Marc145细胞培养和维持

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稳定高效表达猪CD163的MARC-145细胞系的构建与鉴定中期报告

稳定高效表达猪CD163的MARC-145细胞系的构建与鉴定中期报告一、摘要本文报道了利用真核表达载体pCDNA3.1将猪CD163基因转染MARC-145细胞并筛选获得稳定细胞系的过程，以及对该细胞系的基本特性进行的初步鉴定。

结果表明，通过G418抗生素的筛选，成功获得了猪CD163稳定表达的MARC-145细胞系，其CD163基因在转染后表达量显著升高。

Western blot分析进一步验证了该细胞系中CD163蛋白的高表达，并发现该细胞系的细胞周期及增殖能力与野生型MARC-145细胞相似。

二、背景CD163是一种单核细胞表面受体，分为两个亚型：膜结合型和溶菌酶型。

CD163主要表达在单核/巨噬细胞表面，参与调节免疫应答、清除体内游离血红蛋白等生理活动。

由于其在生理和病理状态下的重要生物学功能，CD163已成为研究热点。

目前已有多个研究利用转染方式构建CD163的稳定表达细胞系，用于研究其分子机制及细胞生物学特性。

MARC-145细胞属于肺部成纤维细胞，被广泛应用于猪繁殖障碍与消耗性疾病病毒的研究。

近年来，MARC-145细胞亦广泛应用于其它研究领域如基因工程疫苗的开发、基因敲除等。

因此，将猪CD163基因转染至MARC-145细胞可为研究猪CD163功能提供新的模型。

三、实验设计1）构建真核表达载体pCDNA3.1-CD163：将猪CD163基因获取并克隆到真核表达载体pCDNA3.1上，该载体带有Ecogpt和neomycin抗生素的选择标记。

2）转染MARC-145细胞：采用Lipofectamine™2000试剂进行转染，将pCDNA3.1-CD163载体转染至MARC-145细胞中。

3）筛选稳定细胞系：转染后48h，在MARC-145细胞培养基中加入200 μg/mL G418抗生素进行筛选，单个克隆再次挑选后得到稳定表达猪CD163的MARC-145细胞系。

4）mRNA水平检测：通过qPCR检查MARC-145细胞中CD163 mRNA的表达水平。

实验五细胞染色体数目分析

中，置55℃～60℃水浴1.5h～2h后，加甲醇50mL，静置24h以上，过滤即成姬姆萨染色液原液，装于棕色瓶内保存备用。 10% Giemsa染液：取原液1份加入9份 0.01mol/L pH7.2 PBS中混匀。
6、细胞：Marc-145细胞
7、载玻片：4℃预冷
三、操作方法
秋水仙素处理，使细胞停止分裂取对数生长期的Marc-145细胞一瓶，加入秋水仙素到培养液内使终浓度为0.4μg/ml。 37℃温箱中继续培养2.5-3h。收集处理的细胞倾出秋水仙素处理液，用0.25%胰酶溶液消化细胞，细胞消化好后加入DMEM培养液将细胞吹下。 1600r/min离心5min收集细胞。
实验五
细胞染色体分析
(秋水仙素裂解法)
一、原理
细胞处于分裂中期时染色体的长短和大小恰
到好处，是研究染色体最好时期。
秋水仙素能破坏细胞纺锤体,并阻止其形成, 使分裂的细胞停留在分裂中期。秋水仙素使染色体收缩，形成清晰的轮廓。低渗液处理可使细胞肿胀，染色体分散空气干燥使细胞和染色体展平。
二、实验材料
1、有丝分裂抑制剂 100×浓缩的秋水仙素（20μg/ml）：将0.1mg
秋水仙素溶于5ml重蒸水中，分装后冰冻保存。
2、细胞消化液：0.25%胰蛋白酶溶液
3、低渗溶液：0.075mol/L KCl
4、固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1混合）
5、染液(Giemsa 吉姆萨染液)
姬姆萨染色液原液：姬姆萨染料0.6g加于50mL甘油
再次加入固定液 800μl ，轻轻混匀，静置 2030min或4℃过夜，1600r/min离心5min，弃l固定液，混匀。吸取50μl细胞悬液于4℃预冷的干净载玻片上，轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自然干燥。（在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样

