鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞BMP-2和Runx2表达的影响
鹿瓜多肽的基础研究
鹿瓜多肽的基础研究作者：尚发明游小军来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第02期【中图分类号】R927.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0157-02鹿瓜多肽是一种复方制剂，主要含有骨诱导多肽类生物因子、甜瓜籽提取物、多种游离氨基酸和有机钙磷等成分1），目前在骨科广泛应用。
现将鹿瓜多肽的基础研究综述如下。
1 BMPs方面的研究1965年，Urist首先发现BMP能诱导骨组织形成， 1988年Wozney等[3]复制了BMP-2和BMP-4的cDNA，发现BMP以二聚体形式存在，其化学结构表明BMP是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员。
通过DNA重组技术已经克隆出17种不同的BMPcDNA。
BMP-2在骨折愈合的中早期表达较强（骨折后3-14 d），且在骨祖细胞、间充质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、单核巨噬细胞、多核巨细胞等多种细胞和骨基质、骨折端肌肉等多种组织中表达，但骨折中晚期（21-42 d）BMP-2表达逐渐减弱（4）。
而BMPs对已经分化成熟的骨和软骨细胞基本上无促进增殖作用。
其中，BMP-2被认为是活性最强、唯一能单独诱导骨形成的因子，BMP-2可加快新骨生成的速度以及新骨与骨皮质结合的速度，但并不能影响矿物质沉积和骨生成的速度。
因此，只有在多种调节因子的共同参与下，BMPs才能更好地诱导新骨形成。
陈学明等（6）实验表明，大鼠骨折模型建立后，分别给予鹿瓜多肽和生理盐水，鹿瓜多肽组BMP-2阳性染色阳性细胞出现早、数量多。
BMP-2表达主要在软骨细胞和成骨细胞中，当软骨细胞成熟并转化为骨细胞时它们的表达趋于减少。
2 TGF-β方面的研究近30年来的研究证明新骨形成是一系列生长因子调控，其中TGF-β超家族最引人注目，TGF-β超家族是一类结构相关的多肽类调控蛋白。
这一家族成员主要包括TGF-β、BMPs、ACT参与细胞增殖、分化和转化的调节（7）。
鹿茸多肽功能的研究进展
[３] 赵天一ꎬ姜彤伟ꎬ张永和. 鹿茸多肽对缺血动物模型心肌
作用
[１４]
ꎮ 李夏等
[１５]
研究发现ꎬ鹿茸多肽高剂量组在
组ꎮ 表明虽然四氯化碳毒性很强ꎬ但是鹿茸多肽对其
造成的急性肝损伤仍然具有保护作用ꎮ
物制品学杂志ꎬ２０１３ꎬ２６(１１) :１６２９￣１６３１.
细胞线粒体凋亡相关基因蛋白 Ｂｃｌ￣２ / Ｂａｘ 的影响[ Ｊ] .
基金项目: 吉林省科技厅资助项目(２０１６０１０１９５ＪＣ) ꎻ吉林省中医药管
心肌细胞膜上钙离子通道有关ꎮ
理 局 项 目 ( ２０１７０９９ ) ꎻ 吉 林 省 卫 生 厅 资 助 项 目
(２０１３Ｚ０９１) .
作者简介: 李 琳(１９９６—) ꎬ女( 汉族) ꎬ本科生.
通信作者: 张宸豪(１９７２—) ꎬ男( 汉族) ꎬ副教授ꎬ博士.
