生物化学实验思考题上课讲义

生物化学实验思考题

生物化学实验考试试题

细胞破碎

1 常用的细胞破碎的方法有哪些？

机械法：研磨，高速捣碎机；物理法：反复冻溶，超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法：自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。

2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些？

有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等

3 酶法破碎细胞原理：酶分解作用

4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用

层析技术

1.什么叫层析技术？

层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。

2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类？

根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。

3.指出常用层析技术的应用范围。

凝胶层析法：⑴脱盐；⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量；⑷高分子溶液的浓缩

离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子

高效液相层析法：⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；

⑶离子交换层析

4.SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？

大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。

5.用Sephadex G25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？蛋白质

6.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？

不能,分子量差距太小。

7.将分子量分别为a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。 c、a、b

8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？离子交换层析较高。

9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？ Ala

10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？

用水灌注、不能有气泡。

11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则

①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。

12、离子交换层析的原理：离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

13、亲和层析的原理：亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。

14、吸附层析的原理：组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂, 各能力不同而进行分离的方法。

15、试述凝胶层析原理，并列出常用凝胶名称

凝胶层析柱装有多孔凝胶，当含有各组分的混合液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动。一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶微孔，只能分布于凝胶颗粒的间歇中以较快速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶微孔，不断进出一个个颗粒的微孔内外，因此流动速度较慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子量由大到小顺序先后流出层析柱得到分离。

常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。

16、说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质?

纸层析是分配层析，利用分配系数不同，即氨基酸在两相中的溶解能力不同。

离子交换层析利用氨基酸是两性物质，在一定pH下不同氨基酸带电性质和带电量不同，因此交换能力不同。

17、简述薄层层析法分离糖类的原理?

薄层层析的实质就是吸附层析，也就是在铺有吸附剂的薄层上，经过反复地被吸附剂吸附以及被扩展剂扩展的过程。而吸附剂对不同的物质的吸附力不同，从而使糖在薄层上的涌动速度不同达到分离的目的

纸层析分离氨基酸

1．为什么苯丙氨酸的Rf值大于赖氨酸

因为水与滤纸的吸附性很强，故扩散的慢，邮寄溶剂与滤纸吸附性差，故扩散的快。苯丙氨酸是非极性氨基酸，其易随着有机溶剂一起扩散，而赖氨酸正好相反。故最后苯丙氨酸走的更远些，因而使苯丙氨酸Rf较大些。

2．为什么脯氨酸和茚三酮加热后是黄色斑点

脯氨酸等伯胺氨基酸与茚三酮反应可生成黄色化合物。4．纸层析和柱层析的一般操作步骤

纸层析：点样、层析、标记前沿、烘干、显色、得到层析图谱、标记色斑

柱层析：装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测、测定

5.何谓Rf值？影响Rf值的因素？

Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲Rf是一个常量。

电泳原理

1、电泳的原理：电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分