第3节植物原生质体培养
植物生物技术：第6章 原生质体培养
微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第2节、原生质体分离及纯化
四、影响原生质体分离的因素
➢ 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质 体
➢ 但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、 最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响
➢ 多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散 入原生质体的速度很慢的缘故，来保证一个稳定的渗透压
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 叶肉细胞是常用的材料, 叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展 开的幼嫩叶片
➢ 愈伤组织或悬浮细胞，避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控 制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒
A
B
C
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶液及酶解方法
➢ 用来分离植物原生质体的酶制剂 ➢ 纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素 ➢ 果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细 胞分开 ➢ 酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶 ➢ 离析酶（果胶酶）
➢ 纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外
第2节、原生质体分离及纯化
3.分离培养基
➢ 常用的配制分3 离渗原透生压质：体原酶生液质的体溶操 液作 以需 及要 洗涤在原一生定质渗体透的压溶存液在为下进行，
CPW液
分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为 盐成分为：
➢ CPW盐成分为
（3）分离原生质体
方法有二：
两步分离法
一步分离法
第2节、原生质体分离及纯化
植物原生质体组织培养PPT课件
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
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Cell cloning
意义
• 植物细胞育种中的核质替换 • 细胞质杂种的获得 • 远缘杂交创造新物种细胞 • 细胞器的互作研究
• 酚藏花红染色法（0.1%)
• 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
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影响原生质体数量和活力的因素
• 供试材料及预处理方法 • 酶解条件：
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原生质体分离的方法
酶解分离法 机械分 离 法
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机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
• 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种 类受到限制。
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植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
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用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
第5章 原生质体及细胞悬浮培养
第二节 细胞培养生产有用物质
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
许多生活物质，包括药物、染料、香料、色 素等来源于植物，属于植物次生代谢产物； 传统方法：植物种植，适当时间获取植物相 关部位，提取(溶剂法、蒸馏法)； 植物细胞培养成功，激发人们利用该体系， 作为有用物质的来源； 40年代后期，Bonner报道了银胶菊植物组织 培养物能产生橡胶； 30多种化合物在组织培养物中的积累等于或 超过其原植物的产量；
细胞生长动态
2. 连续培养
连续培养(continuous culture)是利用特制的培 养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式； 不断排掉用过的培养基，注人新鲜培养基， 容积保持恒定下，营养物质不断得到补充。 连续培养有封闭型和开放型之分 ① 封闭型 细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到 培养系统中；细胞总量不断增加；
细胞生长与次生物质合成
用于次生产物生产的植物组织培养物类型， 通常有五种，组织培养，器官培养，再生器 官培养、细胞培养和混合类型 很多研究说明，生长迅速而未分化的细胞培 养物一般不积累或很少积累为其原植物所含 有的次生产物，它们的合成通常要求在形态 上和生化上有某种程度的分化，生长较缓慢 的组织中 细胞生长与次生物质合成矛盾必须得到完善 的解决；
悬浮细胞的优势
悬浮培养与固体培养比较有三个优点： 一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善 营养供应； 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有 害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
Callus Formation ….…
一、细胞的分离
植物组织培养教案
[重点难点]组织培养的概念、组织培养的类型、特点和应用第一节组织培养的概念一、组织培养的概念是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。
二、组织培养的特点：取材少生长周期短繁殖率高。
人工控制条件管理方便三、培养的研究类型组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等：第三节组织培养应用及展望一、快速繁殖种苗组织培养的快速繁殖，就是应用组织培养和细胞培养技术，快速繁衍珍稀濒危植物。
二、无病毒苗的培养三、在育种上的应用，。
四、工厂化育苗参考文献1、颜昌敬编著植物组织培养手册1990.1 上海科技出版社，2、朱建华主编植物组织培养实用技术2002.1 中国升量出版社3、梅家训、丁习武主编组培快繁技术及其应用2003.4 中国农业出版社4、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：2004.1中国农业大学出版社，[单元章节]第一章实验室及培养条件[教学目的]基本掌基握组织培养实验室的设计；熟练掌握实验仪器设备使用和培养基用湿热灭菌方法以及无菌操作技术。