的含量与鹿茸多肽的剂量呈正相关ꎻ另外在离体实验
其复杂ꎮ 研究发现一定剂量的鹿茸多肽可以促凋亡
中配制大鼠的腺垂体细胞悬液ꎬ结果显示ꎬ随着鹿茸
蛋白减少而抗凋亡蛋白含量增多ꎬ二者的比例与细胞
多肽剂量的增加ꎬ腺垂体细胞培养液中的黄体生成素
的凋亡有紧密联系ꎬ若比例失衡ꎬ则会引起细胞的损
伤及凋亡 [２￣３] ꎮ 王 旭 凯 等 [４] 研 究 结 果 表 明ꎬ４００ ｇ / Ｌ
鹿茸多肽对脊髓神经元的凋亡有抑制作用ꎬ主要是通
过抑制胱天蛋白酶 ３ 的表达来更好地抑制细胞凋亡ꎮ
鹿茸多肽可以提高人体的免疫能力ꎬ对免疫功能
有明显的促进作用
灌胃ꎬ发现随着鹿茸多肽含量的增加ꎬ去卵巢小鼠子
宫 / 体重值以及子宫外径值均在逐渐增加ꎬ说明鹿茸
多肽对小鼠子宫的生长发育有促进作用ꎮ
鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系
SUI Xin1, XU Yan2, ZHOU Jia2, WANG Weinan3, ZHANG Mingtian1, HAN Dong2, LI Na4, YANG Qing4, QU Xiaobo2, HUANG Xiaowei2
（1. Experimental Center，Affiliated Hospital，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117， China；2. Department of Clinical Pharmacy and Pharmacology of Chinese Medicine，School of Pharmacy，Changchun
促进 BMSCs 释放 BMP-4 和 Sox9，提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平，抑制 BMSCs 增殖，是一种潜在的成
软骨分化诱导剂。
［关键词］ 鹿茸Ⅰ型胶原；骨髓间充质干细胞；成软骨；Ⅱ型胶原；聚集蛋白聚糖
［中图分类号］ R329. 28
［文献标志码］ A
Effects of velvet antler collagen typeⅠ on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and its relationships with type Ⅱ collagen and aggrecan expressions
第 46 卷 第 5 期 2020 年 9 月
吉 林 大 学 学 报 （医 学 版） Journal of Jilin University （Medicine Edition）
Vol. 46 No. 5
Sep. 2020
MSCs成骨信号轴BMP-2-Smad-Runx2-Osterix与迁移信号轴CXCL12-CXCR
MSCs成骨信号轴BMP-2-Smad-Runx2-Osterix与迁移信号轴CXCL12-CXCR4的交叉影响骨骼是人体一个重要的组成部分，对于整个身体的运动和支撑起着至关重要的作用。
骨骼的正常发育和修复需要多种信号轴的协调和调控。
其中，成骨信号轴和迁移信号轴在骨骼发育和修复中起着重要作用。
MSCs（骨髓间充质干细胞）是一种多潜能干细胞，具有成骨和迁移的潜能，是骨骼发育和修复的重要细胞来源。
本文将探讨MSCs成骨信号轴BMP-2/Smad/Runx2/Osterix与迁移信号轴CXCL12/CXCR4的交叉影响。
起首，我们先介绍MSCs成骨信号轴。
BMP-2（骨形态发育因子2）是成骨过程中的关键分子，它通过结合细胞膜上的受体，激活Smad信号通路。
Smad是一组信号转导蛋白，能够进入细胞核，与转录因子Runx2结合，增进成骨相关基因的转录和表达。
Osterix是Runx2的转录调控因子，能够直接调控成骨细胞的分化和成骨过程。
其次，我们来介绍MSCs迁移信号轴。
CXCL12（趋化因子12）是一种趋化因子，能够刺激MSCs的迁移。
CXCR4是CXCL12的受体，它存在于MSCs的细胞膜上。
当CXCL12与CXCR4结合时，能够通过激活一系列下游信号通路，增进MSCs 的迁移。
探究表明，成骨信号轴和迁移信号轴在MSCs的功能调控中互相影响。
起首，BMP-2可以增进CXCL12的表达。
试验证明，BMP-2处理后，MSCs细胞中CXCL12的表达水平明显上调。
而且，BMP-2还能够通过活化Smad信号通路，增强CXCR4在MSCs的表达。
这表明，成骨信号轴可以通过上调CXCL12和CXCR4的表达，增进MSCs的迁移。
其次，迁移信号轴对成骨信号轴也有调控作用。
探究发现，CXCL12可以增进MSCs的成骨分化。
试验证明，添加CXCL12处理后，MSCs的成骨相关基因如Runx2和Osterix的表达水平明显上调。
补肾中药通过Runx2基因调控骨代谢相关研究进展
补肾中药通过Runx2基因调控骨代谢相关研究进展徐玉德，徐玉娥，周明旺，安国尧，陈威，付志斌甘肃省中医院，甘肃兰州 730050摘要：随着分子生物学的高速发展，对骨代谢相关信号通路及基因的研究不断深入，发现Runx2基因在骨代谢中发挥着重要的作用。