实验方案

实验方案繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制1. 病毒的克隆1.1 细胞制备原种细胞系（MARC－145，IBRS－2）复苏、传代1.1.1复苏（a）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即置37℃水浴中不断摇晃，待融化后，将细胞倒入25mL的克氏瓶中，加入含10％BCS的MEM生长液，37℃培养，5－6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。

待长成单层后，进行传代培养。

（b）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即投入37－38℃水浴中，待融化后（约1min），室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍，500r/min离心10min，弃上清，加新鲜营养液悬浮细胞，并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液，37℃培养。

1.1.2传代取长满单层后的细胞（约72h），倾去原来的营养液，用Hank’s液冲洗一次，加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液)，其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。

置室温或37℃温度中消化，当细胞层开始由瓶壁脱离时（眼观可见细胞面呈毛玻璃样，镜下观察可见细胞圆缩，间隙增大，即将脱落），将消化液倾出，加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加入相同于原营养液量的新营养液，以大口径吸管充分吹打，直到细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分瓶。

（为便于吹打和分散细胞，开始时可以少加一些营养液，吹打分散后再逐步追加营养液至需量。

）其分种率为1：2或1：3，37℃培养。

1.2 病毒培养种毒（PRRSV[欧美株]、PRV、PPV）复壮、病毒增殖1.2.1种毒复壮（PRRSV[欧美株]、PRV）(1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液[1％Gln，2％NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM]，洗2－3遍，倾弃清洗营养液；(2) 接毒冻干毒种（原装量为2mL，湿毒1mL，保护剂1mL），以无血清MEM恢复为原装量，每瓶（100mL瓶）接毒1mL；(3) 吸附37℃吸附1h，其中每20min轻轻晃一次，以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。

PRRSV 感染 Marc-145 细胞的病毒形态发生学、细胞超微结构变化及细胞凋亡的研究

分类号：S852.659.6学号：S200216016四川农业大学硕士学位论文PRRSV感染Marc-145细胞的病毒形态发生学、细胞超微结构变化及细胞凋亡的研究刘伍梅指导教师汪铭书教授程安春教授学科专业预防兽医学研究方向兽医微生物及分子生物学2005年6月论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：年月日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

论文所涉及的知识产权属于四川农业大学，公开发表论文的第一作者单位和通讯作者单位必须是四川农业大学。

研究生签名：年月日导师签名:年月日目录中文摘要 (1)英文摘要 (2)前言 (4)1 材料 (11)2 方法 (14)3 实验结果 (17)3.1T C I D (17)503.2病毒形态发生 (17)3.3细胞超微结构变化 (19)3.4细胞凋亡 (21)4 讨论 (27)4.1 病毒形态发生 (27)4.2 细胞超微结构变化 (28)4.3 细胞凋亡 (28)5 结论 (35)参考文献 (36)致谢 (43)攻读学位期间发表的学术论文目录 (44)中文摘要利用猪繁殖与呼吸综合征病毒四川分离株（PRRSV-SC1）感染体外培养的Marc-145细胞为模型,开展了以下两方面的研究：①利用透射电镜和超薄切片技术研究了PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间病毒的形态发生学和细胞超微结构的变化；②利用光学显微镜观察、透射电镜观察、DNA Ladder、ELISA、TUNEL五种方法研究了PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间所引起的细胞凋亡及其动态变化规律。

血清-病毒中和试验的标准操作规程

血清-病毒中和试验的标准操作规程（编号：034）
1、目的及使用范围
该SOP以PRRSV为例，测定血清中的病毒中和抗体滴度。

2、主要仪器及试剂
CO2细胞培养箱、普通光学显微镜、超净工作台（生物安全级别）、电动吸引器、移液器、水浴锅、DMEM培养基、胎牛血清、96孔细胞培养板
3、相关器皿的预处理
玻璃制品要高压灭菌
4、操作步骤
4.1按常规细胞培养方法培养Marc-145细胞
4.2胰酶消化Marc-145细胞，均分与96孔板中，100μL/孔，并保证细胞数为（2～8）×105/孔；CO2细胞培养箱培养16～24h；
4.3抗血清56℃水浴锅灭活30min，与含100 TCID50 PRRSV的DMEM（2%FBS）2倍倍比稀释，混匀后，37℃孵育1h；
4.4弃除96孔板中细胞培养基，加入血清-病毒混合物100μL/孔，置于CO2细胞培养箱中，吸附1h；
4.5弃除上清，用无菌PBS洗2次，吸干各孔中的残留液后，加入含2%FBS的DMEM，置于CO2细胞培养箱培养3～5d；
4.6第4天，于光学显微镜下观察细胞病变CPE，记录病变孔数目；
4.7计算中和抗体滴度，按照运用Reed-Muench法计算。

