肿瘤细胞的培养及其实验的方法
肿瘤实验报告实验结论
一、实验背景肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发生发展与细胞增殖和凋亡密切相关。
细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，对于维持生物体内环境稳定、消除异常细胞具有重要作用。
本研究旨在通过实验探讨肿瘤细胞增殖与凋亡的关系，为肿瘤的防治提供理论依据。
二、实验目的1. 观察肿瘤细胞在体外培养条件下的增殖情况；2. 评估肿瘤细胞凋亡水平；3. 分析肿瘤细胞增殖与凋亡的关系。
三、实验方法1. 细胞培养：采用人肺腺癌细胞系A549进行体外培养，置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
2. 细胞增殖实验：采用CCK-8法检测肿瘤细胞增殖。
将A549细胞以每孔2×10^3个细胞的密度接种于96孔板，分别培养0、24、48、72、96小时，每组设置3个复孔。
每孔加入10μl CCK-8试剂，孵育2小时后，用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD值）。
3. 细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡。
将A549细胞以每孔1×10^5个细胞的密度接种于6孔板，分别培养24、48、72小时，每组设置3个复孔。
收集细胞，用Annexin V-FITC/PI双染液染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
4. 数据分析：采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。
四、实验结果1. 细胞增殖实验：A549细胞在体外培养条件下呈现出明显的增殖趋势，随着培养时间的延长，细胞增殖率逐渐增加（P<0.05）。
2. 细胞凋亡实验：A549细胞在体外培养过程中，随着培养时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高（P<0.05）。
3. 肿瘤细胞增殖与凋亡的关系：A549细胞的增殖与凋亡呈现出一定的负相关性，即随着细胞增殖率的增加，细胞凋亡率逐渐降低。
五、实验结论1. A549细胞在体外培养条件下具有明显的增殖能力，且细胞增殖与培养时间呈正相关。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
肿瘤细胞培养技术
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
增生、吞噬碎片；第4~5天可见小堆 杂交瘤细胞生长。记录。 2. 融合后5~7天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出0.1ml ~ 0.15ml HAT， 换成同量HT培基。
单克隆抗体制备
七. 杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状
态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂 交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免 目的杂交瘤丢失。
可溶性抗原：2~10g
细胞抗原：1 105
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇篇1一、引言肿瘤细胞增殖实验是研究肿瘤发生、发展及其相关机制的重要手段。
随着科技的进步，体外检测肿瘤细胞增殖的方法逐渐成为研究热点。
本文将对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法、应用及优缺点进行综述，为相关研究者提供参考。
二、实验方法1. 细胞培养细胞培养是体外检测肿瘤细胞增殖的基础。
研究者需根据实验需求选择合适的细胞系，并掌握细胞培养的基本技术，如细胞的复苏、传代、冻存等。
2. 实验试剂与仪器在进行肿瘤细胞增殖实验时，需要使用一系列的试剂和仪器，如细胞计数试剂、酶标仪、显微镜等。
这些试剂和仪器的选择对实验结果的准确性至关重要。
三、实验技术1. MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖的方法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成蓝色结晶物并沉积在细胞中，从而反映细胞的增殖情况。
该方法具有操作简便、快速、准确等优点，在肿瘤细胞增殖实验中得到了广泛应用。
2. BrdU法BrdU法是通过检测细胞内BrdU的掺入量来反映细胞的增殖活性。
该方法需要预先在培养基中加入BrdU，然后通过特异性抗体检测BrdU的掺入量。
BrdU法具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映细胞的增殖情况。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种能够同时检测单个细胞多个参数的技术，可以用于分析细胞的周期、凋亡、增殖等情况。
在肿瘤细胞增殖实验中，流式细胞术可以用于检测细胞的DNA含量、BrdU掺入量等指标，从而更全面地了解细胞的增殖情况。
四、应用及优缺点1. 药物筛选与评价体外检测肿瘤细胞增殖实验可以用于药物的筛选与评价。
通过检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为药物的进一步研究和开发提供依据。
2. 肿瘤病理学研究体外检测肿瘤细胞增殖实验还可以用于肿瘤病理学研究。
通过分析肿瘤细胞的增殖特性，可以了解肿瘤的发生、发展及其相关机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。
3. 个体化治疗与预后判断体外检测肿瘤细胞增殖实验在个体化治疗和预后判断中也具有重要价值。
肿瘤细胞观察实验报告
肿瘤细胞观察实验报告
实验目的：
通过观察肿瘤细胞的形态和行为特征，了解肿瘤细胞的生长规律和传播方式。
实验材料：
1. 肿瘤细胞培养基
2. 显微镜
3. 细胞培养皿
4. 细胞培养瓶
5. 培养细胞的生长箱
6. 非无菌工具（镊子、移液器等）
7. 无菌培养棉签
实验步骤：
1. 将肿瘤细胞培养基倒入细胞培养皿中，均匀覆盖整个底面。
2. 用无菌工具（如镊子）取出一小块肿瘤组织，迅速剪碎成细胞悬液，加入细胞培养皿中。
3. 将细胞培养皿放入培养箱中，设置适当的温度和湿度，保持有利于细胞生长的环境。
4. 每隔一段时间，用显微镜观察细胞的生长情况。
注意观察细胞的形态、数量和移动方式等。
实验结果：
经过观察发现，肿瘤细胞开始以单个细胞的形式存在，随着时间的推移，细胞数量逐渐增多。
初始阶段，细胞的形态较为规则，呈圆形或椭圆形，并且细胞间相互独立，没有明显的聚集
现象。
随着细胞的增殖，细胞逐渐开始聚集形成细胞团，出现细胞丝状或树枝状的伸展，呈现出更多的分支和连接。
部分细胞开始分化，形成较大的细胞核和突起。
同时，还观察到部分细胞具有突起和移动能力，在细胞团内迁移和扩散。
实验结论：
通过观察肿瘤细胞的形态和行为特征，我们可以发现肿瘤细胞具有较强的增殖和扩散能力。
肿瘤细胞可以通过分裂和分化形成细胞团，并且具有突起和移动的能力，从而在人体内不断扩散和侵袭周围组织。
这些观察结果有助于我们深入了解肿瘤的发生和发展过程，为肿瘤的预防和治疗提供理论基础。
肿瘤细胞成球实验原理
肿瘤细胞成球实验原理
肿瘤细胞成球实验是一种常用的体外细胞培养技术，用于模拟体内肿瘤的生长和发展过程。