本文就补肾中药影响Runx2基因调控骨质疏松症相关研究进行综述，旨在为骨质疏松症的发病机制研究及靶向治疗提供一定参考，从而更好地发挥中医药在骨质疏松症治疗中的独特优势。
关键词：补肾中药；Runx2基因；骨质疏松症；综述中图分类号：R2-05；R259.89 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2021)02-0141-04DOI：10.19879/ki.1005-5304.202004556 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Research Progress in Regulation of Runx2 Gene ThroughKidney-tonifying Herbs in OsteoporosisXU Yude, XU Yu’e, ZHOU Mingwang, AN Guoyao, CHEN Wei, FU ZhibinGansu Province Hospital of TCM, Lanzhou 730050, ChinaAbstract: With the rapid development of molecular biology, studies on bone metabolism related signaling pathways and genes have been deepening, and Runx2 gene has been found to play an important role in bone metabolism. This article reviewed the research on the effects of kidney-tonifying herbs on Runx2 gene regulation of osteoporosis, in order to provide some references for the pathogenesis of osteoporosis and targeted therapy, and give full play to the unique advantages of TCM in the treatment of osteoporosis.Keywords: kidney-tonifying herbs; Runx2 gene; osteoporosis; review骨质疏松症是由多种原因导致以骨内钙盐与骨基质比例失衡引起骨脆性增加为特点的代谢性骨病。
鹿茸多肽成分及其药理作用研究
鹿茸多肽成分及其药理作用研究
宗颖;刘侗;王志颖;孙佳明;张辉
【期刊名称】《吉林中医药》
【年(卷),期】2013(033)011
【摘要】鹿茸是我国传统的滋补强壮药,鹿茸多肽是其主要的生物活性成分,鹿茸多肽主要由氨基酸组成,鹿茸多肽对皮肤创伤有促进皮肤愈合的作用,能提高机体的免疫功能,鹿茸多肽可以抑制软骨细胞的凋亡,还通过影响与细胞老化的相关因子的表达来延缓软骨细胞老化,从而防止软骨退变.鹿茸多肽对神经系统有保护作用,能促进骨髓间质干细胞的增殖,并且对心肌细胞也有保护作用,还有治疗阳痿等性功能障碍的作用.
【总页数】4页(P1135-1137,1145)
【作者】宗颖;刘侗;王志颖;孙佳明;张辉
【作者单位】长春中医药大学,长春130117;吉林农业大学,长春130118;长春中医药大学,长春130117;吉林农业大学,长春130118;长春中医药大学,长春130117;长春中医药大学,长春130117
【正文语种】中文
【中图分类】R282.74
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鹿茸多肽对不同诱导剂致人肝细胞系l-02氧化损伤的保护作用
的最具活性的小分子蛋白,我们以前的研究证明鹿
大鼠肝纤维化的药理作用 [4 - 6] 。 本试验以乙醇、四
肝损伤是肝脏常见的病理损害,同时也是导致
vet Antler Polypeptide,VAP) 是雄性梅花鹿茸中提取
过程与氧化应激密切相关。 氧化应激导致肝细胞
茸多肽具有促进肝细胞再生、抑制四氯化碳诱导的
肝纤维化、肝硬化和肝癌的重要原因之一。 肝损伤
膜脂质过度氧化,干扰细胞能量代谢,并最终导致
细胞死亡 [1 - 2] 。 乙醇、四氯化碳和过氧化氢在肝细
胞内的代谢可以增加细胞内活性氧( ROS) 水平,导
致细胞内大分子损伤和细胞死亡 [3] ,因此它们是体
外建立肝损伤模型的常用诱导剂。 鹿茸多肽( Vel收稿日期:2019 08 01
基金项目:国家自然科学基金资助项目(82102953) ;吉林省科
chlorodihydrofluorescein diacetate ( H2DCFDA) staining. Cell viability of L-02 exposed to alcohol、tetrachloride, hydrogen peroxide