[重点难点]的条件。
[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件；演示。
[教学时数]2课时。
[教学内容]第一节实验室及基本操作一、实验室（一）准备室(repairing room)在准备室内要完成培养基制备、清洗与整理工作。
为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：大型工作台、药品柜、普通冰箱、电子分析天平和托盘天平、电蒸馏水器、磁力搅拌器、电炉或电饭锅、酸度计、高压灭菌锅等。
（二）接种室(transfering room)1、对接种室要求2、接种室的主要设备及用具（三）培养室(culturing room)培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。
培养材料放在培养架上培养。
培养条件:培养室一般保持在20-27℃左右，相对湿度以保持在70％-80％为好，一般需要每天光照10-16h。
现代生物技术育种
1968 年，Smith 分离出第一个内切 酶。
1971 年， Nathans 应用Smith 的内 切酶切割 SV-40 病毒的 DNA ，获 得了第一个 DNA 的内切图谱（通 称“物理图谱” physical map）。
奖） ，他完成了φ X 噬菌体 DNA 的全测序。
自 70 年代末以来，基因工程发展迅速。 1980 年，Kemp 和 Hall 将大豆种子的贮藏蛋白基因引入向日 葵中，得到“向日豆”（ sunbean ）。
Wilmut 研究小组继克隆羊多莉之后，将人的 AAT 蛋白基 因导入绵羊体内，使羊奶中含有人的 AAT 蛋白一头这样的 转基因羊，获得 50 万英镑。
质酶、EA3-867（上海植物生化所复合酶）
（三）原生质体的纯化
1、过滤-离心法
44-169μm的筛网去除大的组织碎片和残渣 900-4500r/min，2min，收集沉淀 简单，但沉积造成挤压易导致原生质体破碎
2、漂浮法
采用比原生质体比重大的高渗溶液，离心后去除下层残渣
3、界面法
采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面 之中
输 通过组织培养提供生物技术育种的中间材料
(1)选择生长健壮的3cm～6cm 长的新芽作外植体。
(2)用消了毒的利刃将新芽从从 母体切下。
第三节 植物原生质体培养和细胞融合
一 、原生质体培养
原生质体（Protoplast）：指采用机械或酶解法 去掉细胞壁的裸露细胞 。
（一）原生质体的分离
（二）原生质体的分离方法
1978 年的诺贝尔医学奖
1972 年，伯格（ Berg ）等人用这两种酶成功地进行了λ-噬 菌体与 SV-40 病毒 DNA 的体外拼接。 1977 年，基因工程正式宣布成功——吉尔伯特（ Gilbert ） 分别将编码胰岛素和干扰素（这是两种有用的药物）的 DNA 经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成 了胰岛素和干扰素。 1978 年的诺贝尔化学奖（其中吉尔伯特的获奖主要是因为 DNA 测序方法的研究）。同时获奖的还有桑格 Sanger（2度获
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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园艺植物组织培养
▪ 第一节 概说
▪ 第二节 园艺植物组织培养的应用
▪ 第三节 园艺植物原生质体培养和体细胞杂交 ▪ 第四节 原生质体融合与园艺植物改良
园艺植物组织培养
培养室
能控制光照和温度，保持干燥 和清洁
观赏百合组织培养
小鳞芽反绿后开始生长生根
第一节 概说
▪ 一、园艺植物组织培养的意义
▪ 园艺植物组织培养是园艺学不可或缺 的一个重要组成部分，为园艺植物的 各个基础学科的研究和发展提供了强 有力的手段，在园艺学的基础理论研 究方面占有重要的地位，在园艺产业 中具有广泛的应用前景。园艺植物组 织培养技术及理论研究的发展对提高 园艺植物生产水平和技术水平，加速 园艺科学现代化的进程具有重要作用。
▪ 1941 Van Overbeek 发现椰乳对幼胚发育 的促进作用
▪ 1943 罗士韦和王伏雄在Science发文章， 离体培养云南松和云南杉幼胚成功。
胚乳培养的意义
胚乳：三倍体
★胚乳细胞中储存大量淀粉、蛋白质和脂类，
是研究这些产物代谢工程的理想系统
★完全由薄壁细胞组成的均质组织，是实验形
态发生学研究的极好材料。
合子胚与体胚比较
合 子 心 型 胚 正 在 萌 发 的 体 胚
针叶松体细胞胚及体胚萌发生长
花椰菜体胚发育的不同阶段
菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察
不定芽型（adventitious bud type)：
▪ 选取具有顶芽和腋芽的短枝 无菌培养，诱导芽萌发成苗 或增殖产生许多不定芽发育 成苗，将新萌生的枝条再转 接继代，重复芽到苗的增殖 过程，最后使其生根形成植 株的方式。
➢ 生根培养基 ▪ MS＋(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)多效唑
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
原生质体培养技术
第一，与完整植物细胞相比，原生质体易于摄取外来的物质，如DNA， 染色体、病毒、细胞器、细菌，因此可利用其作为理想的受体系统进行 各种遗传操作，在植物遗传育种实践方面意义重大。 第二，由于没有细胞壁，有利于进行体细胞诱导融合和单细胞培养。 第三，可用于细胞表面的结构与功能的研究，细胞器结构与功能的研究， 病毒侵染与复制机理的研究，以及细胞核与细胞质相互关系，植物生长 物质的作用、植物代谢等生理问题的研究。
四、原生质体培养的基本方法
基因型、材料的类型和生理状态 黑暗培养、低温处理、预质壁分离
材料的选择与预处理
机械分离法、酶解分离法
原生质体的分离 原生质体的纯化
离心沉淀法、漂浮法和界面法
形态识别、活体染色和荧光活体染色
活力的检测 原生质体培养
原生质体的生长发育和细胞壁的再生 愈伤组织或胚状体诱导形成 植株的再生
铁皮石斛叶肉原生质体的分离与培养
取石斛嫩叶 （无菌条件下，成长状况良好）
切成条状 （1.0~2.0mm） 以1:10的量加入酶液 在黑暗、(27±1)℃,以50 r/min振荡酶解6 h. 过滤、离心 （100目尼龙网）（350 r/min 5min） (若以蔗糖为渗透压调节剂时以600 r/min下离心5 min) 收集到的原生质体悬浮于含18%蔗糖的CPW盐溶液中静置1 h 用原生质体培养基洗涤2次.
植物原生质体培 养技术
2011年4月11日
一、原生质体概念
原生质体（protoplast） 原生质体
脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球。原 生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
亚原生质体（subprotoplast） 亚原生质体
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含 物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具 有细胞核，也可不具有细胞核。