微生物次生代谢产物研究方法-3

2）中压液相色谱系统（ Medium-pressure LC ）
适用样品：100 mg～100 g 压力5～40 bar 固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺、反相硅胶等各种分离 材料，较细较均匀颗粒（硅胶常直接用薄层层析材料（粒 度15um，约700目）），分辨率很高，但常压下基本流不 动，在中压下才有较快流速。有一定程度的吸附。 均配有自动收集器、紫外监测器和压力输液泵，有的 还可联机监控、操作和分析。如BUCHI公司生产的中压液 相系统，还配有一系列规格的耐压玻璃－塑料加强色谱柱， 其中有些为预制柱，如反相柱，有些可自己装填分离材料。 还可选配其它类型的监测器如示差折光监测器。
固定相：
一般为 化学键合 固定相
附：手性柱
检测器
紫外检测器（UVD）
（10-9 g/ml）
固定波长（254nm） 任意可调波长（但只能同时用一种波长检测）
专用型检测器
光电二极管阵列型（PDAD）
可被激发产荧光的物质 离子、氧化还原物质
可对每一个峰同时 连续波长扫描，得 到时间、吸光度、 波长的三维光谱－ 色谱加和图
蒸发光散射检测器（ELSD）
（10-8 g/ml，流动相需挥发性，且不可含盐，有样品损失）
HPLC用途



指纹图谱分析（成份展示、比较与定性） 定性与定量分析（如比较鉴别、含量测定） 色谱条件选择 制备分离 纯度分析
传代菌株次生代谢产物稳定性的指纹图谱分析 菌株比较、发酵条件比较等等
分析型、半制备型、制备型HPLC
第三讲 色谱学原理与实际应用（2）
－－非常压色谱
减/加压的目的：
实现快速分离或为适应分辨率高但流速慢的小粒度固定相

减压柱 中低压柱 高压液相色谱 气相色谱



3.1 减压柱层析（抽柱 Vacuum Liquid Chromatography)
1 简介 简便、实用、快速的层析方法，其基本原理与吸附层析相同，适 用于较大量的制备性分离或提取物的极性分段划分。（粗分） 2 操作
等度/梯度 自动/手动
和气相色谱法的基础上发展起来 的，在色谱理论方面没有本质的 差别。但由于采用了高效固定相、 高压输液泵、高灵敏度检测器等 新技术，因而有了更高的分离效 率并实现了自动化。
100~500 bar
各种固定相 多种选择
六大系统：输液、进样、色谱柱、检 测、记录与数据处理、（收集）
生产商：Agilent、Waters、岛津、Dionex、国产
加大水的比例，可改善分离度，但分离周期也相应拖长
降低流速也可以提高塔板数，改善分离度 延长梯度时间也可改善分离度 更换流动相系统（分离因子)
MeOH H2O
困难样品：多元梯度
ACN
THF
小结
谱峰拖尾

双峰
双保留效应 柱坏 污物在柱进口处堆积 样品超载 样品溶剂不合适（析出） 缓冲不足 重金属污染
分析性和半制备型用于制备分离）
6. 等度洗脱与梯度洗脱 7. 多次进样的洗脱流程的一般组成（预平衡；分离洗脱阶段、
洗柱阶段、平衡阶段）

8. 合适洗脱流程的摸索（先连续梯度，再缩小范围找到合适的等
度或梯度范围；尽量缩小非分离时间段， 兼顾分离效果与分离周期）
9. 柱子的保养与储存（异丙醇/氯仿＝1：1，纯乙腈保存）

3.4 气相色谱应用简介
气相色谱：流动相为气体（称为载气）。
按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
气固色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。 固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。
气液色谱的固定相: 由 担体和固定液所组成。
固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。 气固色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程； 气液色谱的分离机理： 气液两相间的反复多次分配过程。
2. 梯度或等度
举例：等度/梯度洗脱的选择
1. 等梯度洗脱试验
3. 优化
RP-HPLC分离效果的优化

加大洗脱强度
要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱 效高；再就是谱带间距离大。 Rs=(t2-t1)/[(1/2(w1+w2)] t1，t2 为二相邻谱带间的保留时间，w1和w2 为它们 基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs≥1.5时 为完全 分离。 当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽， 更的办法好是用半高处的相应峰宽1和2： Rs= 1.18(t2-t1)/ (1+2) Rs≥1.25在一般情况下，能达到≥99％的分离度。 Rs≤1.0时 定量分析一般精密度较差。
相对保留值：在相同色谱柱及相同操作条件下，组分的调整保留值与标准物调整保留值的比值