was increased in the presence of VAP, and VAP reversed the nuclear morphological change and an augmented mitochondrial mem-
( Laboratory Medicine College of Jilin Medical University , Jilin 132013 , China )
Abstract:To study the protective effect of Velvet Antler Polypeptide ( VAP) against liver injury in human normal liver cell line
BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告
PEG/BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告一、研究背景及意义：骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为一种重要的细胞来源，具有广泛的应用前景，包括修复骨组织缺损、治疗免疫性疾病和心血管病等。
近年来研究表明，BMSCs可通过基因转染进一步增强其在组织工程和再生医学中的应用。
其中，紫外激活的聚乙二醇（PEG）和骨形态发生蛋白2（BMP-2）是常用的基因载体。
PEG能够通过暴露于紫外线下后产生的极端亲疏水性改变，进而实现基因递送；BMP-2则可以促进BMSCs向成骨分化方向发展。
本研究旨在通过PEG/BMP-2转染兔BMSCs，并对转染效率及表达情况进行检测，为今后在骨组织再生修复方面提供一定的理论基础和实践经验。
二、研究内容和方法：1.构建基因转染体系。
将PEG和BMP-2克隆入质粒载体，并用文库筛选合适的转染载体。
经过体外菌落PCR、限制性内切酶酶切、测序等方法鉴定合格的质粒载体。
2.培养和鉴定BMSCs。
采集新鲜兔骨髓，将骨髓细胞分离培养至90%的汇聚度后进行CD29、CD44、CD90和CD45表面标记的流式细胞术检测，筛选并扩增BMSCs，存活性检测和细胞形态学观察。
3.基因载体转染。
将所筛选的质粒载体转染入BMSCs中，分别选用PEG及BMP-2载体分别转染，同时设置空白对照组和阴性对照组。
4.转染效率和表达测定。
利用聚合酶链式反应（PCR）、Western blot和免疫荧光技术等手段，对转染效率和表达情况进行检测。
三、预期研究结果：1.成功构建PEG/BMP-2转染体系。
2.成功分离出鉴定合格的BMSCs。
3.成功将PEG/BMP-2载体转染入BMSCs，有效提高BMSCs向成骨分化的能力。
4.成功检测转染效率和表达情况。
四、研究的价值与意义：本研究旨在探讨PEG/BMP-2基因转染方法对BMSCs向成骨分化方向的影响，对骨髓间充质干细胞的应用及组织修复和再生方面具有重要的理论和实践意义。
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鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞BMP-2和Runx2表达的影响张洪长;张莹;刘明昕;潘志;律广富;陈港;姜鸿远;郭骏骐【摘要】目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中骨形态发生蛋白2(BMP-2)和骨特异性转录因子2 (Runx2)基因和蛋白表达的影响,阐明其对骨合成及hBMSCs向成骨细胞方向分化的作用机制.方法:体外培养的hBMSCs分为对照组和5、10、15、20 g·L-1 VAP组,通过检测各组hBMSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性,确定体外用药最佳药物浓度;CCK-8法检测对照组和10 g·L-1 VAP组hBMSCs增殖情况;荧光定量PCR法与Western blotting法测定对照组和10 g· L-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因与蛋白的表达.结果:VAP各组细胞中ALP活性均高于对照组,其中以10 g·L-1 VAP组细胞中ALP活性最高(P＜0.01); CCK-8法,10 g·L-1 VAP组hBMSCs增殖率明显高于对照组(P＜0.05),VAP 诱导培养第9天hBMSCs增殖率最高,且进入平台期,之后hBMSCs的增殖率开始下降;荧光定量PCR和Western blotting检测,10 g·L-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因及蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:VAP能够提高hBMSCs中ALP活性,促进hBMSCs增殖分化,上调hBMSCs中BMP-2及其下游Runx2基因和蛋白的表达,这可能是VAP对hBMSCs骨形成及骨代谢影响的分子调控机制之一.