耐药。
[A-] = [HA]
当pH = pKa时，
[HA] = [A-]
pKa 即弱酸性或弱碱性药物在50% 解离时的溶液pH值。
例：丙磺舒的pKa=3.4
胃液pH=1.4
10pH-pKa=
[离子型] [非离子型]
101.4-3.4=
[离子型] [非离子型]
1 100
[离子型]
= [非离子型]
血液pH=7.4 [离子型]
1. Dubin-Johnson综合征又称为慢性特发性黄疸，为遗传性结合胆红 素增高Ⅰ型
2. Dubin-Johnson综合征，由于MRP2基因突变致使结合胆红素从肝 细胞向毛细胆管的运转发生障碍，结果使结合胆红素反流入血，血 结合胆红素水平增高，病人出现黄疸。
MRP2
三、ABCG2
ABCG2，即乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），属于半转运 流出泵，主要在乳腺、胎盘和肝细胞胆管 侧表达。
10pH-pKa=
[非离子型]
107.4-3.4=
[离子型] [非离子型]
10000 1
=
[离子型]Leabharlann [非离子型]➢ 苯巴比妥（弱酸性药物）误服中毒， ➢ 碱化尿液？ ➢ 酸化尿液？
胶束增敏荧光光度法测定兔血样中阿霉素
胶束增敏荧光光度法测定兔血样中阿霉素钱帆;付玉丽;程秀梅;廖秀林;杨秀培【摘要】Doxorubicin is a kind of anthracycline antibiotics and the fluorescence of it can get enhanced in the presence of hexadecyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) in ethanol-borate buffer solution. A new fluorescent spectrophotometry based on this principle has been developed to determine doxorubicin in rabbit serum. Method development included study of the effects of buffer pH, buffer concentration, organic solvent and CTAB concentration on the fluorescence intensity of DOX. The optimum conditions were pH 6.0 17 mmol/L borate buffer, 60% v/v ethanol and 1.9 mmol/L CTAB. The fluorescence intensity was linearly related to the concentration of doxorubicin in the range of 0.5 to 120 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 2 under the optimum conditions. The detection limit (3a) is 0.161 ng/mL. The proposed method was satisfactorily applied to the determination of doxorubicin in rabbit serum. The recovery was within the range of 93.7%-105.6% (RSD<1.5%). The results showed that this method had great accuracy and sensitivity, which is widely applied in chinical test.%基于阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对蒽环类抗生素阿霉素的荧光强度有增敏作用,通过考察CTAB浓度、缓冲液pH及浓度、有机溶剂等对阿霉素荧光强度的影响,建立胶束增敏荧光光度法测定阿霉素的新方法.在体系为17 mmol/L的硼酸缓冲液(pH 6.0)且含60％(v/v)乙醇、1.9 mmol/LCTAB的条件下,阿霉素在0.5 ～ 120 ng/mL浓度范围内荧光强度呈良好的线性(r=0.9992),检出限(3σ)为0.161 ng/mL.该方法用于测定兔血样中阿霉素时,回收率在93.7％～105.6％之间,相对标准偏差小于1.5％.结果表明该方法具有较好的准确度与灵敏度,可用于临床监测.【期刊名称】《中国测试》【年(卷),期】2013(039)002【总页数】4页(P44-47)【关键词】阿霉素;十六烷基三甲基溴化铵;荧光光谱法;兔血【作者】钱帆;付玉丽;程秀梅;廖秀林;杨秀培【作者单位】西华师范大学化学化工学院,四川南充637000【正文语种】中文【中图分类】O657.31;R979.1;S829.1;R9610 引言阿霉素（DOX）是一种有效的抗癌药物，被广泛用于癌症的化疗，且已被美国药典收录[1]。
