关于Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用
细胞信号转导中的SMAD蛋白家族研究
细胞信号转导中的SMAD蛋白家族研究细胞信号转导是指从细胞表面或细胞内传递的一系列分子反应，从而导致特定细胞功能的改变。
在许多关键的生物学过程中，细胞信号转导起着至关重要的作用。
SMAD蛋白家族是细胞信号转导中非常重要的分子之一。
本文将介绍SMAD蛋白家族的基本知识和最新的研究进展。
什么是SMAD蛋白家族？SMAD蛋白家族是一组信号传导蛋白质，可以被活化的细胞因子所激活，从而调控细胞的基因表达和细胞功能。
目前，SMAD蛋白家族已知有8种不同的成员。
其中，3种被称为R-SMADs，可以与细胞因子的受体结合，并通过多种交互作用进入细胞核，参与转录调控；2种被称为Co-SMADs，在核内与R-SMADs共同作用，参与基因表达的调控；还有3种SMADs作为调节分子（regulatory SMADs）与SMAD信号通路的激活和抑制相关。
SMADs的信号通路可以被负调控，以维持基因表达的平衡状态。
SMAD 蛋白家族在哪些生物学过程中起着至关重要的作用？SMAD 蛋白家族在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用，包括器官分化、细胞增殖、凋亡、生物钟调控、生殖发育等。
SMAD信号通路是TGF-β和BMP等因子信号通路的核心。
最近的SMAD家族研究最新进展是什么？SMAD家族的研究已成为当前细胞信号转导和分子医学领域热门的前沿领域。
1. TGF-β/SMAD信号通路在肿瘤中的调节研究SMADs在人类肿瘤中的表达缺陷和异常已被广泛报道，并且很多基因的缺陷将会影响TGF-β/SMAD信号通路的正常功能。
通过对肿瘤患者和小鼠模型的研究，有人发现TGF-β/SMAD信号通路在肿瘤抑制中扮演重要的角色。
2. SMADs在器官分化中的作用SMADs在器官分化中也有一定重要性。
有学者发现一个叫做Smad4的SMAD蛋白，在心脏的发育中扮演着重要的角色。
Smad4的缺失会导致心脏缺陷，并最终导致心脏发育障碍。
研究表明，细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)成分在心脏中起着重要作用。
骨形态发生蛋白9的研究进展
骨形态发生蛋白9的研究进展骨形态发生蛋白9（BMP-9）是转化生长因子超家族的成员之一，已知BMP 家族中成骨活性最强的成员；Smad蛋白在其信号传导中起重要作用；BMP-9腺病毒为载体表现出强大成骨能力；BMP-9还具有促进原始神经元乙酰胆碱的合成，调节造血干细胞，降低血糖等作用。
标签：骨形态发生蛋白9；信号通路；成骨作用；腺病毒骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，简称BMPs）是转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员之一，在人体内由肝脏合成并分泌，具有多种生物学功能，尤其是骨诱导能力，现已成为了医学界的研究热点，特别是为难以突破的骨缺损修复问题提供了新的治疗方法，现阶段BMP 家族中的BMP-2和BMP-7以被成功应用到临床治疗中，并取得了良好的效果。
BMP-9又称GDF2（growth differentiation factor 2），是已知BMP家族中成骨活性最强的成员，因其骨诱导活性不会受到免疫反应的较大抑制，故也是该家族中唯一能在有免疫能力的活体动物体内显著诱导骨形成的成员。
目前研究已证实，动物模型中BMP-9可有效地修复骨缺损。
现阶段BMP-9 的成骨机制、成骨作用、表达纯化方法、载体及支架材料的选择已经成为目前研究工作的热点和重点。
1基本特征BMP9（也称GDF-2，growth differentiation factor 2）是BMPs 中的一种，主要由肝脏分泌并完成表达，其免疫原性较低，通常不会引起免疫排斥反应，只具有轻微的免疫刺激能力。
BMP9从结构上看为高度保守的糖蛋白，对核酸酶以及胶原酶等大部分蛋白酶不敏感，只对胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感。
现已经证实BMP9具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化、调节葡萄糖和脂肪酸代谢、调节体内铁的动态平衡等多种重要功能，BMP-9通常会以前体和二聚体的形式存在，其在结构上不含有第7保守半胱氨酸这一特点与绝大多数TGF-β超家族成员相区别[1-2]。
BMP_FGF_Hh相关信号通路
另外Notch通路是最近发现的，其受到BMP2和 其主要功能是成骨细胞分化。还有Runx 2是BMP 信号转导中的重要因子，主要对传导通路抑制调
TGFβ的调节，Notch的基因包括Lfng Hey1和Hes1，
节起作用。
FGF信号通路
FGF信号通路示意图
1、Nodal的受体是 TGFβ家族和CFC构成 的复合体。 2、Smad2/3和FoxH1 共同做为许多基因的 转录调控因子。
