慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化
慢病毒介导TGF-β2基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化
慢病毒介导TGF-β2基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化【摘要】目的探讨慢病毒介导转化生长因子β1（tansforming growth factor bata 1，TGF －β1）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）诱导成软骨细胞分化的作用。
［方法］密度梯度离心法分离培养 BMSCs，探索病毒感染最佳条件，取第3 代细胞，分为实验组和对照组，通过慢病毒载体将外源性TGF －β1基因转染入细胞，观察绿色荧光表达情况，Ｒeal － time PCＲ法和 western blot 法检测 TGF －β1 基因的 mＲNA 和蛋白表达情况，7、14 d 时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Ｒeal － timePCＲ检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。
［结果］ TGF －β1 基因转染 BMSCs 后能够稳定表达。
转染 7、14 d 时，实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。
转染 7、14 d 时，实验组 II 型胶原 mＲNA 均显著高于对照组（P ＜ 0. 01）。
转染 7 d 时，实验组聚集蛋白聚糖mＲNA 变化不明显，而 14 d 时显著高于对照组（P ＜ 0. 01）。
［结论］慢病毒介导的 TGF－β1 基因可成功转染大鼠 BMSCs，并诱导其向软骨细胞分化。
在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的 mＲNA 表达具有时间差异性。
【关键词】骨髓间充质干细胞；成软骨分化；转化生长因子β1；慢病毒载体；大鼠软骨组织缺乏血管和神经，软骨细胞的营养供给主要是通过关节滑液和细胞周围的基质，其自身修复能力相当有限。
目前关节软骨退化性疾病在临床上有各种不同的治疗方法，但均不能达到十分理想的效果，近年来各个国家学者的研究证明，软骨组织工程与基因工程相结合的方式可能是软骨退行性改变相关疾病的有效治疗方法。
BMSCs结构相对简单，为具有特定生物学功能的多能干细胞，其具有来源广泛、取材简便、相对安全、体外增殖能力强、提取及体外培养方法已相对比较成熟等特点，并且其在一定的条件下可以分化为软骨、骨、脂肪、肌腱等组织的细胞。
骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2019)01-00001-06 1www.CRTER .org·研究原著·常晓朋，男，1981年生，河南省洛阳市人，汉族，2010年河南中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱关节创伤基础与临床研究。
通讯作者：常晓朋，硕士，主治医师，郑州大学附属郑州中心医院，河南省郑州市 450000文献标识码:A稿件接受：2018-10-22Chang Xiaopeng, Master, Attending physician, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, ChinaCorresponding author: Chang Xiaopeng, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2协同促进 骨髓间充质干细胞成骨分化常晓朋，陈 涛，赵 寅，梁 明(郑州大学附属郑州中心医院，河南省郑州市 450000) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1519 ORCID: 0000-0002-2845-4085(常晓朋)文章快速阅读：文题释义：三维立体培养：利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。
细胞三维培养一方面能够为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的定向分化诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。
转化生长因子133和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞
转化生长因子Ｉ ３ ３ 和骨形态发生蛋白２ 基因共转染骨髓干细胞术 ★
王体俊’ ，王昌耀’ ，夏长所 ，隋爱华 ，王英振’ （ 青岛大学医学院附属 医院，’ 关节外科， 中心 实验室，山东省青岛市 ２ ６ ６ ０ ０ ３ ）
文章 亮点 ： １ 骨形 态发 生 蛋 白 ２作 为成 骨 诱导分 化 因子 ，主要 在骨 创伤 愈合 早 期发挥 作用 ，而 转 化生 长因子 Ｂ ３主
要 在 愈合 后期 调节 成骨 细胞 的增 殖 ，促进 骨质 的形 成和 成 熟 。 ２ 实验应用慢病毒将转化生长因子 ８ ３和骨形态发生蛋白 ２基因共转染至骨髓间充质干细胞，在基因和 蛋 白层面 证实 转化 生长 因 子 Ｂ ３和骨 形态 发生 蛋 白 ２在转 染后 的骨 髓 间充质 干细 胞 中长 期、 稳 定共 表 达，且二 者 具 有协 同促 表达 作用 。
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５ — ４ ３ ４ ４ ． ２ ０ １ ３ ． ２ ７ ． ０ １ ８ ｌ ｈ ｔ ｌ ｐ ： ／ ／ ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｄ ｅ ￣ ｏ ｒ ｇ １ 王体俊 ．王昌罐 ．夏长昕．碴爱华 王英振 转化生长因子 和骨形态０ １ ３ ．１ ７ （ ２ ￣ ： ５ ０ ６ ３ — ５ ０ ６ ９ ．
Ｂｏｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｃ ｏ － ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏｒ ｍｉ ｎ ｇ ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｂ ｅ ｔ ａ ３ ａ ｎ ｄ ｂ ｏｎ ｅ ｍＯ ｒ ｐ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ２
成骨 分化 。
慢病毒介导的Sox9基因在兔骨髓间充质干细胞的过表达促进软骨损伤修复
【 关键词】 Ｓ ｏ ｘ ９基 因 ； 骨髓间充质干细胞； 转染 ； 软骨 ； 兔
Ｄ ｏＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ｏ ３ — ０ ０ ３ ４ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ５ ． ０ １ ｌ
Ｏｖ ｅ ｒ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ ｏ ｘ ９ ｇ ｅ ｎ ｅ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｌ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｎ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｏ ｒ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ
毒 介导的 Ｓ ｏ ｘ ９基 因转 染 兔 骨 髓 间充 质 干 细胞 （ Ｂ ＭＳ Ｃ ｓ ） ， 体 外检 测软 骨 特 异 性 分 子 ， 将 新 西 兰 大 白兔 ２ ４只 ４ ８个膝 关 节 随机 分 为 ３组 ， 动物麻醉后 ， 双 侧 股 骨 滑 车 处 的 关 节 面上 用 直径 ４ ｍ ｍ 的钻头钻孔 ， 深度 ３ ｍ ｍ， 穿透软骨下骨 ， 造 成
王震 ， 梁大川 ， 白洁 玉 ， 康宁， 冯军宇， 杨 自权
（ 山西 医 科 大 学 第 二 医 院 骨 科 ， 山西 太原 ０ ３ ０ ０ ０ １ ）
【 摘要 】 目的 ： 明确在体 内 Ｓ ｏ ｘ ９基 因过表达 的兔骨髓 间充质干细胞 对于关节软骨损伤修复的作用。 方法 ： 以慢病
中国骨伤 ２ ０ １ ５年 ５月第 ２ ８卷第 ５期 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｊ Ｏ ｒ ｔ ｈ ｏ ｐ Ｔ ｒ ａ ｕ ｍａ ， Ｍａ ｙ ． ２ ０ １ ５， Ｖ ｏ １ ． ２ ８ ， Ｎ ｏ ． ５
・
慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的实验研究的开题报告
慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的实验研究的开题报告一、研究背景和意义心脏起搏器是治疗慢性心脏病的重要手段，但现有的电子起搏器存在着电池寿命短、感染率高等问题，其临床应用也受到限制。
近年来，基因治疗成为心脏起搏器研究的新方向。
心脏中的HCN4通道是在自律性心脏节律中起重要作用的离子通道。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）源广、易获得，可通过体外培养稳定增殖，且对抗排异反应能力强，是构建基因治疗性生物起搏器的良好载体。
因此，本实验旨在探讨慢病毒介导hHCN4基因转染BMSCs，并将其应用于构建生物起搏器的可行性和技术路线。
二、研究内容和方法1. 实验内容：（1）制备慢病毒hHCN4基因载体，体外包装成慢病毒颗粒。
（2）提取并纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs）。
（3）慢病毒介导hHCN4基因转染BMSCs。
（4）利用电生理学技术检测转染后BMSCs的膜电位变化。
（5）将转染后的BMSCs进行分化培养，并观察自律性节律的表现。
（6）实验组比较：未转染的BMSCs组、空载体病毒转染组和hHCN4基因慢病毒转染组。
（7）结果比较：采用Taqman荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光技术检测转染效率和蛋白表达水平的差异。
2. 方法：（1）制备慢病毒hHCN4基因载体，包装成慢病毒颗粒。
（2）提取并纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs）。
（3）接种并培养BMSCs，转染慢病毒hHCN4基因载体。
（4）通过电生理学技术检测转染后BMSCs的膜电位变化。
（5）转染后的BMSCs进行分化培养，并观察自律性节律的表现。
（6）未转染的BMSCs组、空载体病毒转染组和hHCN4基因慢病毒转染组进行组间比较。
（7）采用Taqman荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光技术检测转染效率和蛋白表达水平的差异。
三、研究进展和预期结果目前已制备出hHCN4基因载体，并通过PCR、酶切、测序等方法进行鉴定。
脱蛋白骨联合VEGF基因转染治疗股骨头缺血坏死
脱蛋白骨联合VEGF基因转染治疗股骨头缺血坏死曹凯;黄伟;安洪;蒋电明;黄路【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)3【摘要】目的探索一种新的方法治疗股骨头早期缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,AVNFH)。
方法69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组。
第1组,将脱蛋白骨(deprotein ized bone,DPB)复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内,第2组植入DPB,第3组仅在股骨头内钻一隧道。
