电化学发光免疫分析的原理
发光免疫分析的原理、优势和值得注意的问题
灵敏度较高
铕（Eu）、镝(Dy)、 灵敏度较高、试剂较
钐（Sm）、铽
稳定
（Tb）、等络合物
脉冲光源激发
钌(Ru)的络合物脉 冲电场激发
工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移
试剂成本高、发光时间短测量方式复杂（积 分法）需原位进样(In Situ Injector)仪器 成本及维护费用较高试剂成本较高 测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流 动池）仪器成本及维护费用高环境及样品中 同类元素可导致本底干扰
发光强度（X）
单光子计数式发光检测仪
单光子计数器
样品运动/定位装置 原位注射泵
计数/贮存器 打 印 机
程控高压
计
算
控制器
机
程控自动门锁及检测装置
发光仪执行模块
发光仪控制模块
光生物学技术的应用范围
军事侦测 公安稽查 卫生检疫 药物筛查 医学诊断 环境检测 航天遥感 生命科学
Hook(前滞)效应
线性范围
待测物浓度（X）
竞争法的剂量--反应关系曲线
信号强度（ Y ）
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值
功能灵敏度： 测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度
线性范围： （分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度 相关系数≥0.99的曲线范围
对甲低的诊断价值依次为：FT4=TSH＞TT4＞FT3＞TT3
但FT3 、 FT4灵敏度要求高，且易受干扰 发光法提高了灵敏度，使得其临床应用普遍性超过TT4和TT3
第一代（放免）
第二代
第三代
两步法 操作时间长
灵敏度差 准确性差
化学发光免疫分析
糖尿病
Albumin C-peptide Insulin
唐氏筛查
PAPP-A free βHCG HCG＋β AFP
心肌标志
骨标志
肝纤维
CK-MB
ß-Crosslaps
LN
Digoxin
25-(OH) Vit. D
HA
Digitoxin
Intact PTH
PIIINP
Myoglobin
Intact PTH
试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由
于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一 个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化 学发光相比，有效期长可以降低使用成本， 利于推广应用。
梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
3 化学发光免疫分析的优越性
➢ 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
种类
方法
检测原理
酶联免疫
酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果
免疫 化学发光
诊断
将抗原抗体同样本结合，由磁珠捕捉反应物，加入 发光促进剂加大反应发光速度与强度，进而诊断
根据镧系元素螯合物发光特点，用时间分辨技术测 时间分辨荧光
量荧光，检测波长和时间两个参数进行信号分辨
分子 诊断
PCR 基因芯片
DNA高温变成单链，低温互补配对链合成
激发态ν
的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出
光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样
品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测
能量
h.ν
物质的含量。
基态ν0 梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析篇一：化学发光免疫分析方法化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
免疫检验质控PPT医学课件
内容
第一节 分析前质量控制 第二节 分析中质量控制 第三节 分析前质量控制
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概述
质量保证 是临床实验室为证明提供给患者临床诊 疗或临床实验研究数据的有效性而采取的一系列措 施，涵盖了实验室内进行检测前后的所有活动。
临床免疫学检验既有手工操作、定性或半定量的试
验，也有以各种新技术、新方法为基础的自动化仪
一、检验项目的申请 检验申请是检验流程的重要环节，其信息规范性
与完整性对后续检验流程十分重要。申请有纸质 和电子形式或两者同时使用等方式。
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（一）申请单格式和填写
按照国家相关规定，检验申请单基本信息应至少包 括：受检者唯一性标识，如姓名、性别、年龄、科 别、病房、门诊号／住院号等；临床诊断或疑似诊 断；标本类型；检验项目；送检日期（年、月、日） 及标本采集时间与标本接受时间；申请者唯一标识 （医师签字）；收费／记账以及检验号等。检验申 请单的填写内容要规范、完整，以保证为后续检验 流程提供必需的信息。