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(041)003【总页数】5页(P491-495)【关键词】鹿茸多肽;人骨髓间充质干细胞;骨形态发生蛋白2;骨特异性转录因子2【作者】张洪长;张莹;刘明昕;潘志;律广富;陈港;姜鸿远;郭骏骐【作者单位】长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药理研究室,吉林长春130117;吉林大学药学院药理学教研室,吉林长春130021;长春中医药大学图书馆参考咨询部,吉林长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药理研究室,吉林长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药理研究室,吉林长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药理研究室,吉林长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药理研究室,吉林长春130117;长春中医药大学科技处,吉林长春130117【正文语种】中文【中图分类】R961鹿茸多肽（velvet antler polypeptides，VAP）是从梅花鹿茸中提取的一种多肽类生物活性因子，具有促进骨及软骨愈合［1］、促神经再生功能［2］、加速皮肤创面的愈合［3］和提高人体的免疫能力［4－5］等功能。
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓内的多功能干细胞，一定条件下可向成骨细胞方向转化。
骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein－2，BMP－2）是一种多功能蛋白，可以诱导新骨形成和骨折愈合［6］，在胚胎发育过程中调节干细胞增殖分化方面有着重要的作用，且在体外能够诱导干细胞成骨和成软骨分化［7－8］；BMP－2主要通过经典的Smads信号通路调节成骨分化关键转录调控因子骨特异性转录因子2（runt－related transcription factor 2，Runx2）等的表达，进而转导成成骨信号，最终促进干细胞的分化。
有关VAP通过对Smads信号转导通路的影响从而促进人BMSCs（hBMSCs）中BMP－2和Runx2表达的研究目前少有报道。
本研究观察VAP对hBMSCs中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、增殖分化及BMP－2和Runx2基因、蛋白表达的影响，探讨其在BMP2／Runx2信号通路中对hBMSCs增殖和成骨分化的调控作用。
1 材料与方法1.1 细胞、主要试剂和仪器 hBMSCs来自本课题组志愿者骨髓液（符合伦理要求实验用标本）；梅花鹿VAP由长春中医药大学化学研究室提供；胎牛血清购自美国Thermo公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；ALP、CCK－8细胞增殖－毒性检测试剂盒、RNA－OUT总RNA提取试剂盒、总蛋白定量测试盒（BCA 法）和RIPA细胞裂解液均购自南京建成生物工程研究所，Anti－Runx2、Anti－human BMP－2、辣根过氧化物酶 HRP标记的羊抗鼠二抗均购自美国R＆D Systems公司，Runx2、BMP－2和β－actin蛋白均购自英国Abcam公司。
CO2培养箱（新加坡ESCO公司），550型酶标仪（美国Bio－Rad公司），ABI7500PCR扩增仪（德国Biometra公司），垂直板电泳装置（美国BIO－RAD公司，Mini－ProteinⅢ），DYY40B型转印电泳槽（北京六一仪器厂），Chemi Imager 5500凝胶电泳成像分析系统（美国 Alphainno－tech Chemi Imager公司）。
1.2 hBMSCs的分离培养本课题组志愿者签署知情同意书后，在髂后上棘穿刺采集志愿者的骨髓液5mL，将骨髓液肝素抗凝后，加等量PBS混匀，使之成为单细胞悬液，2500r·min－1离心15min。
吸出试管中间骨髓单个核细胞层，加入PBS 3mL，1000r·min－1离心5min，共洗2次。
弃PBS，加入培养液混匀，移至塑料细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养48h后弃除悬浮细胞半量换液，之后每2d换液1次，利用hBMSCs可黏附于塑料培养瓶壁生长这一特性进行分离纯化［9］。