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２ＯＯ４年第６２卷 第１２期，１１６２～１１６５
化学学报
ＡＣＴＡ ＣＨＩｌＶｌＩＣＡ ＳＩＩ￣ＣＡ Ｖｏ１．６２。２ＯＯ４
Ｎｏ．１２．１１６２～１１６５
种测定ＭＤＲ肿瘤细胞内外阿霉素浓度的方法 张洪妍。 沈 朋 （ 浙江大学药学院药物信息学研究所 栾连军。 程翼宇 。
浙江大学医学院附属第一医院杭州３１００２７）
摘要研究提出Ｋ５６２／Ａ细胞内外阿霉素浓度的反相高效液相色谱一荧光测定法．细胞内阿霉素浓度测定采用Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ１８色谱柱，甲醇．０．０１％醋酸（５０：５０，Ｖ／Ｖ）流动相，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３５℃；细胞外阿霉素浓度测定采用Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃｉｓ 色谱柱，甲醇．０．０１％醋酸（５５：４５，Ｖ／ ）流动相，流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３５℃．荧光检测器波长 ＝４９５ Ｂｉｎ， ＝５６０ Ｂｉｎ， 均以盐酸柔红霉素为内标．研究结果表明，该方法简单、准确、线性范围宽、检测限低，精确度和回收率良好，可用于多药耐 药肿瘤细胞内外阿霉素浓度的动态变化规律研究． 关键词液相色谱分析，阿霉素，多药耐药肿瘤细胞，Ｋ５６２／Ａ细胞
Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｆｏｒⅣｍＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ
ＺＨＡＮＧ，Ｈｏｎｇ—Ｙａｈ。 ＳＨＥＮ，Ｐｅｎｇ ＬＵＡＮ，Ｌｉａｎ—Ｊｕｎ。 ＣＨＥＮＧ，Ｙｉ—Ｙｕ ’。 （ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ蜘 ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａ，ｃ￣ｕ ３１００２７） （ Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ， 咖Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａ，￣．ｈｏｕ ３１００２７）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ＲＰ－ＨＰＩ．Ｃ ｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｏｘｏｍｂｉｃｉｎ（Ｄｏｘ）ｉｎ Ｋ５６２／Ａ ｃｅｌｌｓ．Ｔ０ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｘ， ａ Ｌｉｅｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ１Ｒ ｃｏｌｕｍｎ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｔ ３５℃ｗａｓ ｕｓｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０１％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０：５０， Ｖ）ａｔ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ．Ａ Ｌｉｅｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｔ ３５℃ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｘ．ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ Ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０１％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５５：４５， ／ ）ａｔ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．