三、标本的采集、传送与保存
（一）标本的采集
对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要 注意收集时间及体位对测定结果产生的影响。如可 的松在早晨4:00～6:00之间，会有一峰值出现；生 长激素、促黄体激素 (LH)和促卵泡激素(FSH)均以 阵发性方式释放；当从卧位变为站立位时，血清中 肾素活性将出现明显增高；治疗药物的监测，应根 据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。
5．靶值或预期结果已定。
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应选用制造商提供了溯源性的产品
为保证临床免疫检测结果的可比性，针对已建立国际标准 的检测项目，应要求所选用检测系统的制造商提供溯源性 文件，即证明通过该检测系统的检测结果，通过校准品可 逐级溯源到国际参考物质(international reference material)。通常国际参考物质为一级标准品，国家标准 品则为二级标准，可溯源至一级标准，二级标准可用来维 持校准。三级标准品则通过与二级标准的比对而来，为通 常使用的商品校准品。
电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析是一种在电极表面由电化学引发的异性化学发光反应，是电化学和化学
发光两个过程的完美结合。
电化学发光免疫测定是电化学发光和免疫测定相结合的产物，是
目前非常先进的标记免疫测定技术。
电化学发光技术主要技术：
1. 三联吡啶钌标记技术；
（1）循环使用，不会被消耗，电极表面的氧化还原反应循环进行，测定信号无限循环放大，检测灵敏度大大提高
（2）其盐是很稳定的水溶性化合物，试剂的稳定性好，效期长
（3）N 羟基琥珀酰胺（ NHS ）酯能与蛋白质赖氨酸的ε-氨基或核酸上的氨基形成稳定的酰
胺键，应用广泛，宽广的检测菜单
（4）惰性元素，非放射性元素，稳定
（5） [Ru(bpy)32+]和TPA ，无电压的情况非常稳定，确保反应结果的准确性
2. 链霉亲和素—生物素技术；
（1）特异性强且结合紧密，灵敏度高
（2）一分子SA可与四分子B相结合，增大了抗体结合量，灵敏度高
3. 磁性微粒子技术；
（1）反应面积大，结合量增大
（2）反应在近乎液相中进行，信号均匀精确
（3）分离方便迅速，无背景干扰
4. 电启动的化学发光反应。
（1）实现了结合相和游离相的完全自动化分离
（2）彻底清洗，反应易于控制
电化学发光技术特点：试剂稳定、测量范围宽，灵敏度高、特异性优异、检测菜单丰富、准
确性好，精密度高、操作便捷；。
电化学发光的基本原理
电化学发光的基本原理电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。
分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。
ECLL的测定模式与ELISA相似。
基本原理：发光底物二价的三联吡啶钉及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。
氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。
医学教育网搜|集整理这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。
电化学发光是化学发光方法与电化学方法相互结合的产物，是指通过电化学方法来产生一些特殊的物质，然后这些电生的物质之间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生的一种发光现象。
电化学发光保留了化学发光方法所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同物时具有许多化学发光方法无法比拟的优点，如重现性好、试剂稳定、控制容易和一些试剂可以重复使用等优点，广泛地应用于生物、医学、药学、临床、环境、食品、免疫和核酸杂交分析和工业分析等领域。
在21世纪中必将继续为解决人类面临的各种重大问题发挥更加显著的作用。
因此有必要对电化学发光在分析中的应用有更加全面的了解。
电化学发光的应用1、电极表面活性分布的表征利用电化学发光成像法可以很好地观察电极表面电化学发光强度的分布情况，而电化学发光强度对电极表面的活性具有很大的依赖性，因此利用电化学发光成像法可以直观地反映电极表面活性分布。
该方法是由Engstrom等于1987年提出的，他们观察到在新抛光的玻碳电极上电化学发光强度分布十分均匀，而在环氧树脂浸渍过的网状玻碳电极上，电化学发光强度的分布不均匀，通过与其它方法相对照，发现电化学发光强度分布能够很好地反映出电极表面活性分布，并且具有微米级的空间分辨能力。
电化学发光技术
电化学发光技术电化学发光技术是一种基于电化学原理的发光技术，通过在电解质溶液中施加电压，使得电极上发生氧化还原反应，从而产生发光现象。
该技术具有许多优点，如高效、可控性强、响应速度快等，因此在许多领域得到了广泛应用。
一、电化学发光技术的原理电化学发光技术是通过电化学反应中产生的激发态物质的光致发光来实现的。
在电解质溶液中，通过施加电压，使得电极上发生氧化还原反应，激活溶液中的发光物质，从而产生发光现象。
这种发光原理与常见的化学荧光和磷光发光原理有所不同，具有独特的优势。