胞的生长和分化”。
FGF和BMP对心脏特异基因调节示 意图
HEDGEHOG信号通路
1 Hedgehog基因及Hh蛋白
Hedgehog基因是一种分节极性基因， 因突变的 果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名。 哺乳动物中存在三个Hedgehog的同源基因： SonicHedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和
TGFβ家族信号转导首先是其配体与细胞膜上的TGFβ受体
相结合。已知受体可分为3种，I型、II型和III型受体。
I型和II型受体属于丝氨酸/ 苏氨酸(Ser/Thr)激酶家族，大
约为55 kD ，500个aa和70kD,570个aa 的跨膜糖蛋白。
II型受体不能单独转导信号，而激活的I 型受体可以单独
2.1 TGFβ超家族及其受体
TGFβ超家族包括近三十个生长，分化因子。整合 了tgf-B和BMP信号通路以及nodal和 activin配体的 信号传导。通路的最终信号分子几乎都指向smad 家族，然后整合到smad4一个分子上。如下图所 示
TGFβ 超家整合了TGF-B和BMP信号通路以及Nodal和 ActivinA配体的信号传导
基为磷酸化部位，蛋白激酶催化时结合磷酸基团。该蛋白家族
骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展
骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展张佳瑶同济大学口腔医学院·同济大学附属口腔医院修复科，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心 200072刘玛丽浙江杭州师范大学 310000摘要：近年来，随着我国科技实力的不断增强，骨组织工程飞速发展，为骨修复带来了全新的期盼。
骨髓间充质干细胞是骨组织工程中的种子细胞，通过诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞能够有效治疗骨关节炎、软骨缺损等疾病，由于骨髓间充质干细胞在分化过程中不仅涉及众多信号通路，并且还会受到蛋白质、药物、RNA以及基因等多种因素的影响，因此，为进一步提升骨髓间充质干细胞在科学研究和临床中的应用效果，本篇文章将依据国内外的相关研究，对骨髓间充质干细胞成软骨分化机制的研究进展展开综述。
关键词：骨髓间充质干细胞；软骨细胞；分化机制引言：骨髓间充质干细胞是一种尚未分化充分的类中胚层细胞，具有多向分化潜能，能够在特定的条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞以及神经元等[1-5]。
由于骨髓间充质干细胞取材方便、对身体损伤小并免疫原性相对较低，所以，它在组织工程学中的应用非常广泛，是骨组织工程中不可或缺的种子细胞。
近年来，随着我国人口老龄化的加剧，软骨病变、骨关节炎等疾病的发病率显著提升，对广大老年人群的机体健康和日常生活造成了严重的影响。
软骨组织主要由细胞外基质和软骨细胞共同组成，属于一种结缔组织，由于该组织内缺少血管和神经支配，一般无法自我再生，再加之软骨细胞的增殖能力也非常薄弱，所以，软骨损伤通常无法自我修复，如何有效治疗软骨相关疾病一直深受医学界的关注。
随着骨组织工程的高速发展，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化在治疗软骨病变、骨关节炎等疾病中的优势作用日益凸显，但是，由于骨髓间充质干细胞成软骨在分化过程中很容易因发生肥大变性而生成纤维软骨，从而导致治疗陷入中断或者失败，故此，总结分析骨髓间充质干细胞成软骨分化机制的研究进展对于相关科学研究及临床治疗具有重要意义[6-10]。
Smad蛋白研究进展
Smad蛋白研究进展Smad蛋白家族是转化生长因子β（TGFβs）超家族重要的细胞因子，共同担负着调节细胞生长、分化、凋亡等过程，主要由8种不同的蛋白构成整个Smad 家族，通过可逆磷酸化对多种信号传导通路的功能起着关键的调节作用，分别行使兴奋和抑制等不同作用。
本文对Smad蛋白调节作用机制进行综述。
标签：Smad蛋白；TGFβs；磷酸化转化生长因子β（transforming growth factor betas，TGFβs）超家族分布于人体各个系统，是调节细胞分化成熟过程的极其重要的一类生长因子。
它对于多种细胞功能都有调节作用，其调节功能涉及到胚胎发育、对疾病和伤害的反应、成熟个体稳态的保持等多个方面，细胞的迁移、生长、分化和细胞凋亡等一系列状态[1]。
TGFβs超家族的成员有抗苗勒氏管激素（anti-Muellerian hormone，AMH）、TGFβ、激活素、nodal、抑制素（Inhibins）以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）等等40余种[2-3]。
早期研究已经显示，Smad 蛋白能够被TGFβ诱导细胞膜受体直接激活，形成转录复合物，进一步控制转录核内的靶基因转录（见图1），细胞的多种分化成熟过程被调节。
