细胞培养记录

细胞培养记录

1.细胞房的打扫

a.擦拭房间内所有物体的表面，地板（配巴士消毒液：将巴士消毒液滴到自来水中然后用干净的抹布擦拭操作台然后用其他抹布擦拭地板和冰箱，桌子的外表面）以及清洗拖鞋，拖鞋洗过后用酒精杀毒。

b.无菌操作台用大量的酒精喷洗然后用无屑纸巾擦拭，培养箱(电源关掉)拆卸用酒精喷洒清洗，并用无屑纸擦拭（注不能用抹布和卫生纸），然后将架子放在进擦拭赶紧的操作台面上（注意架子要正反用紫外杀菌45min）。

c.将培养箱的门打开，开始紫外杀菌1h。

d.一切就绪后关掉紫外，工作台送风30min

e.培养箱中的加湿器要用高压灭菌过的超纯水，然后打开培养箱（T=37℃，CO2=5.5%）

2.原代细胞的培养

前期准备：原代细胞取回来后不要急于换液（因为细胞在取回来的途中受到外界干扰要待它生长稳定后在开始换液。时间上的掌握是：取回来的第一天不用换，第二天一定要换液。）

开始换培养液：

a.开始操作前要开紫外30min，然后送风15min，进入细胞房里后全身喷洒酒精。

b.取4个离心管标记为A,B,C,D（进入工作台面前卷起衣袖，带上手套开始喷洒酒精杀毒，手臂也要喷）用酒精喷杀毒然后进入工作台，原代培养瓶杀毒平放在工作台上（在取培养基的过程中可以将培养基竖起来取完后再横放），用5ml的枪头从原代培养瓶中移取5ml的培养基分别放到4个离心管中，然后再向这4个离心管中各加5ml的新完全培养基（即加有双抗和牛血清）-在加的过程中有气泡不会有影响的-{加旧的培养基的目的是：买回的细胞所处培养基和我们自己的培养基型号可能不一样，为了防止细胞不能快速适应新的环境}-------注在转移的过程中如果培养基滴到工作台上要迅速擦干净，不然快速用酒精喷洒再用无屑纸擦净：因为培养基会快速滋生细菌。PBS,MTT就无所谓但还是要擦净。

c.将原代培养基倒掉，然后将其平放在桌面上(注：有细胞的一面在下面)盖上瓶盖。

d.开始消化。用5ml的枪头移取（取枪头时用灭过菌的镊子取，并按上，然后稍微用手按紧，移液枪可以不用酒精杀毒）5ml的PBS，轻轻喷入瓶中，切务使很大的劲防止伤到细胞（枪头可以伸进去但最好不要碰到壁），紧接着轻轻摇晃，再将PBS倒掉，然后重复上述操作（即PBS洗两次，主要是洗培养基）

e.加胰酶。移取3ml的胰酶按上述方法喷入原代培养瓶中，轻轻摇晃，拿出来到显微镜下观察（观察前显微镜用酒精杀毒同时原代培养瓶也要用酒精喷）看细胞的生长状况，消化1-2min后将胰酶轻轻倒掉。

f.移取培养基。从A中移取5ml的培养基到原代培养瓶中轻轻吹打，然后将原代培养瓶中的培养基移取到培养皿中标记为1，然

后从A中移取少量的培养基到1中，然后晃动，让培养基覆盖

在底面。（因为细胞贴壁的速度很快）

注：工作一段时间后工作台要用酒精杀毒。

g.移取完毕后，再在显微镜下观察原代培养瓶中细胞情况，如果还有细胞则需要再次重复上述操作。-加2次PBS洗-倒掉-加胰酶消化2-3min-显微镜观察。

注此处离心的目的是：G步骤消化时间过长导致一部分细胞已经脱落所以需要离心，不能直接倒掉。

h.离心。向原代培养瓶（含有3ml的胰酶）中加入3ml左右的培养基轻轻吹打2min，然后将原代培养瓶中的培养基移到干净的15ml的离心管中，紧接着向原代培养瓶中加入一定量的PBS——到显微镜下观察细胞量——再吹打注每一面都吹打，然后移到离心管中。再次向原代培养瓶中加PBS吹打-显微镜看-移入到离心管中，然后用PBS定容到15ml（因为PBS的浓度小对细胞

损伤不大）

i.开始离心。注意学会用离心机，放入离心管前要上下倒置一下使离心管中的浓度均匀，对称的离心管里放水即可，离心速度为800/900r/min，时间5min（注不能旋太久，对细胞有损伤）

j.转移细胞。从B中取一定量的培养基到培养皿2中

离心管中的细胞如果未完全沉淀下来时，将上方的培养基倒入到另一个离心管中，向装有细胞的离心管中加入一定量的培养基然后轻轻移取到培养皿3中，用1ml的枪头轻轻吹打，将细胞分散开来，然后从3中移取一定量的培养基到2中，接着从B中取

