单核细胞增生李斯特氏菌检验(食品微生物学检验)
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析樊惠华，侯磊磊，方 莹，柴梅梅（榆林市食品检验检测中心，陕西榆林 719000）摘 要：为了提升食品检验检测机构对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力，提高微生物实验室外部质量控制水平。
本实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，参考参试指导书、《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）、海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪。
结果表明，参试样品编号21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，样品编号21-U887未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌，最终能力验证结果评价为满意，可见本实验室具有成熟的单核细胞增生李斯特氏菌检验能力。
关键词：乳粉；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Results and Analysis of the Proficiency Testing of ListeriaMonocytogenes in Milk PowderFAN Huihua, HOU Leilei, FANG Ying, CHAI Meimei(Yulin Food Inspection and Testing Center, Yulin 719000, China)Abstract: In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proficiency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 (2021) milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines, the GB 4789.30—2016, the complete biochemical identification tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes, and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes, which was identified as Listeria.ivanovii. The final proficiency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.Keywords: milk powder; Listeria monocytogenes; proficiency test李斯特菌属目前包括17种公认的短杆状革兰氏阳性菌，其中单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被认为是病原体[1]。
单增李斯特氏菌能力验证结果与分析
I FOOD INDUSTRY I 75单增李斯特氏菌能力验证结果与分析得出现“假阳性”的结果。
一旦实验室出现“假阳性”“假阴性”“与参考值范围不符”等情况时，实验室的负责人员应该针对整个实验室进行溯源。
从人员、环境、设备、培养基和试剂等各个方面进行详细地追溯和分析，从而纠正不利因素，确保检验结果的科学性和准确性。
我院于2020年5月底参加了由中国食品药品检定研究院组织的“NIFDC-PT-248 食品中单增李斯特氏菌检出能力验证”试验，按照后期返回的结果来看，检验结果为“满意”，现将具体试验情况汇报如下。
1.材料与方法1.1样品实验室共收到2份单增李斯特氏菌样品，样品为白色球状、真空包装于西林瓶，样品编号分别为FC02220011、FC02220030；2袋奶粉样品，每袋重量为25g ，编码与菌球编码对应。
1.2仪器与材料A C 2-6S 1型E S C O 生物安全柜（新加坡艺思高公司）；GR-85致微高压灭菌器（厦门致微公司）；MJ-250-Ⅲ型霉菌培养箱（上海跃进）；HH.B11.600BY 型恒温培养箱（上海跃进）；VITEK2 Compact 30型全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里引言单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。
同时，也是一种食源性的人畜共患病的病原菌，欧美国家曾多次暴发由于食用了受单增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引发的严重的食物中毒事件。
在《GB 29921-2021 食品安全国家标准 食品中致病菌限量》中，对乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品均有五份样品中均不得检出单增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的规定；同样，在2022年3月7日实施的《GB 31607-2021 食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》中“部分或未经热处理散装即食食品”：单核细胞增生李斯特氏菌限量为0/25g （mL ）。
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。
因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。
本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。
一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。
在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。
由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。
二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。
然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。
三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。
以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。
qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。
2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。
ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
5.1常规原则
对于目前实验室操作，见ISO7218
注意2：因为培养基和试剂的数量较多，其经过了更可取的考虑。出于文章简洁的目的，在附录B中给出其组分和制备。
5.2 初级选择性富集培养基含降低浓度选择性试剂的Fraser培养液（半Fraser培养液）
见条款B.1
5.3含全浓度选择性试剂的选择性次级富集培养液（Fraser培养液）
见条款B.2
5.4选择性固体接种培养基
5.4.1第一个培养基：Oxford琼脂
见条款B.3
5.4.2第二个培养基：PALCAM琼脂
见条款B.4
5.5固体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂（TSYEA）
见条款B.5
5.6液体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物增菌液（TSYEB）
见条款B.6
5.7绵羊血琼脂
4.1应用含降低浓度选择性试剂的选择性富集培养液（半Fraser培养液）进行初级富集
对选择性初级富集培养液（包含1体积氯化锂和半体积吖啶黄以及萘啶酸—半Fraser培养液，也用作检验过程的稀释液）恒温培养，30℃24h；