因此，它不但成为了TGFβ信号通路中的重要部分，同时共同调节细胞功能，通过汇合其他信号通路。
近年来发现其与多种疾病尤其是多种恶性肿瘤发生、发展相关[2]。
1 Smad蛋白家族1.1 组成和结构大约500个氨基酸组成Smad蛋白，包含球形结构域两个，1个连接区。
N-末端结构域（又称“mad-同源体1”，MH1）在所有R-Smad和Smad4中高度保守，而在Smad6和7中则例外。
在不同的亚族中，C-末端（又称为MH2结构域）同MH1结构域一样高度保守[4]，但连接区的变化较大。
人类和小鼠基因组中各自编码了8个Smad蛋白。
Smad蛋白1、5和8属于TGFβs家族中AMH 和BMPs的通路受体底物[5]，Smad2和Smad3是激活素、TGFβ、Nodal通路的受体底物。
辛伐他汀对大鼠成骨细胞骨形成蛋白2及其信号传导蛋白Smad1和Smad5表达的影响
辛伐他汀对大鼠成骨细胞骨形成蛋白2及其信号传导蛋白Smad1和Smad5表达的影响高陶磊;李蕴聪;崔敏;李晓红【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2016(000)002【摘要】目的：研究辛伐他汀对成骨细胞骨形成蛋白2（BMP‐2）及其信号传导蛋白Sma和Mad相关蛋白（Smad）1、5表达的影响，探讨该药物影响成骨的可能机制。
方法：组织块培养法培养原代成骨细胞，传代纯化后用钙钴法染色鉴定。
对照组S0无药物干预，实验组选用含不同浓度[10‐8（S1组）、10‐7（S2组）、5×10‐7（S3组）、10‐6（S4组） mol／L ]辛伐他汀培养液对传代的成骨细胞进行72 h干预，采用反转录PCR（RT‐PCR）测得BM P‐2、Smad1、Smad 5 mRNA相对表达量，使用单因素方差分析和SNK‐q检验进行统计学检验，以得出不同浓度药物对BM P‐2及其信号传导蛋白的影响。
结果：BM P‐2、Smad1、Smad5 mRNA 相对表达量均随药物浓度（0、10‐8、10‐7、5×10‐7、10‐6 mol ／L）增高而增加。
三者在辛伐他汀浓度为10‐6 mol／L时表达量均最高。
各组数据两两比较除Smad5表达量在对照组S0与S1组间，S3与S4组间差异无统计学意义（P＞0．05）外，各实验组与对照组差异均有统计学意义（P＜0．05）。
结论：辛伐他汀能在一定剂量范围上调BMP‐2的表达，可能与诱导BMP‐2的信号转导分子Smad1、Smad5 mRNA的表达相关。
%Objective:To investigate the possible mechanism of simvastatin ,a cardiovascular system a‐gent ,which has been found a promotive effects in bone formation by inducing the differentiation and proliferation of osteoblast ,involving bonemorphogenetic protein‐2(BMP‐2) ,and its signal transducer :sekclsky mothers against dpp 1 and 5 (Smad1 ,and Smad5) .Methods :A continuous tissue cultivation method was used to separate and culti‐vate primary osteoblasts from cranium of SD neonate rats .The relative mRNA expression of BMP‐2 ,Smad1 and Smad5 of osteoblasts were determined by reverse transcription PCR(RT‐PCR) after being exposed to simvastatin [0 (S0) ,10‐8 (S1) ,10‐7 (S2) ,5 × 10‐7 (S3) ,10‐6 (S4) mol/L] for 72hours .Resu lts :The relative expression of BMP‐2 , Smad1 and Smad5 was significantly increased in a dose‐dependent manner after being treated with simvastatin (10‐8‐10‐6 mol/L) .The 10‐6 mol/L simvastatin showed the best promotive effects on the expression of BMP‐2 ,Smad1 and Smad5 .Conclusion:The increased expression of mRNA of BMP‐2 ,Smad1 and Smad5 may be involved in the possi‐ble mechanism of bone formation induced by simvastatin .