８ ｍｌＪｍｉｎ．Ｄａｕｎｏｍｂｉｅｉｎ Ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗｅｒｅ ４９５ ＩＩＩＴＩ ａｎｄ ５６０ ＩＩＩＴＩ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．Ｉｔ ｈａｓ ｌＯＷ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｗｉｄｅ ｈｎｅａｒ ｒａｎｇｅ，ｓａｔｉｓｆｉｅｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ， ａｎｄ ｇｏｏｄ ｍｅａｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ—ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｏｘ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＨＰＩＣ，Ｄｏｘｏｍｂｉｅｉｎ，ＭＤＲ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ，Ｉ ６２／Ａ ｃｅｌｌ
化疗是当今治疗恶性肿瘤的主要手段之一，影响其疗效 的重要因素是肿瘤细胞产生多药耐药（Ｍｕｌｔｉ—ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ＭＤＲ），使细胞内抗癌药物积聚程度降低…Ｉ，导致化疗失败． 肿瘤细胞ＭＤＲ机制尚不明确，现有研究表明，Ｐ一糖蛋白具有 药泵功能，能将化疗药物（如蒽环类、生物碱等）泵出肿瘤细 胞外 ｊ．因此，可通过测定肿瘤细胞内抗癌药物浓度来研究 ＭＤＲ机制，评价逆转剂的逆转效果．Ｍａｒｂｅｕｆ－ＧｕｅｙｅＩ ｊ和 Ｅ－ｍａｒｌ：ｃｈｅｎｇｙｙ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．∞ ＲｅｃｅｉｖｅｄＤｅｃｅｍｂｅｒ２，２００３；ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ ａｃｃｅｐｔｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２６，２ＯＯ４ 浙江省中医药科研计划（Ｎｏ．２００３Ｃ０７６）资助项目． ＰｒａｅｔＮ］等已研究了化疗药物在细胞内积累过程动力学，能直 观地反映细胞内药物浓度的变化情况，但尚未研究细胞外液 中的药物浓度变化与细胞内药物浓度变化的相互关系，也没 有考虑药物传递过程中细胞的凋亡和增殖．为揭示肿瘤细胞 ＭＤＲ机制，需研究发展细胞内外抗癌药物的检测方法，观察 细胞内外药物浓度的变动情况，建立细胞内外药物传质数学 模型，以便通过研究药物浓度、细胞生理参数和环境理化参
维普资讯 http://www.cqvip.com Ｎｏ．１２ 张洪妍等：一种测定ＭＤＲ肿瘤细胞内外阿霉素浓度的方法 １１６３ 数之间的动态变化规律，寻找出逆转肿瘤细胞ＭＤＲ的有效 途径，这对于人类攻克癌症治疗难题具有重要科学价值． 阿霉素是目前临床上广泛使用的蒽环类抗癌药物．通常 采用荧光分光光度法和流式细胞仪法 ｌ６Ｊ测定肿瘤细胞内 阿霉素浓度来研究其ＭＤＲ，但因这些方法没有将内源性物 质与阿霉素进行分离，故无法消除内源性物质对测定的干 扰．此外，药物进入细胞后会分布和代谢，胞外浓度并不一定 等于初始加药浓度减去测定的胞内浓度，仅检测胞内阿霉素 浓度显然不够科学．高效液相色谱法已用于血浆、组织等生 物样品中阿霉素浓度测定ｌ７，８ｊ，但尚未见体外培养的肿瘤细 胞内外阿霉素浓度测定方法的报道． 为此，本文以Ｋ５６２／Ａ细胞（多药耐药人红白血病细胞） 为对象，研究提出肿瘤细胞内外阿霉素浓度的反相高效液 相一荧光测定法，可用于Ｋ５６２／Ａ细胞内外阿霉素浓度的动 态研究，进而用于肿瘤细胞ＭＤＲ逆转药物的筛选．
１实验部分 １．１仪器与试剂 Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪；Ｗａｔｅｒｓ ２４７５ ＭＦＤ检测器． 盐酸阿霉素（浙江海正药业股份有限公司）；注射用盐酸柔红 霉素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ Ｓ．Ｐ．Ａ，Ｉｔａｌｙ）；甲醇（色谱纯，Ｍｅｒｃｋ 公司）；双蒸水（自制）；其余试剂均为分析纯． １．２色谱条件 １．２．１细胞内阿霉素测定条件 色谱柱：汉邦Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ】８柱，４．６ ｒａｉｎｘ ２５０ ｍｍ，５／ｍａ； 流动相：甲醇 ．