5、问题向导
5.1细胞病变不明显
根据细胞状态或病毒种类的不同，细胞病变时间会相应发生改变，一般而言，第3天就会出现CPE，第4天就可以计算其中和抗体滴度。

5.2 Reed-Muench法计算中和抗体滴度范例，见表1。

68。

猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞微载体上培养条件的研究

ＣｕｔｒｆｏｃｎｐｏｕｔｅａｄｒｓｉａｏｙｓｎｒｍｅｖｒｓｏｌｅｏｐｒｉｅｒｒｄｃｉｎｐｒｔｒｄｏｉｕｎｕｅｖｅｙＭａｃ１５ｃｌｍｉｒｃｒｉｒｒ．ｅｌｃｏａｒｅｓ４
１材料与方法
１１材料．
兰中央兽医研究所确定该病的病原是一种新的ＲＡＮ病毒，并命名为Ｌｌｓａ病毒。９６年郭宝清同ｅｙｔｄ１９等首次从疑似ＰＲＲＳ感染的猪群中分离到了ＰＲＶＲＳ，
１５ｅｌ／．Ｉｃｌｍ１ｔ０ｓｗａｆａｉｌｔｒｐｇｔｔｅｏｃｎｒｐｏｕｔｅｎｅｐｒｔｒｙｄｏｖｒｓｎｓｅｓｅｏｐｏａａｅｈｐｒｉｅｅｒｄｃｖａｄｒｓｉｏｙｓｎｒｍｅｉｕｏｂｉａｍｉｒｃｒｉｒ．ｉｈｌｉｅｅｐｒｎａｕｄｔｎｆｒａｓｒｄｃｏｆＲＲＳｖｃ：ｅｃｏａｒｅｓｗｈｃｄｔｘｅｉａｈｍｅｔｌｏｎａｉｓｏｕｔｎｏＰｆｏｏｍｐｉａｃｎ．ｉＫ：Ｍａｃ１５ｅｌｐｒｉｅｅｒｄｃｉｅｄｅｐｒｔｒｙｄｏｒ－４ｌｏｃｎｒｐｏｕｔａｒｓｉａｏｙｓｎｒｍｅｉｕ；ｃｏａｒｅｓｃ；ｖｎｖｒｓｍｉｒｃｒｉｒ
ＰＲＶ在微载体Ｃｔｄｘ３上的生长条件，ＲＳｙｏｅ一为

PRRSV强弱毒感染PAM和Marc-145细胞入胞途径差异的研究

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）引起的猪场最重要传染病之一，给全世界养猪业造成了持续的经济损害。

减毒活疫苗免疫接种作为防控PRRS 的有效手段在全世界范围内得到广泛应用。

减毒活疫苗毒株是在猴源细胞系上连续传代获得的，导致其与亲本毒株在生物学特性上存在巨大差异，同时本实验室前期结果也提示HP-PRRSV 野毒株和疫苗毒株在入胞途径上可能存在差异。

Na +/H +交换的依赖是巨胞饮的标志性特征，阿米洛利（EIPA ）是Na +/H +交换的特异性抑制剂，细胞骨架重排在病毒的入胞过程中发挥重要作用，细胞松弛素D （Cyt D ）是肌动蛋白聚合的特异性抑制剂。