该实验可以通过培养肿瘤细胞成三维球体，更真实地反映肿瘤的特性和生物学行为。
实验开始前，我们需要从患者体内获取肿瘤组织，并将其分离出单个的肿瘤细胞。
这些细胞通常具有一定的肿瘤干细胞特性，包括自我更新和多向分化的能力。
我们将肿瘤细胞悬浮在含有适当培养基和营养物质的培养皿中。
培养基中的成分和浓度需要根据具体的实验目的进行调整，以提供细胞生长所需的营养和环境。
然后，我们将培养皿放置在恒温培养箱中，维持适当的温度和湿度，以模拟人体内的生理条件。
在培养过程中，细胞会自发地聚集在一起，形成三维的球体结构，称为肿瘤球。
肿瘤球的形成是由肿瘤细胞间的相互作用和通讯所驱动的。
在这个过程中，细胞之间会发生细胞黏附、细胞间信号传导和基质重塑等重要的细胞生物学事件。
通过观察和研究肿瘤球的形态、大小和结构，我们可以了解肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性和抗药性等特性。
此外，肿瘤球还可以用于测试新药的疗效和评估抗肿瘤治疗策略的有效性。
肿瘤细胞成球实验的优势在于它更好地模拟了体内的肿瘤生长环境，相比于传统的二维细胞培养，更能保留肿瘤细胞的原始特性和生物学行为。
这使得肿瘤球实验成为研究肿瘤生物学和开发抗癌药物的重要工具。
肿瘤细胞成球实验通过培养肿瘤细胞形成三维球体结构，模拟体内肿瘤的生长和发展过程。
这种实验方法可以更真实地反映肿瘤的特性和生物学行为，为肿瘤研究和治疗提供重要的参考依据。
肿瘤多细胞球体制备
肿瘤多细胞球体制备肿瘤多细胞球体制备是一种常用的实验方法，用于研究肿瘤的生物学特性和治疗效果。
肿瘤多细胞球体是由肿瘤细胞自发形成的球状结构，具有更接近体内肿瘤的组织结构和生理功能，因此被广泛应用于肿瘤研究和药物筛选等领域。
肿瘤多细胞球体制备的方法有多种，下面将介绍其中常用的方法。
一、悬浮培养法悬浮培养法是最常用的制备肿瘤多细胞球体的方法之一。
首先，将肿瘤细胞进行消化和离心，得到单细胞悬浮液。
然后，将细胞悬浮液加入含有细胞培养基和适当浓度的凝胶基质的培养皿中，使细胞在三维环境中生长。
适当的凝胶基质可以提供细胞生长所需的支持和结构。
在培养的过程中，细胞会自发形成球状结构，即肿瘤多细胞球体。
二、低附着培养法低附着培养法是另一种常用的制备肿瘤多细胞球体的方法。
与悬浮培养法不同，低附着培养法在培养皿中加入一层低附着的涂层物质，如聚乙二醇、聚丙烯酸等。
这样可以使细胞在培养过程中不粘附于培养皿的表面，而形成球状结构。
低附着培养法的优势在于可以更好地模拟肿瘤细胞在体内的生长环境，提高肿瘤多细胞球体的质量和稳定性。
三、三维打印法近年来，随着三维打印技术的发展，三维打印法也逐渐应用于肿瘤多细胞球体的制备。
这种方法通过将肿瘤细胞和生物材料一起打印成三维结构，实现肿瘤多细胞球体的快速制备和定制化。
三维打印法可以精确控制肿瘤细胞的位置和密度，进一步提高肿瘤多细胞球体的可控性和可重复性。
肿瘤多细胞球体制备的应用肿瘤多细胞球体制备的方法不仅在肿瘤研究中得到了广泛应用，还在药物筛选和个体化治疗等领域发挥着重要作用。
肿瘤多细胞球体可以更好地模拟体内肿瘤的生长环境，具有更接近体内肿瘤的组织结构和生理功能。
因此，通过研究肿瘤多细胞球体的生物学特性，可以更好地理解肿瘤的发生机制和生长规律。
肿瘤多细胞球体制备的方法可以用于药物筛选。
传统的肿瘤细胞培养方法往往无法准确评估药物对肿瘤的抑制效果。
而肿瘤多细胞球体可以更好地模拟体内肿瘤对药物的反应，从而提高药物筛选的准确性和可靠性。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
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肿瘤细胞的培养及其实验的方法肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。
当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。
另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。
肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。
肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。
生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。
培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2%〜5%）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis ）。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。
体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。
从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。
事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。
生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。
过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。
从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。
从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2 等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。
可能永生性是细胞恶变的阶段。
至少在体外是如此。
（四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。
在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。
（五）异质性所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。
异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。
肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
（六）细胞遗传大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。
肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。
（七）其它肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。
一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。
体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span,只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。