1. 高效：电化学发光技术能够将电能直接转化为光能，具有高效能转换的特点。
2. 可控性强：通过调节电解质溶液的组成、电压的大小和施加时间等参数，可以精确地控制发光的强度和颜色。
3. 响应速度快：电化学发光反应的响应速度非常快，可以实现毫秒级的响应时间。
4. 稳定性好：电化学发光材料具有较好的稳定性，不易受到环境温度、湿度和氧气的影响。
5. 可重复使用：电化学发光材料可以反复使用，不会因为发光过程中的消耗而失去活性。
三、电化学发光技术的应用领域1. 生物医学：电化学发光技术在生物医学领域中得到了广泛应用。
例如，可以用于生物传感器、免疫分析和基因检测等领域，实现快速、灵敏的生物分析。
2. 环境监测：电化学发光技术可以用于环境监测领域，如水质检测、大气污染监测等。
通过将电化学发光材料与特定的分析物相结合，可以实现对环境污染物的快速检测和定量分析。
3. 光电子器件：电化学发光技术可以应用于光电子器件中，如有机发光二极管（OLED）和有机太阳能电池等。
利用电化学发光材料的发光特性，可以实现高效、低能耗的光电转换。
4. 光催化材料：将电化学发光材料与光催化材料相结合，可以实现光催化反应的高效率。
例如，通过改变电解质溶液中的发光物质，可以实现对特定波长的光的高效吸收和利用，提高光催化材料的效率。
四、电化学发光技术的发展前景随着科技的不断进步和对高效能发光技术的需求不断增加，电化学发光技术具有广阔的发展前景。
电化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析
Chemiluminescence immunoassay (CLIA)
• 化学发光分析----根据化学发光反应在某一时刻的发光强 度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方 法，成为化学发光分析。
• 化学发光免疫分析----是集灵敏的化学发光技术和特异的 抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。
• 化学发光免疫分析的特点：灵敏度高、特异性高、分离简 便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。
化学发光免疫技术的类型
按发光剂不同分为
1. 发光酶免疫测定（Chemiluminescence enzyme immunpassay CLEIA）
2. 化学发光免疫测定技术（Chemiluminescence immunoassay CLIA）
活性。
酶1,促酶反促应反的应发的光发底物光底物
• 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物 • CLEIA中常用的酶有HRP和AP • HRP的发光底物有鲁米诺、对一羟基苯乙酸 • AP的发光底物有AMPPD、4—MUP（荧光底物） 特点：可做标记物，也可以做过氧化物酶的底物
1.鲁鲁米米诺诺
对一羟基苯乙酸（HPA）
进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化 学发光的现象. 它包含了电化学和化学发光两个过程.
ECL和CL的区别在于:ECL是电启动发光反应,而CL是通 过化合物混合启动发光反应,因此ECL反应便于精确控制, 具有灵活性.
电化学发光剂
三联吡啶钌的特点
ECL分析中采用三联吡啶钌作为标记物，其活化衍生物是 三联吡啶钌+N羟基琥珀酸胺脂（NHS），该衍生物具有水 溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定， 而且避免了本底噪声的干扰。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
吖啶酯化学发光系统-CH3-HOO-C=0-OH-光子+C02+-R
碱性磷酸酶化学发光系统-金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统-OCH3-AP-0P032-碱性磷 酶及其衍生物的化-·光子477nm
化学发光的检测类型-化学发光按化学反应类型分为：-◆直接化学发光（非酶促化学发光-吖啶酯系统-●-异鲁米诺 统-◆间接化学发光（酶促化学发光-·辣根过氧化物酶一鲁米诺系统（HRP系统-碱性磷酸酶一金刚烷系统AP系统 其它-电化学发光
板式化学发光-,适合流行病调查、疾病预防与控制、-体检中心，以及医院血站等大样本检-测项目的使用（比如HI 、TP、HCV和-乙肝两对半等。-通常采用96孔白色不透明微孔板进行包-被，不方便随到随测和医院急诊；-对 定量检测需要做标准曲线。-◆-国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光-采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；-可以随到随测，适用于医院急诊；-定量检测的标准曲线存 在试剂条形码中，-可在2-4周内直接使用。-国外厂家全部是管式化学发光系统
间接化学发光-以碱性磷酸酶系统为例-洗涤清除团-间接化学发光：用参与发-◆》回+-光反应的酶来标记抗原或体，免疫反应后，加入-抗体包被-的磁珠-标记抗体-双抗体夹心复合物-发光底物，测定发光体系-的发光强度来进 抗原或-◆可茶-抗体的检测。-AMPPD-AMPD发光-两大反应体系：-辣根过氧化物酶-HRP系统：氧化还 反应，稳定性差-·源德、科美、安图-碱性磷酸酶（AP系统：水解反应，灵敏度较高-●-贝克曼：Access1 Access2,DXI600、DXI800-西门子：mmulite:1000,Immulite2000-达 生物：AULIN200