【总页数】3页(P141-143)【作者】高陶磊;李蕴聪;崔敏;李晓红【作者单位】西安交通大学口腔医院西安710004;西安交通大学口腔医院西安710004;西安交通大学口腔医院西安710004;西安交通大学口腔医院西安710004【正文语种】中文【中图分类】R965.2【相关文献】1.辛伐他汀对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化过程中Smad1,2,7表达的影响 [J], 高建清;张辉;田发明;韩大成;张柳2.骨形成蛋白-2对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量的影响 [J], 何文喜;牛忠英;赵守亮;陈健3.骨形成蛋白(BMP)-2/4,IA型BMP受体及Smad1、4、5在Tca8113舌癌细胞中的表达及意义 [J], 傅升;金岩;刘源;何黎升;赵宇4.淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA 表达的影响 [J], 何伟;李自力;崔元璐;伊彪;梁成;王晓霞;李阳;王兴5.辛伐他汀对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织BMP-2及信号转导蛋白Smad1/5表达的影响 [J], 简小冲;陈江;黄文秀;杜志斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
BMP-Smad信号通路在小鼠胚胎干细胞诱导分化成骨细胞方案优化中的应用
BMP-Smad信号通路在小鼠胚胎干细胞诱导分化成骨细胞方案优化中的应用夏荃;鲍倩;蒋德菊;高巍【摘要】Objective To screen out the stable plan with the highest ratio of directed differentiation of murine embryonic stem cells (MSCs) into osteoblasts in vitro using BMP - Smad signaling pathway. Methods Murine MSCs were obtained via suspension culture form embryoid bodies (EBs). On the 14th to 21st day, the cells were assigned into 4 groups, Group A (culture supplemented with 50 μg/mL ascorbic acid + 50mmol/L β - glycerophosphate + 10-8 mol/ L dexamethaso ne), Group B (50 μg/mL ascormc acid + 10 mmol/L β - glycerophosphate + 1 μmol/L dexamethasone), Group C (50 μg/mL ascorbic acid + 50 mmol/L β - glycerophosphate + 1 μmol/L dexamethasone), and Group D (no inducer, as control group). The alkaline phosphonate (ALP) acivity was assessed on Day 7, 14, 21 and 28, On Day 22, the osteoblasts were determined by the1 ％ Alizarin red staining. The expressions of BMP2, BMPR2, Smad1 and Smad5 were determined by real time - PCR and western blot. Results Compared with the control group, the activities of ALP in the other 3 groups were significantly increased from Day 7 after adherence, and reached the peak on Day 21. After Alizarin red staining, orange mineralized nodules of varying size was observed in osteoblasts. The osteoblast ratio in Group A, B, C and D were 15.34％, 23.71％, 29.12％ and 0.66％, respectively. Although the expression of BMP2, BM-PR2, Smad1 and Smad5 wereincreased or reduced in Group A and B, when compared with Group D, they were all significantly increased in Group C (P＜0.05). Conclusion The osteoblast ratio in Group C is the highest, suggesting the optimal osteoblast induction.