4.2应用含全浓度选择性试剂的选择性富集培养液（Fraser培养液）进行次级富集
3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。
4.原理
在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图）
注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降低的抑制剂浓度，可以至少部分达到此目的。
8. 检样制备
单核细胞增生李斯特菌
单核细胞增生李斯特菌形态特征：①革兰氏阳性的类球形杆菌②大小约为0.4~0.5µm x 0.5～2.0µm③两端钝圆④在有些培养基中稍弯，单个、成V形或成对平行排列⑤在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性⑥兼性厌氧，无芽孢，一般不产生荚膜⑦在20~25℃时以4根周毛运动，在37℃时只有较少的鞭毛或1根鞭毛培养特性：①需氧和兼性厌氧②生长范围为2-42℃③最适温度为35-37℃④pH中性至弱碱性（pH9.6）⑤在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
⑥在20-25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。
⑦在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
⑧在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。
⑨在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
生化特性：（甘露醇、木糖为阴性，其他为阳）1.该菌触酶阳性，氧化酶阴性。
2.发酵多种糖类，产酸不产气。
发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。
不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。
3.不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。
4.吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。
5.MR-VP试验和精氨酸水解阳性。
生化试验：①动力试验+原理：有动力的细菌扩散生长，培养基浑浊，无动力的细菌培养基澄清。
（结果：有动力，呈伞状生长，底为弯月牙形）②过氧化氢酶试验（触酶试验）+原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
（结果：汽包产生为+）应用：葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。
它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。
乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。
为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。
需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。
为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。
同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。
单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展
食品微生物期末考核题目：单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展姓名：学号：班级：单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展康阳妃西南大学食品科学学院，重庆400715摘要：单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌之一，在自然界中分布广泛。
近年来，在许多国家，它是卫生部门重点监测的几种食源性致病菌之一。
本文介绍了单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性，流行病学特征。
总结了单核细胞增生李斯特氏菌现行有效的的常规和快速的检测方法及流程，并对各方法的优缺点进行了比较。
关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；生物学特征；流行病学特性；检测；致病菌The progress of detection methods to ListeriamonocytogenesKang yangfeiCollege of Food Science ,Southwest University,Chongqing 400715Abstract:Listeria monocytogenes is one of foodborne pathogens that can cause zoonosis,it is found ubiquitously in the environment. In recent years, it is one of several kind of foodborne pathogens that the Health department focus on surveillance to in many countries.This paper introduce the biological and epidemiological characteristics of Listeria monocytogenes. Summarize the current effective conventional and rapid detection methods and processes of Listeria monocytogenes.Key words:Listeria monocytogenes; biological characteristics;epidemiological characteristics ; Detection;pathogens引言单核细胞增生性李斯特菌是一种短小的革兰氏阳性无芽胞杆菌，是一种人畜共患病的致病菌，可使人和动物患李斯特菌病。
实验室检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的控制点分析
利描I分析与检测实验室检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的控制点分析□石晓丽段羚包头市食品药品检验检测中心摘要：目前，检测食品微生物通常参照食品安全国家标准GB4789.30-2016。
本文在严格按照GB4789.30-2016 规定的流程进行操作的基础上，根据多次阳性对照实验、阴性对照实验以及能力验证实验，总结出食品中单核细胞增生李 斯特氏菌检测的几个关键控制点。
关键词：食品微生物学；单核细胞增生李斯特菌；控制点单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes)(简称单增李斯特菌，下 文以“L.M”表示）是一种常见的土壤 细菌，是李斯特菌中唯一能引起人类 疾病的细菌。
对于某些食物（比如乳 制品和肉制品），其是一种污染菌，能引起食物变质。
本文在严格按照GB4789.30-2016中规定的流程进行操 作的基础上，根据多次阳性对照实验、阴性对照实验以及能力验证实验，总 结出食品中单核细胞增生李斯特氏菌 检测的几个关键控制点。
1实验准备用胰酪胨大豆肉汤分别活化菌种编号为CICC21633的单核细胞增生李 斯特氐菌和菌种编号为CICC10297的 无害李斯特氐菌。
2检验方法依据GB4789.30-2016《食品安全 国家标准食品微生物学检验单核细胞 增生李斯特氐菌检验》第二法，依据 单核细胞增生李斯特氐菌平板计数法 进行检验，程序见图1。
