细胞膜片钳实验

细胞膜片钳实验

实验技术：

一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。膜片钳技术是用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片)与其周围在电学上分隔，在此基础上固定点位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。

实验技术原理：

膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。

实验操作流程：

1、标本制备：根据研究目的的不同，可采用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞，必须满足实验要求，一般多采用酶解分离法，也可采用细胞培养法；另外，由于与分子生物学技术的结合，现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道，如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。

2、电极制备：合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。

3、膜片钳实验系统：根据不同的电生理实验要求，可以组建不同的实验系统。

4、进行实验，记录和分析数据。[晶莱生物]

实验注意事项：

客户提供：

1、培养细胞：通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-80℃，避免反复冻融）；

2、实验信息：离子通道名称及亚型。

交付标准：

1、细胞膜电位的时程图

2、完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）

其他：

1、减少噪音，避免电极前端的污染，提高封接成功率，

2、记录模式，为记录特定离子电流

3、选择电极内、外液

4、选择阻断剂、激动剂

5、正确的数据采集

6、在形成高阻抗封接后，记录实验结果之前，通常要根据实验的要求进行参数补偿，以期获得符合实际的结果。

膜片钳使用的基本方法是，把经过加热抛光的玻璃微电极在液压推进器的操纵下，与清洁处理过的细胞膜形成高阻抗封接，导致电极内膜片与电极外的膜在电学上和化学上隔离起来，由于电性能隔离与微电极的相对低电阻（1～5MΩ），只要对微电极施以电压就能对膜片进

行钳制，从微电极引出的微小离子电流通过高分辨、低噪声、高保真的电流-电压转换放大器输送至电子计算机进行分析处理。膜片钳技术实现的关键是建立高阻抗封接，并能通过特定的记录仪器反映这些变化，因而，膜片钳实验室除了一般电生理实验所需的仪器外，还特需防震工作台、屏蔽罩、膜片钳放大器、三维液压操纵器、数据采集卡、数据记录、倒置显微镜和分析系统等。