０１％醋酸（５０：５０， ）；流速：１．０ ｍＬ／ｒｒｆｉｎ； 柱温：３５℃；荧光检测： ＝４９５ ｎｌｎ， ＝５６０ ｎｇｎ． １．２．２细胞外阿霉素测定条件 色谱柱：汉邦Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃｌ８柱，４．６ ｉｎｉｎｘ ２５０ ｍｍ，５ ｐｍ； 流动相：甲醇 ．０１％醋酸（５５：４５， ）；流速：０．８ ｍｉｎ； 柱温：３５℃；荧光检测： ＝４９５ ｎｇｎ， ：５６０ ｇｌＩＩ１． １．３标准储备液制备 准确称取盐酸阿霉素适量，加水溶解，定容于量瓶中，配 置成浓度为２．００ ｍｇ／ｍＬ的盐酸阿霉素标准储备液，４℃下 保存． １．４样品溶液制备与测定 １．４．１样品细胞内阿霉素测定 取适量含细胞的培养液，４ＯＯＯ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ，上清液 备用，用于样品细胞外阿霉素测定．细胞用４℃的磷酸盐缓 冲溶液（ＰＢｓ）洗涤３次，弃去洗涤液．加入５０止盐酸柔红霉 素水溶液（内标，１００ －ｎＬ），混匀，再加入盐酸浓度为０．３０ ｍｏｌ／Ｌ的５０％乙醇溶液１．０ ｍＬ，振荡３ ｍｉｎ，３７℃消化１８ ｈ， １００００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，取上清液２０ 进样分析． １．４．２样品细胞外阿霉素测定 取１．４．１节得到的备用上清液，准确量取１．０ ｍＬ，加入 ５０ 盐酸柔红霉素水溶液（内标，１００￣ｅ／ｍＬ），混匀，加入 ２．０ ｍｏｌ／Ｌ三氯乙酸１００血沉淀蛋白，１００００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，加入２．０ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液８０ ，１００００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｌｌ，取上清液２０ 进样分析． ２结果与讨论 ２．１标准曲线绘制 精确量取标准储备液适量，按１．４．１节方法，制备浓度 为０．０２５，０．１，０．５，１．０，２．５，５．０，７．５和１０．０￣ｇ／ｍＬ的细 胞内液标准液；按１．４．２节方法，制备浓度为０．０２５，０．１０， ０．５，５．０，７．５，１０．０和１５．０￣ｇ／ｍＬ的细胞外液标准液．以盐 酸阿霉素浓度为横坐标（ ），盐酸阿霉素峰面积对盐酸柔红 霉素峰面积的比值为纵坐标（ｙ），进行线性回归，结果表明， 细胞内液在０．０２５～１０．０￣ｇ／ｍＬ范围内呈良好线性关系，其 标准曲线为Ｙ＝０．９３４９Ｘ一０．ｏ４９２（ｒ２＝０．９９９４）；细胞外液在 Ｏ．０２５～１５．０ ｎ１Ｌ范围内呈良好线性关系，其标准曲线为 ｌ，＝０．９８５８Ｘ一０．０８３１（ｒ２：０．９９９２）． ２．２专属性试验 取空白细胞内／外液，加入标准液的细胞内／外液以及细 胞内／外液样品溶液，分别按１．４节的方法操作并分析，结果 细胞内／外液中内源性物质不干扰阿霉素测定，表明专属性 良好，见图１，２． ２．３回收率试验 配制高、中、低三种浓度的细胞内／外液样品，按１．４节 的方法分析，计算回收率，结果细胞内液的平均回收率为 ９８．２％，细胞外液的平均回收率为９９．０％，表明回收率良好， 见表１． ２．４精密度试验 按１．４节的方法，制备浓度为０．０２５，０．２５，２．５￣ｇ／ｍＬ 的细胞内液样品和浓度为０．１，１．０，１０．０ ｇ／ｍＬ的细胞外液 样品．按日内和日间精密度的测定要求分别进行测定，计算 日内及日间精密度．结果细胞内液日内精密度的ＲＳＤ分别 为１．８６％，３．１３％，２．３６％（ｎ：６），日间精密度的ＲＳＤ分别 为３．５４％，１．７９％，２．９９％（ｎ＝６）；细胞外液日内精密度的 ＲＳＤ分别为２．２６％，２．８８％，１．２９％（ｎ＝６），同间精密度的 ＲＳＤ分别为３．４５％，２．０２％，２．３４％（ｎ＝６），表明精密度良 好． ２．５样品溶液稳定性试验 按１．４节的方法制备浓度分别为０．２５ ｇ／ＩｎＬ和１．０ ／ ｍＬ的细胞内／外液样品，在０，１，３，６，１０，１５，２１，２８，４０ ｈ 测定，结果细胞内液的ＲＳＤ＝３．７５％（ｎ：９）；细胞外液的 ＲＳＤ：１．６８％（ｎ：９），表明在测定的时间内溶液稳定性良好． ２．６定量限和检测限 按１．４节的方法，制备不同浓度细胞内／外液样品，按定 量限和检测限测定要求分别进行测定，结果细胞内液阿霉素 测定的定量限为０．５０ ｎｇ／ｍＬ，ＲＳＤ为６．６９％（ｎ＝６），平均收 率为１０１．４２％；细胞外液的定量限为０．５０ ｎｇ／ｍＬ，ＲＳＤ为 ４．２１％（ｎ：６），平均回收率为１０３．０９％．细胞内／外液阿霉 素的检测限均为０．１５０．ｇ／ｒｏ￣．