术后3 d,1、2、4、8和16周获取标本。
RT-PCR、W estern b lot和免疫组化技术分别检测VEGF165 mRNA、蛋白的表达及安全性。
X线大体观察成骨情况,组织形态学分析血管发生和股骨头修复。
结果第1组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周,第1组动物术后远膈脏器未检测到VEGF165的表达。
血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异有显著性(P<0.01)。
结论VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成,VEGF基因治疗兔AVNFH有效、安全,脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础。
【总页数】5页(P215-219)【关键词】脱蛋白骨;血管内皮生长因子;基因治疗;股骨头缺血坏死【作者】曹凯;黄伟;安洪;蒋电明;黄路【作者单位】重庆医科大学附属第一医院骨科;重庆医科大学儿童医院肾脏免疫科【正文语种】中文【中图分类】R322.71;R459.9【相关文献】1.VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究 [J], 白志刚;巩凡;马军;孙玺淳;杨绿林;尚小可;李立新;黄朋2.酸性成纤维细胞因子复合部分脱蛋白骨修复早期股骨头缺血坏死的组织学改变[J], 朱肖奇;郭浩;葛宝丰3.慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死 [J], 马跃刚; 李强; 陶旋; 周桢杰; 朱伦井; 段江涛4.慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死 [J], 马跃刚; 李强; 陶旋; 周桢杰; 朱伦井; 段江涛5.VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究 [J], 曹凯;黄伟;安洪;蒋电明;黄路因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达
文 章 编 号： ２ ０ ９ ５ ４ ３ ４ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ３ ６ ． ０ ６ ３ ８ １ ． ０ ７
。 惶
方 法 ： 分 离 提 取５ ０ ｇ Ｓ Ｄ 大 鼠 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ， 采 用 流 式 细 胞 仪 鉴 定 ， 将 携 有 血 管 内 皮 生 长 因 子１ ６ ５
杨 洋☆ ，男 ，１ ９ ８ ３年 生 ， 吉林 省 九 台市人 ， 满族 ，
湖 南 中 医 药 大 学 在 读 博 士 ， 医师 ，主要 从 事 心血 管 疾病 的 中西 医结合 防 治
研究。
皮细 胞 ，为 后期 细胞 移植 提供 理论 铺 垫 。 ． ３实验 从血 管 内皮 生长 因子 １ ６ ５基 因成 功后 骨髓 间 充质干 细 胞绿 色荧 光蛋 白的表达 ，从 而 了解血 管 内皮 生长 因子 １ ６ ５基因 的转 染率 ，为 后期 基 因转染 提 供基 础 。 关 键 词： 干细 胞 ；骨髓 干 细胞 ；骨 髓 间充质 干 细胞 ；血 管 内皮生 长 因子 ；血管 内皮 细胞 ；病 毒转 染 ；绿色 荧 光蛋 白； 基 因 转染 ； 国家 自然 科学 基金 ；干 细胞 图 片文章
长 沙市 ４ １ ０ ０ ０ ７ Ｈ ｚ ｄ １ １ ２ ＠１ ３ ６ ． ｃ ｏ ｍ
国家 自然 科 学基金 资 助（ ３ ０ ９ ７ ３ ７ ５ ０ ） ＊ ：加 味丹 参饮 对骨 髓干 细 胞促 Ｉ Ｒ ｌ 血瘀 鼠心 肌血 管 新生 的影 响及机 制 的研 究 ；２ ０ １ ２年湖 南 省研 究生 科研 创新 项 目（ Ｃ Ｘ ２ ０ １ ２ Ｂ ３ ３ ５ ） ＊
中国 组 织 工 程 研 究
第 ７ ７誊 第 ３ ６期
２ ０ １ ３—０ ９—０ ３出 版
血管内皮生长因子复合骨形态发生蛋白-2转染骨髓间充质干细胞修复
西兰大 白兔制作 Ａ ＮＦ Ｈ 模型 ， 然 后随机分为 ４组 ， 分 别转染上述 ４组质粒 ， 减压后 植入 Ａ ＮＦ Ｈ 模型 ， 收集股 骨头标本分 别
做 Ｘ线检 查 、 股骨头组织 Ｈ— Ｅ染色检查 。结果 ： 体外实验显示 ， ＡＬ Ｐ活性 和钙 含量 ， 空 白组 ￣ＶＥ Ｇ Ｆ转染组 ％Ｂ ＭＰ － ２转染
ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ － ２（ ＢＭＰ一 ２ ）ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｅ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ Ｂ ＭＳ Ｃｓ ）ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｅ ａ ｒ ｌ ｙ ａ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ
ｎ ｅ ｃ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｆ ｅ ｍｏ ｒ ａ ｌ ｈ ｅ ａ ｄ （ ＡＮＦＨ ） ｏ ｆ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ｓ ．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ： ＢＭ Ｓ Ｃ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ａ ｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