定量分析
峰面积（高）与含量之间的关系

1. 峰面积、峰高的测量 色谱工作站自动计算积分 2. 定量方法 面积归一化法 （校正因子） 外标法：标准曲线法，外标一点法 内标法：标准曲线法，内标一点法
（类似物作为基准物）
a b c VLC柱（或布氏漏斗）、磨口收集瓶（或抽滤瓶）、真空泵。 装柱（抽实） 上样（一般干法，抽实） 洗脱（低极性逐渐到高极性的梯度洗脱，每次都抽干，类似 pTLC多次展开的过程） 收集
d
3 注意事项
a 真空度 20~70 mmHg b 洗脱剂极性 由小到大梯度递增 c 交叉色带
3.2 中低压柱层析
荧光检测器（FLD）
（10-12 g/ml, 用途窄）
电化学检测器（ECD）
（10-9 g/ml, 用途窄）
示差折光检测器（RID）
通用型检测器
（对溶剂本身有响 应，噪音大，基线 漂移厉害，不适合 梯度洗脱）
（低，？g/ml）
利用样品池和参比池之间折光 指数的差别来对组分进行检测。 折光指数的差别与组分的浓度 成正比
2 操作 a b c d
装柱（氮压） 上样（干法或湿法，样品柱） 洗脱（所有管材均耐压耐溶剂） 收集（较智能化自动收集，等时间或按峰收集）
3.3 高压液相色谱系统（High Pressure LC， High Performance LC）
化合物分析与制备分离的强
大武器
高压液相色谱法是在经典色谱
制备型
5mg－1g 5-30um
柱尺寸
直径20-40, 长 100-300 mm
最大压力 流速 分辨率 检测器流量池体 积、池压
100bar 30-100ml/min 相对低
30ul
RP-HPLC使用方法



1. 2. 3. 4. 5.
溶剂需超声脱气 样品的前处理（抽干，除杂: 滤膜，离心；预柱/小反相柱） 样品溶成合适浓度 手动进样的操作（六通阀） 进样量的摸索（在保证色谱峰分离效果的前提下尽量多进样，特别是
应用（常气相色谱－质谱连用）：
1. 2. 3. 4. 挥发性成分分析 脂肪酸成分分析（甲酯化） 氨基酸成分分析（甲酯化） 结构鉴定中对某些反应产物的定性
化合物色谱分离手段小结
富集/除杂/粗分段：大孔吸附树脂、活性炭（克级～公 斤级） 粗分离/分段：常压柱层析（粗硅胶）、减压柱、闪式 柱、干柱（克级～公斤级） 细分离：常压柱层析（细硅胶及其他正相或反相固定 相、凝胶等）、中压液相色谱（各种固定 相）、低压色谱等 （毫克级～克级） 最终纯化：常压柱层析、中压液相色谱、低压色谱、制备薄层 层析、HPLC等 （毫克级～克级）
2）低压柱
适用样品：10 mg～1 g 压力小于5 bar 固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺、反相硅胶等各种分离 材料，普通粒度，因此在低压下也有较快流速。吸附也不 是特别严重。 一般配有自动收集器、紫外监测器和低压恒流泵/氮 气瓶，有的还可联机监控、操作和分析。 有些商品化的预制色谱柱，如E. Merck公司产的 Lobar柱系列产品（粒度150～250目），其分离效果有时 可接近HPLC的分辨率，但载样量远超过制备型HPLC。 也可自己装填。
GC特点与在天然产物研究中应用
特点：
（1）分离效率高： 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2） 灵敏度高： 可以检测出μ g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量 （3） 分析速度快： 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广： 适用于沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 不足之处： 不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。 被分离组分的定性较为困难。
利用PDAD检测器检验化合物或色谱峰的纯度 发光二极管阵列检测器可记录测量色谱峰每一点 的连续波长紫外－可见光谱图，如果该峰为单一 成分，则其峰前、峰顶及峰后每一点的紫外光谱 图扣除浓度因素外应该是完全一致的；而且经过 函数变换和图形化显示，可表现为整个色谱峰对 应一个规则的长方形，纯度越好长方形越规则。 如果换用差别大的洗脱梯度，该峰仍呈现此现象， 则基本可确定为纯化合物。（例外：难分离化合 物，如手性异构体）
超载，析出，柱坏
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定性与定量分析 定性分析：
1. 保留时间（在相同色谱条件，包括柱温相同的条件 下，与已知对照比较） 2. 峰高增加（把已知物加到试样中，看组分峰的增高 给予定性） 3.利用资料数据定性：目前资料数据很多，已有专著和 数据库。这些数据，常以相对保留值、比保留值、保留指 数等形式提供。 4. HPLC-MS,HPLC-NMR,HPLC-FTIR等联用技术

1）快速色谱（ 闪式柱层析，Flash Chromatography ）
1 简介 柱短（20cm），分离时间短，快，分离效率高。 闪式硅胶（Flash Sicica gel，230～400目，球形） 加压层析 约2 bar 10mg-10g 样品 10-15min 2 用途 常用于快速分段/初步纯化，尤适于常压柱上长时间分离过程中易分解的 化合物，拖尾少 3 操作 与普通柱层析法基本相同。 a 装柱：湿法 干法（20cm） b 上样：拌样 湿法 c 洗脱：Rf 0.2-0.3 1atm=10bar=106Pa=760mmHg 加压
分析型
载样量 填料粒度 ug --- < 5mg 3-5um 直径4.6、5、 2mm, 长250300mm左右 400bar 0.01~10 ml/min 高 ＜10ul，＜ 70bar
半制备型
5mg－100mg 10um 直径8～10mm， , 长250-300mm 左右 200bar 0.01～80ml/min 较高 ＜10ul，＜ 70bar
减小洗脱强度， 更换系统，改性剂




分离度与溶剂强度的关系

Rs=(1/4)(-1)N0.5[k’/(1+k’)] k’为容量因子；为分离因子；N为理论塔板数。 对于RP柱，溶剂极性增大，k’ 增大，Rs增大，满意的范围 2<k’<5 在反相HPLC中溶剂极性会随着水/有机流动相中的水增加而增大，洗 脱强度变小，分离度提高，见下页图。