25 m L样液+225 m L稀释液，均质I10倍系列稀释I选择2〜3个适宜连续稀释度的样品 匀液，接种李斯特氐菌显色培养基I计数及确认试验I报告图1单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验流程3检验步骤首先，取25.0m L无菌纯牛奶于均质袋中，分别吸取已用胰酪胨大豆肉汤活化S的24 h的菌种编号为CICC21633的单核细胞增生李斯特氐菌和菌种编号为CICC10297的无害李斯特氐菌各100 HL加入牛奶中（试样编号①），再加225 m L无添加剂的LB肉汤于均质袋中，在排击式均质器中连续拍击1 min,制成1:10的均液。
FAPAS_乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论
分析检测FAPAS乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论刘 霓（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110000）摘 要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，本实验室参加了FAPAS分析实验室能力验证机构组织的实验室能力验证，分别运用国标方法、分子生物学方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对样品进行检测鉴定。
结果表明，M224d02-A样品检出单核细胞增生李斯特氏菌，M224d02-B样品检出英诺克李斯特菌，属于李斯特氏菌属。
2个样品检验结果均取得满意结果。
关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；FAPAS考核；李斯特菌Analysis and Discussion About the Verification Resultsof Listeria monocytogenes in Milk Powder from FAPASLaboratoryLIU Ni(Liaoning Inspection Examination and Certification Center, Shenyang 110000, China) Abstract: To strengthen the detection power of Listeria monocytogenes in food, our laboratory participated in proficiency testing on Listeria monocytogenes detection in foods which was organized by Food Analysis Performance Assessment Scheme (FAPAS). We used 3 methods for the test, respectively national standard method, molecular biology method and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method. Listeria monocytogenes were detected in M228d02-A. Listeria innocua belonged to Listeria sp. were detected in M228d02-B. The test results of 2 samples were outstanding grade.Keywords:Listeria monocytogenes; FAPAS proficiency testing; Listeria sp.李斯特菌属（Listeria sp.）是一种革兰氏阳性菌，在自然环境中广泛存在，一般认为它包括单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）、英诺克李斯特菌（L.innocua）等多种。
单核增生李斯特氏菌检测概述
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
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食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i am o n o c y t o g e n e s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(<100C F U/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数,特别是牛奶㊁水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2ħ~5ħ㊂2.2恒温培养箱:30ħʃ1ħ㊁36ħʃ1ħ㊂2.3均质器㊂2.4显微镜:10x~100x㊂2.5电子天平:感量0.1g㊂2.6锥形瓶:100m L㊁500m L㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌平皿:直径90mm㊂2.9无菌试管:16mmˑ160mm㊂2.10离心管:30mmˑ100mm㊂2.11无菌注射器:1m L㊂2.12单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s)A T C C19111或C M C C54004,或其他等效标准菌株㊂2.13英诺克李斯特氏菌(L i s t e r i a i n n o c u a)A T C C33090,或其他等效标准菌株㊂2.14伊氏李斯特氏菌(L i s t e r i a i v a n o v i i)A T C C19119,或其他等效标准菌株㊂2.15斯氏李斯特氏菌(L i s t e r i a s e e l i g e r i)A T C C35967,或其他等效标准菌株㊂2.16金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)A T C C25923或其他产β-溶血环金葡菌,或其他等效标准菌株㊂2.17马红球菌(R h o d o c o c c u s e q u i)A T C C6939或N C T C1621,或其他等效标准菌株㊂2.18小白鼠:I C R体重18g~22g㊂2.19全自动微生物生化鉴定系统㊂3培养基和试剂3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E):见A.1㊂3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E):见A.2㊂3.3李氏增菌肉汤L B(L B1,L B2):见A.3㊂3.41%盐酸吖啶黄(a c r i f l a v i n eH C l)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.51%萘啶酮酸钠盐(n a l a d i x i c a c i d)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.6 P A L C AM琼脂:见A.4㊂3.7革兰氏染液:见A.5㊂3.8S I M动力培养基:见A.6㊂3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(M R)和V-P试验用]:见A.7㊂3.105%~8%羊血琼脂:见A.8㊂3.11糖发酵管:见A.9㊂3.12过氧化氢试剂:见A.10㊂3.13李斯特氏菌显色培养基㊂3.14生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统㊂3.15缓冲蛋白胨水:见A.11㊂第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验4检验程序单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1㊂图1单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取样品25g(m L)加入到含有225m LL B1增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n;或放入盛有225m LL B1增菌液的均质杯中,以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h,移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂5.2分离取L B2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和P A L C AM琼脂平板,于36ħʃ1ħ培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落㊂典型菌落在P A L C AM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征,参照产品说明进行判定㊂5.