免疫学检测-◆-免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、-抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手 及分子-生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：-抗原抗体的检测技术-免疫细胞的检测-细胞因子的检测-免疫 关基因分析-免疫标记技术-免疫PCRIM-PCR技术-杂交瘤技术与T细胞克隆技术
电化学发光免疫分析方法
免疫学检测历史演进
• 放射免疫检测（现仍普遍使用于县级以上医
院）；
• 酶联免疫检测（各临床机构普遍使用）； • 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测
技术
发光分类
• 光照发光:发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激
发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光（荧光）。
• 生物发光：指发生在生物体内的发光现
• 直接化学发光免疫分析 • 化学发光酶免疫分析 • 电化学发光免疫分析
电化学发光
• 电化学发光（ECL）是通过在电极上施加一定
的波形电压或电流信号进行点解反应的产物之 间或与体系中共存组反应产生化学发光的现象
电化学发光剂
• 定义:指通过在电极表面进行电化学反应而发出
光的物质
• 特点： • 反应在电极进行 • 化学发光剂：三联吡啶钌 • 电子供体为：三丙胺Βιβλιοθήκη 游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）
介绍：T3是由甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素。
FT3约占T3的0.5%,能透过细胞膜进入组织细胞，发挥 生理效应，其浓度与组织中的三碘甲状腺原氨酸浓度 一致，也与机体代谢状态一致，对非甲状腺疾病也有 诊断价值。
临床意义：
增高：见于甲亢、三碘甲状腺原氨酸型甲状腺功能 亢进。
化学发光分析
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发
光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为 化学发光分析。
化学发光分析优点
• 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发
光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响 有很高的灵敏度，
• 并且不像放射分析那样存在环境污染和健康危
害
化学发光分析缺点
增高：原发性甲状腺功能减退、伴有甲状腺功能低下的桥 本病、亚急性甲状腺炎恢复期。摄人金属锂、碘化钾、促 甲状腺激素释放激素可使促甲状腺激素增高。 降低：垂体性甲状腺功能低下、非促甲状腺激素瘤所致的 甲状腺功能亢进，以及摄入阿司匹林、皮质激素及静脉使 用肝素可使促甲状腺激素降低。
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电化学发光免疫分析的原理
电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，简称ECLIA）是一种快速、准确、高灵敏度的新型生物分析技术，它主要用于检测抗体、抗原、药物、细胞因子以及其他生物分子，在临床医学和农业生物学中得到广泛应用。
原理
ECLIA的原理是利用免疫反应原理检测抗体和抗原的相互作用。
首先，将待检样品和相应抗体在被探针载体上分子结合，形成抗原-抗体复合物，探针载体上的抗原结合的抗体称作“特异性抗体”，其包含一种特异性的发光活性物质；然后，使用适当的电化学方法，将抗原-抗体复合物中的发光活性物质进行电化学激活，使其发出可测量的电化学信号，从而实现抗体和抗原的检测。
ECLIA的特点
ECLIA技术具有很好的灵敏度，可以快速准确地检测到极低的抗体和抗原；它的发光信号可以动态检测，可以测定蛋白质结构的动态变化；它还具有操作简便、反应迅速、耗费低廉等特点，使它成为当前应用最为广泛的生物分析技术之一。
应用
ECLIA技术已经在临床医学和农业生物学中得到广泛应用，例如：检测慢性病如糖尿病、肝炎、HIV感染、癌症以及其他疾病的抗原、抗体或其他生物标记物；在农业上，可以用来检测农作物的病原体和有害物质，以及动物的有害营养物质的精确浓度；同时，它可以用来
检测药物的浓度、活性物质的含量和活性程度等。
结论
ECLIA技术是一种快速、准确、高灵敏度的新型生物分析技术，已经在临床医学和农业生物学中得到广泛应用。
ECLIA的原理是利用免疫反应原理检测抗原和抗体的相互作用，使用适当的电化学方法，将抗原和抗体复合物中的发光活性物质进行电化学激活，使其发出可测量的电化学信号，从而实现抗原和抗体的检测。
ECLIA技术在临床医学和农业生物学中具有重要的应用价值，相信在不久的将来ECLIA 技术将成为现代生物分析技术的主流。