二、培养方法肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面, 肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别, 初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1．取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。
取材部位非常重要, 体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区, 取材时尽量避免用退变组织, 要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4C中，但不宜栽过24 小时。
2．培养基：肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM 、 Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低， 正常细胞培养不 加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大， 是因肿瘤细胞有自泌（ Autocrine ）性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需 要这些成分。
按不同细胞需要不同的生长因子； 肿瘤细胞与正常细胞之间、 肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。
还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等） 养更易成功。
3．成纤维细胞的排除：成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长， 胞生长得快， 最终能压制肿瘤细胞的生长。
排除成纤维细胞有多种方法（表 2－ 1）。
表 2－ 1 抑制成纤维细胞生长因素 方法 因素组织细胞选择性附着选择性附着底物汇合饲细胞层选择性培养基胰蛋白酶胶原酶 聚丙烯酰胺 聚四氟乙烯（ Teflon ） 胶原（猪皮） 小鼠 3T3人胎小肠D-缬氨酸（Valine ）MCDB-710MCDB-153Phenobarbitone 胚胎小肠、心肌、表皮 乳癌 各种肿瘤 转化细胞 表皮细胞 表皮 正常和恶性乳腺上皮 结 肠癌 肾组织 乳腺表皮 肝细胞注：上表结果为个别实验室经验，仅供参考但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。
有的 。
总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培致难以纯化肿瘤细胞。
而且成纤维细胞常比肿瘤细 因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。
三、成纤维细胞排除法1．机械刮除法：是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。
刮除程序为：（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；（3）用Hanks 液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止2．反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2 次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。
置温箱中静止培养5〜20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；（3）培养B瓶中细胞5〜20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B 瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。
如操作成功，次日观察可见 A 瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。
必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3．消化排除法：此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。
用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。
经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4．胶原酶消化法：本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
（1）可用0.5mg/ml 的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；（2）用Hanks 洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。
如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5．其它方法：有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重 1.025〜1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23C中800g离心10分种。
在比重1.025〜1.050层为成纤维细胞，在比重1.050〜1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。
最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
四、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。
当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况：完全无细胞游出或移动；有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。
1．适宜底物：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2．生长因子：应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。
根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。
为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞 (干细胞) 的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。
受体动物以裸鼠最好。
3.动物体媒介培养方法：(1)瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1〜3毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块；( 2)饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；( 3)进行体外培养。
( 4)为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。
通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。