%目的利用BMP-Smad信号通路在成骨分化中的作用,筛选出较稳定且成骨率较高的小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞的方案.方法小鼠胚胎干细胞经悬浮培养形成拟胚体(embryoidbodies, EBs),用胰酶消化成单个细胞接种至6孔板中,在EBs单细胞贴壁生长的第14～21天,A组(方案1)添加50 μg/mL维生素C +50 mmol/L β - 磷酸甘油 + 10-8mol/L地塞米松;B组(方案2)添加50 μg/mL维生素C + 10 mmol/L β - 磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松;C组(方案3)添加50 μg/mL维生素C + 50 mmol/L β - 磷酸甘油+1 μmol/L 地塞米松;D组为正常对照组,不添加诱导剂.各组均在在贴壁第7、14、21、28天检测碱性磷酸酶(ALP)活性,第22天用1％茜素红染色鉴定成骨细胞.采用荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测BMP-Smad信号通路中的BMP2、BMPR2、Smadl和Smad5等关键mRNA和蛋白的表达组平.结果与正常对照组相比,各组均在EBs贴壁第7天后ALP活力逐渐增强,且均在第21天增至最强.茜素红染色结果显示,阳性细胞被染成橘红色、呈大小不等的结节状.计算成骨细胞诱导形成率,A 组、B组、C组和D组成骨细胞形成率分别为15.34％、23.71％、29.12％和0.66％.Q - PCR和Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,各组BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的mRNA和蛋白表达水平有不同程度的升高和降低,其中C组(方案3)的BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的相对表达量均升高,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论添加50 |xg/mL维生素C +50 mmol/Lβ-磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松的方案成骨细胞诱导形成率最多,可最大量诱导骨结节的形成.【期刊名称】《广东医学》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】6页(P822-827)【关键词】小鼠胚胎干细胞;BMP-Smad信号通路;诱导分化;成骨细胞【作者】夏荃;鲍倩;蒋德菊;高巍【作者单位】广州中医药大学中药学院广东广州 510006;广州中医药大学中药学院广东广州 510006;深圳市龙岗中心医院妇产科广东深圳 518116;广州中医药大学中药学院广东广州 510006【正文语种】中文药物的胚胎毒性评价是药物研发试验过程中必不可少的一个环节。
促进骨生长的蛋白或因子
促进骨生长的蛋白或因子
一种重要的促进骨生长的蛋白是骨形态发生蛋白（BMP）。
BMP
是一类信号分子，能够促进干细胞向成骨细胞的分化，并在骨再生
和修复过程中发挥重要作用。
此外，BMP还能够促进骨基质的合成
和沉积，从而加速骨折愈合和骨缺损修复。
除了BMP外，成骨细胞生长因子（OCGF）、成骨细胞分化因子（ODF）等因子也对骨生长起着重要的作用。
它们能够调控骨细胞的
增殖和分化，促进骨基质的合成和矿化，从而促进骨骼的生长和修复。
近年来，研究人员还发现了一些新的促进骨生长的蛋白和因子，如骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）等，
它们在骨再生和骨修复中的作用也备受关注。
总的来说，促进骨生长的蛋白和因子在骨科领域中具有重要的
意义，它们不仅可以用于治疗骨折、骨缺损等骨科疾病，还可以为
骨科手术的成功进行提供支持。
随着对这些蛋白和因子作用机制的
深入研究，相信将有更多的新发现和应用，为骨科医学带来更多的
突破和进步。
低氧条件下骨形态发生蛋白2对骨整合的调控