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落,分别接种木糖㊁鼠李糖发酵管,于36ħʃ1ħ培养24hʃ2h,同时在T S A-Y E平板上划线,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,然后选择木糖阴性㊁鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定㊂5.4鉴定(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)5.4.1染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm~0.5μm)ˑ(0.5μm~2.0μm);用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动㊂5.4.2动力试验:挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或S I M动力培养基,于25ħ~30ħ培养48h,李斯特氏菌有动力,在半固体或S I M培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5d,再观察结果㊂5.4.3生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和M R-V P试验㊂单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1㊂5.4.4溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格刺种一个菌落,并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂, 36ħʃ1ħ培养24h~48h,于明亮处观察,单增李斯特氏菌呈现狭窄㊁清晰㊁明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈,英诺克李斯特氏菌无溶血圈,伊氏李斯特氏菌产生宽的㊁轮廓清晰的β-溶血区域,若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:也可用划线接种法㊂5.4.5协同溶血试验c AM P(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1mm~ 2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌㊁英诺克李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm的 箭头状 β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象㊂若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:5%~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象㊂表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖M R-V P甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌(L.m o n o c y t o g e n e s)++++/+-+-+格氏李斯特氏菌(L.g r a y i)-+++/++--+斯氏李斯特氏菌(L.s e e l i g e r i)++++/+--++威氏李斯特氏菌(L.w e l s h i m e r i)-+++/+-V++伊氏李斯特氏菌(L.i v a n o v i i)++++/+--++英诺克李斯特氏菌(L.i n n o c u a)-+++/+-V-+注:+阳性;-阴性;V反应不定㊂5.5小鼠毒力试验(可选项目)将符合上述特性的纯培养物接种于T S B-Y E中,于36ħʃ1ħ培养24h,4000r/m i n离心5m i n,弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010C F U/m L的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5m L,同时观察小鼠死亡情况㊂接种致病株的小鼠于2d~5d内死亡㊂试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组㊂单核细胞增生李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性㊂5.6结果与报告综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25g(m L)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌㊂第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法6检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2㊂图2单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1以无菌操作称取样品25g(m L),放入盛有225m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n或以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂液体样品,振荡混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂7.1.2用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂7.1.3按7.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释1次,换用1支1m L无菌吸管或吸头㊂7.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度的样品匀液分别吸取1m L以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板,用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂7.3培养7.3.1在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂7.4典型菌落计数和确认7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准㊂7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15C F U~150C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂如果:a)只有一个稀释度的平板菌落数在15C F U~150C F U之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;b)所有稀释度的平板菌落数均小于15C F U且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;c ) 