向骨细胞转化 Ｖ ＥＧ Ｆ复合 Ｂ ＭＰ － ２ 转染 Ｂ ＭＳ Ｃ ｓ 可增强 骨坏死区骨修复和血运重建能力 。 关键 词 血管 内皮生长 因子 ； 骨形态 发生蛋 白一 ２ ；骨髓 问充质干细胞 ； 股骨头坏死 Ｅｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｓ ｔ ｕ ｄｙ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ ＶＥＧＦ － ＢＭ Ｐ－ ２ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ＢＭ Ｓ Ｃｓ ｉ ｎ ｒ ｅ ｐａ ｉ ｒ ｏ ｆ ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｎ ｅ ｃ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｆ ｅ ｍｏ ｒ ａ ｌ ｈ ｅ ａ ｄ ｏ ｆ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ
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慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化周桢杰;李强;李诗鹏;陶旋;马跃刚【摘要】背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义.目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能.方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:①未转染组;②空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;③BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);④BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP).转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:①空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;②转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);③BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);④BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;⑤结果表明,慢病毒介导的hBMP-2和hVEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)025【总页数】6页(P3950-3955)【关键词】骨髓间充质干细胞;骨形态发生蛋白2;血管内皮生长因子165;慢病毒;基因转染;细胞增殖;碱性磷酸酶;干细胞;国家自然科学基金【作者】周桢杰;李强;李诗鹏;陶旋;马跃刚【作者单位】桂林医学院附属医院,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院,广西壮族自治区桂林市 541001【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：慢病毒载体：是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有较强的感染能力。
另一方面，慢病毒载体可将目的基因整合入宿主细胞基因组中，大部分情况下不会因宿主细胞的分裂、分化而失表达，可实现长期而稳定的表达。
血管内皮生长因子：是一类具有肝素结合性的二聚体糖蛋白，具有诱导血管内皮细胞增殖、促进血管生成、增加毛细血管渗透性等作用，也能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
骨组织作为一个高度血管化的组织，血管内皮生长因子在骨折愈合过程中发挥了必不可少的作用。
0 引言 Introduction巨大骨缺损一直是临床上常见的难题，骨移植是其主要治疗方法，但存在感染、免疫排斥等诸多缺点[1]。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是目前研究证实成骨能力最强的诱导因子。
美国FDA已经批准BMP-2和BMP-9应用于临床治疗骨不连、骨缺损。
有学者做了统计，骨形态发生蛋白应用于治疗骨不连、骨缺损，使患者住院率下降，医疗花费减少，但是发现高剂量应用患者异位成骨及肿瘤发生率上升[2]。
因此，多因子联合诱导成骨应运而生，应用最小剂量的外因子形成最优质的工程骨，更符合生理性成骨的方式。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为促血管生成的最强因子，其还能促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化，它与BMP-2联合应用是现代组织工程构建的研究热点。
目前，在利用各种因子形成组织工程骨的研究中，为使各因子达到缓慢、稳定释放的目的，主要是将因子包裹在支架材料中，然后植入动物体内，而利用反转录病毒把目的基因转入种子细胞中再复合支架材料制成组织工程骨的方法相对较少。
慢病毒作为反转录病毒的一种，它可随机将外源基因整合到宿主细胞基因组中，且随着细胞增殖而稳定表达目的基因。
应用慢病毒基因工程方法制备的组织工程骨不仅达到了目的蛋白缓慢、稳定释放的目的，在成本及材料获取上的要求也相对较低，显示了其良好的应用前景[3-5]。
1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年4月至2018年3月在桂林医学院科学实验中心完成。
1.3 材料1.3.1 实验动物清洁级健康3月龄新西兰大白兔1只，雌雄不拘，体质量7 000 g，由桂林医学院动物实验中心提供，许可证号：scxk(桂)2013-0001。
实验中所有处置完全按照动物伦理学标准执行。