低氧条件下骨形态发生蛋白2对骨整合的调控廖晓妤;李迎春【摘要】Under the condition of hypoxia, bone loss would happen, and bone heal would be delayed, even nonunion, and osseointegration would be delayed after implant surgery. Bone morphogenetic protein (BMP) 2 is the central regulator of osteoblast differentiation and participates in the process of bone and cartilage formation whether it is in an individual or combined way. In this article, the bone reaction, the influence of BMP2 on osteoblast and osteoclast differentiation, as well as the interaction between BMP2 and vascular endothelial growth factor and the mechanism of BMP2 regulation of osseointegration under hypoxia are reviewed.%在低氧状态下,骨量丢失、骨组织再生延迟,骨组织损伤后愈合缓慢甚至不愈合,种植手术后骨整合延迟;而骨形态发生蛋白(BMP)2为成骨细胞分化的中心调控因子,无论是单一的还是组合的BMP2皆参与了软骨形成和骨形成过程.本文就低氧环境下骨组织的反应,BMP2对骨整合过程中成骨细胞和破骨细胞的影响,骨整合过程中BMP2与血管内皮生长因子间的相互作用,低氧作用于BMP2的机制等研究进展作一综述.【期刊名称】《国际口腔医学杂志》【年(卷),期】2012(039)005【总页数】5页(P697-701)【关键词】低氧;骨形态发生蛋白;骨整合【作者】廖晓妤;李迎春【作者单位】中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院修复科;广东省口腔医学重点实验室,广州,510055;青海省人民医院口腔科,西宁,810007【正文语种】中文【中图分类】Q51种植体骨界面的骨整合是种植体与骨组织最理想的结合方式[1]。
bmp-2蛋白结构 -回复
bmp-2蛋白结构-回复bmp2蛋白结构蛋白质是生命中不可或缺的分子，它们在细胞中发挥着关键的功能。
其中一种重要的蛋白质是BMP2（Bone Morphogenetic Protein 2），它在骨骼发育和修复中起着重要作用。
本文将详细介绍BMP2蛋白的结构，包括其组成和功能。
1. 什么是BMP2蛋白？BMP2是一种属于骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein）家族的蛋白质。
它通过调控骨细胞的增殖和分化，以及血管新生来促进骨骼的生长和修复。
BMP2也被用于临床上进行骨骼再生治疗。
2. BMP2的基因和合成BMP2的基因位于人类基因组中，编码了一个由396个氨基酸组成的多肽链。
在细胞内，BMP2的合成始于mRNA的转录，随后mRNA被翻译成多肽链。
该多肽链在未成熟状态下，经历了一系列后转录修饰和折叠过程，最终形成成熟的BMP2蛋白。
3. BMP2蛋白的组成成熟的BMP2蛋白由两个亚单位组成，每个亚单位都包含有通过非共价键连接的C端和N端。
C端包含一个胶原结构域，该结构域可与细胞表面的受体进行结合。
N端则包含一个骨形态发生蛋白激活序列（bone morphogenetic protein activation sequence），该序列在BMP2的激活过程中起着重要的作用。
4. BMP2的功能BMP2通过与细胞膜上的BMP受体结合，触发一系列信号转导途径，以实现其功能。
当BMP2与受体结合时，BMP2的C端将与受体的胞外结构域相互作用，导致受体发生构象改变，并激活下游的信号转导途径。
这些信号转导途径具有重要的骨形态发生作用，能够促进成骨细胞的增殖和分化，并诱导干细胞向骨细胞方向分化。
5. BMP2的应用由于其在骨骼发育和修复中的重要作用，BMP2被广泛应用于临床医学中。
临床上，BMP2可以与骨基质或支架材料结合，促进骨骼修复的过程。
BMP2也可以在体外实验中用于促进干细胞向骨细胞方向分化，以用于组织工程和再生医学。
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关于Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用【摘要】目的研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白��2(BMP��2)诱导成骨分化过程中作用，探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。
方法将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养，培养的成骨细胞分组，加入不同浓度的BMP��2或BMP��2与Trx2SARA混合物后，用反义PCR和Western Blot斑点杂交对各组诱导成骨分化的情况进行分析。