细胞传代2次后基本除去非贴壁的球形骨髓造血干细胞，得到纯化的hBMSCs，选取生长良好的第3代细胞进行实验。
1.3 细胞分组和给药将处于对数生长期的hBMSCs接种于含有10% 胎牛血清DMEM培养基的培养皿中，37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。
细胞分为对照组和给药组。
对照组：连续用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养；给药组：含10%胎牛血清的DMEM培养液加终浓度为5、10、15和20g·L－1VAP培养。
1.4 ALP活性检测 hBMSCs以5×104mL－1的密度接种于96孔板，24h待其铺满孔底后更换为VAP培养液，给药组分别加入终浓度为5、10、15和20g·L－1VAP，每3d换VAP培养液1次，诱导培养3、6、9和12d后弃培养液，采用ALP试剂盒测定细胞的ALP活性，酶联免疫检测仪测定420nm处吸光度（A）值，以A值表示ALP活性，将ALP活性最高时的VAP浓度确定为其最佳浓度，作为后续实验中VAP的浓度。
1.5 CCK－8法检测hBMSCs增殖率选择生长良好的第3代hBMSCs，以5×104mL－1的密度接种于96孔板中，每孔100μL，对照组及终浓度为10g·L－1VAP组各5孔，共60孔，置于5%CO2、37℃培养箱中，24h贴壁后每隔3d各取5孔测定细胞增殖情况。
检测时吸出培养液，每孔加入不含胎牛血清的DMEM培养液100μL及CCK－810μL，CO2培养箱中孵育2h，用酶联免疫检测仪测定450nm处的A值，计算细胞增殖率。
细胞增殖率＝（实验组A值－对照组A值）／对照组A值×100%。
1.6 荧光定量PCR法检测hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表达水平hBMSCs以5×104mL－1的密度接种于6孔板中，每孔2mL，对照组及终浓度为10g·L－1VAP组诱导培养9d后回收，用RNA－OUT提取总RNA，逆转录，荧光定量PCR方法测定BMP－2和Runx2mRNA的表达水平，以β－actin为内参。
BMP－2上游引物：5′－AGCCCTTCACTGCCATCCTGTC－3′，下游引物：5′－ATTCTCTCGTTCACCGCCCAC－3′，扩增产物长度为89bp；Runx2 上游引物：5′－CAAAGGTGCAGCCTTTGTGTC－3′，下游引物：5′－TCACAGTCCGGATTGAGCTCA－3′，扩增产物长度为105bp；β－actin上游引物：5′－GGCAACACAGCTCACAAGAA－3′，下游引物：5′－CGCTGTTTTCACAGAGGTCA－3′，扩增产物长度为117bp。
PCR反应条件：95℃、60s；95℃、15s；60℃、15s；72℃、45s；共36个循环。
通过Oligo 6.0引物设计软件设计引物序列，由北京奥科生物技术有限公司合成。
由计算机自动计算得出CT 值，根据所得CT值应用2－△△CT法计算BMP－2和Runx2mRNA表达水平。
1.7 Western blotting法检测hBMSCs中 BMP－2和Runx2蛋白表达水平hBMSCs以5×104mL－1的密度接种于6孔板中，每孔2mL，对照组及终浓度为10g·L－1VAP组诱导培养9d后回收，PBS漂洗2次，加入细胞裂解液RIPA，冰上静置15min后收集裂解液，将裂解产物反复冻融裂解3次，12000r·min－1离心30min，按照 BCA－200蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，取20μg蛋白经SDS－PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜5% 脱脂牛奶封闭2h后，孵育一抗（1∶500）4℃ 过夜。
0.1%TBST洗涤3次，每次5min；加入用0.1%TBST稀释的二抗（1∶1000稀释），室温孵育1h。
0.1%TBST洗5次，每次5min。
以ECL化学发光法检测蛋白印迹，并进行曝光、显影和定影。
数码相机拍照，Image J2X软件进行分析，以特定蛋白与β－actin蛋白的灰度值比值表示蛋白表达水平。
蛋白表达水平＝特定蛋白灰度值／β－actin蛋白灰度值。
1.8 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。
各组hBMSCs中ALP活性、细胞增殖率、BMP－2及Runx2基因和蛋白表达水平以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。
2 结果2.1 各组hBMSCs中ALP活性 ALP活性检测结果显示：5、10、15和20g·L－1VAP组hBMSCs诱导培养3、6、9和12d后，ALP活性均高于对照组（P＜0.01），10g·L－1VAP组细胞中ALP活性为最高，故后续实验皆采用此浓度。