一定量的培养基放入到3中，摇晃。

k.将再次离心的离心管上方的液体倒掉，然后从B中移取少量的培养基到离心管中吹打-移取到2,3培养皿中-在显微镜下看培养皿-然后放到恒温箱（恒温箱的门不要开的很大。）

注：原代细胞需要传两次才可以冻存（这样细胞才可以长的稳定。）3.换培养液。一般刚传的细胞，第二天要开始换液，然后再过两天换液，后面每天换一次液，总共培养4天左右。

a.吸去培养液-用PBS洗一次。

b.加10ml培养液-放入恒温箱。

4.传代。

倒掉旧的培养基——用PBS洗——加胰酶消化——倒掉胰酶——加2ml的培养液冲落贴壁的细胞——在显微镜中看——将上

述的细胞液分别装在两个新的培养皿中——分别吸取10ml的培养基到每个新的培养皿中——编号。

然后按上述的方法一样培养，时间上也一样。然后再传代。总共传两次。最后冻存，并留下自己需要的几盘，剩余的开始冻存。

4.冻存。

a.现在显微镜下观察细胞是否长到80%。

b.移取6ml的旧培养基分装在2支15ml的离心管，其余的都倒掉。（以两盘为标准）

c.加PBS洗2次。

d.每盘加3ml的胰酶消化3min左右，显微镜下观察细胞的脱落状况，（这个胰酶不需要倒掉因为消化时间有点长防止一部分细

胞已经在溶液中）然后每盘中加3ml的旧的培养基终止消化，摇晃，吹打，吹打的时间不宜过长，防止损伤细胞。然后将细胞液移入到离心管中。

e.加3ml PBS吹打，显微镜下观察，然后移入离心管中，然后

定容到15ml。

f.将这两个离心管放入离心机开始离心——倒掉上层清夜（注不能用移液管吸防止将细胞吸走。）

g.每支离心管中加720ul的完全培养基（假设每个离心管中所剩的细胞液有80ul）轻轻振动使细胞扩散均匀然后转移到5ml的EP管中吹打使之混合均匀。

h.在向EP管中加入200ul的（DMSO和胎牛血清的混合液

V:V=1:1）轻轻吹打1-2下。

i.冻存管的容积500ul。一般每盘传3支这样一支有330ul，若细胞长的不是很满的话就传2支，这样每支有500ul（可以将前面的培养基加的少点）

j.贴标签：例如L929+代数（3）+自己的名字(zjp)+日期（11.10.24）并用封口膜将口封住，并将标签缠住防止冻存时冻掉。

k.逐级冻存。将冻存管放在装满碎冰的泡沫盒中15-20min然后在-20℃两个小时，然后-80℃过夜，拿过来的过程也要放在

碎冰中不能直接拿过来。最后放在液氮罐里。

5.细胞复苏。

a.做之前杀菌，通风，将培养基放在37℃待其温度合适。

b.工作台杀菌。

c.取细胞防止液氮滴到脚上。取1ml的培养基放入冻存管中待其融化，然后将细胞移取到培养皿中接着再取少量的培养基到冻存管中摇晃下再移取到培养皿中，然后再取10ml的培养基到培养皿中摇晃待其均匀——显微镜下观察细胞的生长——将培养皿

放入恒温箱中，放入前要用酒精杀毒。

d.收拾桌面，培养基用封口膜封住，杀菌放入冰箱中。垃圾袋里最后倒入点巴士液然后扔到厕所。

6.细胞培养（上面有这个操作）培养4天。

7.种板

a.倒掉旧的培养基

b.用PBS洗两遍

c.加3ml的胰酶消化.

d.吸掉胰酶

f.加3ml培养基吹打，然后再加8ml的培养基稀释的11ml使之

分散均匀，然后向96孔板的每个孔中加100ul的细胞液。然后放在恒温箱中培养（最长时间48h）

8.配药。

根据自己药品的载药量及释放率来取样。

举一个例: 取载药样品12.2mg到5ml的EP管中---向里加入2ml 的完全培养基——用0.2ul PN4612号过滤头过滤到另一个杀

过菌的EP管中贴上标签A—从A中用1000ul的移液枪移取

700ul到1.5ml的EP管B中——再向EP管B中加入700ul的完全培养基——然后逐级稀释——将稀释后的EP管分别用封口