体内实验中肌肉局部埋植BMP��2或BMP��2和Trx2SARA，取不同时间点处死动物，制备组织切片，用SO染色进行组织学观察。
结果 BMP��2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加，降钙素mRNA增加，Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性增加。
Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。
体内实验组织切片SO染色显示，BMP��2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成，而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。
结论 Smad蛋白在BMP��2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。
【关键词】 Smad蛋白质类骨形态发生蛋白质类成骨分化［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of Smad protein on osteogenesis induced by bone morphogenetic protein��2 (BMP��2) signal.MethodsPrimary calvarial osteoblasts were pided into three groups. Group Ⅰ were treated with BMP��2; group Ⅱ with BMP��2 and Trx2SARA; gr oup Ⅲ as control without any treatment. Reverse transcription PCR (RT PCR) and Western Blot were applied to analyse differenciation of osteoblasts. BMP��2 and Trx2SARA were also injected into gluteus of mice. Tissue samples were obtained from the site of injection for histological SO staining.ResultsExpressions of both alkaline phosphatase (ALP) and calcitonin mRNA of the osteoblasts from group Ⅰ increased，Smads level increased in a dose��dependent manner. While theexpression of ALP and calcitonin mRNA in group Ⅱ showed a significant downregulation. Histological SO staining showed that BMP��2 treated tissues were composed of cartilage with large population ofproliferating， pre��hypertrophic and hypertrophic chondrocytes. In contrast， Trx2SARA and BMP��2 treated tissues exhibited seldom chondrogenic differentiation.ConclusionSmad protien plays an important role in osteogenesis induced by BMP��2 signaling.［KEY WORDS］Smad proteins; bone morphogenetic proteins; osteoblastdifferentiation; mechanism骨形态发生蛋白��2(BMP��2)是转化生长因子β（TGF�拨�）家族成员之一，可促进多种细胞的生长、分化和抑制细胞的凋亡。
在生长发育过程中，BMP��2是调节成骨的重要生长因子。
然而，关于BMP��2在诱导成骨分化方面的作用机制目前尚不清楚。
为此，本研究旨在分析Smad蛋白在BMP��2诱导新骨形成过程中的作用，探讨Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用机制。
1 材料和方法1.1 实验动物选择雄性MDX小鼠12只， 2～3周龄，体质量27～35 g。
1.2 细胞培养取MDX小鼠的颅盖骨，通过一系列酶消化方法分离获得成骨细胞[1]，进行细胞培养，在培养板上细胞达到80%的融合后分组，各组分别加入500、200、0 mg/L 的BMP��2 作用24 h，收获细胞进行蛋白和RNA分析。