某一稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;d ) 所有稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;e ) 所有稀释度的平板菌落数均不在15C F U~150C F U 之间且有典型菌落,其中一部分小于15C F U 或大于150C F U 时,应计数最接近15C F U 或150C F U 的稀释度平板上的典型菌落㊂以上按式(1)计算㊂f ) 2个连续稀释度的平板菌落数均在15C F U~150C F U 之间,按式(2)计算㊂7.4.3 从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选),分别按5.3㊁5.4进行鉴定㊂8 结果计数T =A BC d(1)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;d稀释因子㊂T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1 第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 1 第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;A 2 第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2 第二稀释度(高稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;1.1 计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂9 结果报告报告每g (m L )样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法10 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法检验程序见图3㊂图3单核细胞增生李斯特氏菌M P N计数程序11操作步骤11.1样品的稀释按7.1进行㊂11.2接种和培养11.2.1根据对样品污染状况的估计,选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10m LL B1肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1m L(如果接种量需要超过1m L,则用双料L B1增菌液)于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂每管各移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂11.2.2用接种环从各管中移取1环,接种李斯特氏菌显色平板,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂11.3确证试验自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选),按照5.3㊁5.4进行鉴定㊂12结果与报告根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录B),报告每g(m L)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E)A.1.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E)A.2.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.2.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3李氏增菌肉汤(L B1,L B2)A.3.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g蒸馏水1000m LA.3.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3.2.1李氏Ⅰ液(L B1)225m L中加入:1%萘啶酮酸(用0.05m o l/L氢氧化钠溶液配制)0.5m L1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制)0.3m LA.3.2.2李氏Ⅱ液(L B2)200m L中加入:1%萘啶酮酸0.4m L1%吖啶黄0.5m LA.4P A L C A M琼脂A.4.1成分酵母膏8.0g葡萄糖0.5g七叶甙0.8g柠檬酸铁铵0.5g甘露醇10.0g酚红0.1g氯化锂15.0g酪蛋白胰酶消化物10.0g心胰酶消化物3.0g玉米淀粉1.0g肉胃酶消化物5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.4.2.1P A L C A M选择性添加剂多粘菌素B5.0m g盐酸吖啶黄2.5m g头孢他啶10.0m g无菌蒸馏水500m LA.4.2.2制法将P A L C AM基础培养基溶化后冷却到50ħ,加入2m LP A L C AM选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用㊂A.5革兰氏染色液A.5.1结晶紫染色液A.5.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.5.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.5.2革兰氏碘液A.5.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.5.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.5.3沙黄复染液A.5.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.5.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.5.4染色法A.5.4.1涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.5.4.4滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.6S I M动力培养基A.6.1成分胰胨20.0g多价胨6.0gG B 4789.30 201611 硫酸铁铵0.2g 硫代硫酸钠0.2g 琼脂3.5g 蒸馏水1000m L A .6.2 制法将上述各成分加热混匀,调节p H 至7.2ʃ0.2,分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A .6.3 试验方法挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到S I M 培养基中,于25ħ~30ħ培养48h ,观察结果㊂A .7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(M R 和V P 试验用)A .7.1 成分多价胨7.0g 葡萄糖5.0g 磷酸氢二钾5.0g 蒸馏水1000m L A .7.2 制法溶化后调节p H 至7.0ʃ0.2,分装试管,每管1m L ,121ħ高压灭菌15m i n ,备用㊂A .7.3 甲基红(M R )试验A .7.3.1 甲基红试剂A .7.3.1.1 成分甲基红10m g 95%乙醇30m L 蒸馏水20m LA .7.3.1.2 制法10m g 甲基红溶于30m L95%乙醇中,然后加入20m L 蒸馏水㊂A .7.3.1.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36ħʃ1ħ培养2d ~5d ㊂滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果㊂鲜红色为阳性,黄色为阴性㊂A .7.4 V -P 试验A .7.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法:取α-萘酚6.0g ,加无水乙醇溶解,定容至100m L ㊂。