1.3.2 实验试剂与仪器慢病毒载体的构建和鉴定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成；DMEM细胞培养基、胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶(四季青)；BMP-2单克隆抗体(北京中杉金桥)；VEGF-165单克隆抗体(Abcam)；流式一抗小鼠抗兔CD44/CD45、CD29(Antigenix)；同型对照小鼠抗兔IgG1k(eBioscien)；碱性磷酸酶染色液(北京雷根生物)；碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物)；流式二抗PerCP标记(Jackson Immuno Research)；CO2培养箱、-80℃超低温冰箱、液氮罐(Thermo)；流式细胞仪(BD)；生物安全柜(苏州苏洁)；倒置相差显微镜(Nikon)；化学发光仪(BIO-RAD)。
1.4 实验方法1.4.1 兔BMSCs的分离纯化及表型鉴定取3月龄新西兰大白兔1只，经耳缘静脉注入麻醉药后固定于操作木板上，消毒皮肤后用无菌骨穿针穿刺双侧股骨干骺端，注射器抽取10 mL骨髓注入15 mL无菌离心管离心(1 500 r/min，5 min)，倒去上清液，加入适量L-DMEM培养基重悬细胞，再加入等体积的Percoll淋巴细胞分离液离心(2 500 r/min，20 min)；在离心管中吸取中间絮物状细胞悬液层至一新的无菌离心管中，加入L-DMEM培养基洗涤1次，再次离心后倒去上清液，加入适量含体积分数为15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的L-DMEM完全培养基重悬，细胞悬液接种于25 cm2塑料培养瓶，置于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱培养；静置48 h后予首次换液，当细胞汇合至80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化，予1∶2传代培养。
倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长情况，细胞传至第3代进行实验，并随机选取第3代细胞制成细胞悬液，等量分装于4支离心管中，分别加入CD44、CD45、CD29的抗体，设置IgG(H+L)为阴性对照，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
1.4.2 细胞转染及实验分组取第3代兔BMSCs进行实验，以感染复数(MOI)为50的Lv-BMP-2/GFP转染细胞，转染后第2天，可见细胞已倍增，取其一半细胞再以感染复数(MOI)为50的Lv-VEGF-165/RFP转染，另一半继续正常培养。
作者前期研究发现慢病毒转染兔BMSCs第3-7天为转染率最佳观察时间[6]。
在首次转染后第7天，第2次转染后第4天，荧光显微镜下观察转染率。
实验分为4组：①未转染组；②空载组：通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞(Lv-GFP，Lv-RFP)；③转染Lv-BMP-2/GFP组(BMP-2组)：转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP)；④Lv-BMP-2/GFP-VEGF-165/RFP组(BMP-2/VEGF-165组)：通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP，Lv-VEGH-165/RFP)。
1.4.3 转染前后Western blot检测目的蛋白表达转染后第3，7，14，21天，各组分别取2×106细胞，提取蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白样品浓度，以每孔30 μg蛋白计算每孔上样体积；以12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%SDS-PAGE)分离，转膜，孵育一抗(BMP-2、VEGF-165单克隆抗体)、二抗(辣根酶标记抗体)行抗体杂交；ECL发光、显影、定影。
1.4.4 MTT比色法检测转染前后兔BMSCs的增殖情况按实验分组，每组以2×103/孔接种96孔板，每组设置7个复孔，共接种7板，每隔24 h随机取1块96孔板，每孔加入20 μL MTT工作液(5 g/L)，37℃避光孵育4 h后移去上清液，每孔加150 μL二甲基亚砜，37℃摇床低速摇晃10 min，酶标仪设置波长为490 nm测定吸光度值(A值)，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.5 转染前后碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶水平检测细胞转染后第14天，根据碱性磷酸酶染色试剂盒(改良Gomori钙钴法)(北京雷根生物)和检测试剂盒(南京建成生物)说明书步骤操作。
1.5 主要观察指标①骨髓间充质干细胞形态；②各组细胞中hBMP-2和hVEGF-165的表达；③各组细胞的增殖活性；④各组细胞的碱性磷酸酶活性。
1.6 统计学分析使用SPSS 20.0软件对各组数据比较进行成组设计的F检验，所有参数均用±s表示，P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results2.1 原代细胞的分离纯化与鉴定结果原代细胞分离后于培养箱内静置48 h，再给予首次换液，镜下可见散在簇状分布的BMSCs，呈短梭形、三角形。
随培养时间延长及数次换液后，杂质细胞可被洗去。
原代BMSCs培养7 d左右，细胞可达80%-90%融合，为防止细胞老化给予传代培养。
传代后细胞分布均匀，排列呈漩涡状、鱼群状，细胞呈短梭形、三角形，椭圆形胞核明显，有的可见双核(图1)。
流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代BMSCs表面标志物CD44、CD29阳性表达，其阳性率达90%以上，CD45阴性表达，结果符合BMSCs特征。