为观察BMP��2诱导长期的成骨细胞分化，将培养的成骨细胞又分为3组：1组加入浓度为500 mg/L的BMP��2，2组加入BMP2和Trx2SARA，3组不加入任何物质做为对照。
5 d后对细胞进行蛋白和RNA分析。
1.3 反义PCR(RT��PCR)和Western Blot斑点杂交分析总RNA应用TRIzol Regent提取液提取，定量RT��PCR和Western Blot斑点分析均按照CHOEN等[2]的方法进行。
1.4 体内实验选择2～3周龄成年雄性大鼠。
腹膜外注射咪达唑仑针剂(12.5 mg/kg)深度麻醉30 min。
右下肢备皮无菌准备后，在臀部背面做5 mm长的皮肤切口，于臀肌内通过钝性分离制作一个肌腔隙。
将动物分为两组：BMP��2注射组（Ⅰ组）和BMP��2与Trx2SARA注射组（Ⅱ组）。
Ⅰ组和Ⅱ组于海绵内装填50 μg的BMP��2，海绵冻干放入肌袋内，用5��0可吸收线间断缝合肌肉和皮肤组织。
在BMP��2植入前2 d，Ⅱ组动物注射10 μg/L的Trx2SARA。
苏醒后笼内放养，正常进食、饮水。
在手术后2周处死动物。
标本用40 g/L的多聚甲醛固定3 d，4 ℃下在200 g/L EDTA(pH 7.4)中脱钙5 d。
脱钙后，标本用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，10 μm厚切片，置于TESPA处理的载玻片上。
切片脱蜡，通过梯度乙醇浸入水中重新水化，随后进行SO染色行组织学观察。
2 结果应用不同剂量的BMP��2处理24 h，BMP��2处理的成骨细胞主要向成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶（ALP）和降钙素mRNA增加，以及成骨细胞分化的基因表达增加(图1)。
Western Blot杂交显示 Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性升高(图2)。
BMP��2和Trx2SARA处理的成骨细胞，ALP和降钙素mRNA水平下降（图3、4）。
组织切片SO染色显示，术后2周BMP��2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞的软骨构成(图5)。
Trx2SARA处理组很少向软骨源性分化，很少观察到肥厚软骨细胞(图6)。
3 讨论骨形态发生蛋白是从骨基质分离提纯的一类能高效诱导骨、软骨组织发生的酸性糖蛋白，是一组结构相关性的多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性，如参与早期胚胎发生的身体构建，控制软骨、骨和性器官的形成，促进组织修复，调节细胞的增殖、凋亡、分化和迁移，调节免疫和内分泌功能等。
到目前为止，共发现了30多种的骨形态发生蛋白[3]。
BMP可分为几个亚族，BMP2和BMP4结构高度相似，BMP5、BMP6、BMP7和BMP8在结构上相似，BMP2、BMP4、BMP6和BMP7在体内可诱导骨和软骨形成[4]。
Smad蛋白家族是近年发现的新的细胞内信号传导蛋白，直接参与骨形态发生蛋白等多个成员的信号转导[5～7]。
在胚胎发生、个体形成、非对称器官的形成过程中具有重要作用。
在哺乳动物目前已经分离获得8种类型的Smad蛋白，根据其结构和功能它们又被分为3个亚型：受体调节的Smads 蛋白（R Smad）、共同介导的Smads蛋白（co��Smad）和抑制性Smads蛋白（anti��Smad）[8]。
来自BMP家族成员的信号作用于Ⅱ和Ⅰ型丝氨酸�菜瞻彼峒�酶受体，而后通过细胞内的多种蛋白传导其信号。
活化的Ⅰ型受体与特定的R��Smad相互作用，并将其磷酸化。
活化的R��Smad与Co��Smad形成异聚复合体，并在核内积聚。
核内的异聚复合体可以直接或者通过其他DNA结合蛋白间接与DNA结合，从而调节靶基因的转录。
在Smad信号转导过程中也受到一些抑制信号的影响，如一种特异性的阻断Smad 信号转导通路的肽适体――Trx2SARA[9]，其关键作用是在BMP 刺激时减少Smad2、Smad3与Smad4形成的复合体，同时介导活性Smad复合体的降解。
本研究中BMP��2处理的成骨细胞向成骨分化，表现为ALP增加，降钙素mRNA增加，成骨细胞分化的基因表达增加以及Smad蛋白的表达水平剂量依赖性增加。
结果表明，BMP��2介导成骨分化期间Smad蛋白信号激活。
为研究Smad信号对成熟成骨细胞的作用效果，本研究探讨了Smad信号途径对BMP��2诱导长期成骨分化的调节作用。
实验中用特异性的阻断Smad信号转导通路的Trx2SARA和BMP��2一起处理小鼠颅盖骨成骨细胞，结果Trx2SARA对碱性磷酸酶和降钙素mRNA水平起到抑制作用，可见Smad信号失调抑制了BMP��2介导的成骨细胞分化。
体内实验表明，Trx2SARA介导Smad蛋白的失活抑制了BMP��2介导的软骨的形成，提示Smad蛋白在BMP��2诱导软骨骨形成过程中起到重要作用。
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