分别利用EIPA 和Cyt D 预处理PAM 和Marc-145细胞后接毒，对比强弱毒在两种细胞内病毒拷贝数、蛋白表达水平及子代病毒的释放上与空白对照组的差异。

结果表明，PRRSV 强弱毒均不利用巨胞饮途径感染Marc-145或者PAM 细胞，但强弱毒在感染不同细胞时对肌动蛋白的依赖性存在明显的区别。

本研究结果初步揭示了PRRSV 野毒株和疫苗毒株入胞过程的差异，为进一步揭示PRRSV 疫苗毒株致弱机制提供了前期基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；入胞途径；巨胞饮；肌动蛋白中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）04-0018-08Analysis of the Differences of the Entry Pathway of PAM and Marc-145 Infectedwith Highly Pathogenic and Attenuated PRRSVsZHU Haojie 1, GAO Fei 1, XU Jingjing 1, LIU Yuting 1, TONG Guangzhi 1, JIANG Yifeng 1, LI Guoxin 1,2(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention andControl of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)收稿日期：2021-01-02基金项目：国家生猪现代产业技术体系（CARS-35）；国家自然科学基金（31670158）作者简介：朱豪杰，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：李国新，E-mail：*****************.cn；姜一峰，E-mail：********************.cnPRRSV 强弱毒感染P AM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究朱豪杰1，高飞1，徐晶晶1，刘宇婷1，童光志1，姜一峰1，李国新1,2（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）2023,31(4):18-25Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), which caused by Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is considered as the most important infectious disease to the pig industry. Immunization is considered as an effective way to control PRRS all over the world. Live attenuated vaccine which obtained by continuous generation on Marc-145 cells was considered as the most effective vaccine, the generation on allogenic cell line resulting huge biological difference compaired with their parents strains including growth characteristic. Our previous results also showed that PRRSV ﬁ eld strain and vaccine strain might have differences in the pathway of entry the cell. Na +/H + exchange is the key characteristic of macropinocytosis, Amiloride (EIPA) is the speciﬁc inhibitors of Na +/H +exchange, Cytochalasin D (Cyt D) was widely used to inhibited actin polymerzation. The PAM and Marc-145 cells were pretreated· 19 ·朱豪杰等：PRRSV 强弱毒感染PAM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究第31卷第4期猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种急性且高度传染的病毒性疾病。

4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定

4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定张晋强;牛丽;宋美琴;白喜云【摘要】The time of the Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) , Marek virus(MDV), Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV), Porcine Pseudorabies Virus (PRV) reaching the biggest adsorption quantity on cell was determined. The time was decided through the cytopathic effect induction by virus adsorption at different times. Results showed that after some time of the IBDV, MDV, PRRSV, PRV adsorption, the cytopathic effect became more heavier with the increase of adsorption time, they reached the peak at 60,120,60, and 60 min, respectively. The time of IBDV on CEF reached the biggest adsorption quantity was 60 min,and MDV on CEF 120 min. The time for PRRSV on Marc-145 reached the biggest adsorption quantity was 135min,and for PRV on PK-15 60min.%为确定鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒、鸡马立克氏病毒(MDV)弱毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪伪狂犬病毒( PRV)在细胞上达到最大吸附量所用时间,通过观察病毒在细胞上吸附不同时间后的细胞病变情况来测定病毒在该细胞上达到最大吸附量所用时间.结果表明:IBDV、MDV、PRRSV以及PRV 4种病毒在细胞上吸附一定时间后,细胞病变随着吸附时间的延长而加重,分别在60、120、60、60 min时达到峰值.37℃孵育条件下,IB-DV在CEF上的吸附量在60 min时达到最大值；MDV在CEF上的吸附量在120 min时达到最大值;PRRSV在Marc-145上的吸附量在60 min时达到最大值；PRV在PK-15上的吸附量在60 min时达到最大值.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(031)004【总页数】4页(P373-376)【关键词】IBDV;MDV;PRRSV;PRV;病毒吸附【作者】张晋强;牛丽;宋美琴;白喜云【作者单位】山西农业大学信息学院,山西太谷030801;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S855.3近年来，人们对病毒的研究越来越深入，包括在细胞模型上高通量筛选抗病毒药物并且进一步在细胞水平以及分子水平上研究病毒致病机制、药物抗病毒机制等方面进行大量研究［1］。

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Marc145细胞培养和维持
一、细胞及培养
1．Marc145细胞
上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。

2．生长培养基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。

3．冻存液
生长培养基＋10％DMSO
4．细胞健康生长的几项注意事项
1）细胞没有支原体等外源因子的感染。

2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。

3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。

4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。

5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。

6）细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。

二、病毒感染、维持和收获
转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。

37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。

维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。

pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。

细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。

第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。

收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。

三、细胞病变（CPE）
细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。

病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。

图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。

图1 健康的Marc145细胞
图2
北京清大天一生物技术有限公司
图3
图4
图2、图3和图4均是出现CPE的Marc 145细胞
四、PRRS病毒在细胞中增殖规律（Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20－22hr 左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI 量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5％的细胞呈PRRSV阳性
（PRRSV-positive）。

第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。

感染过程如图5所示。

对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。

图5 荧光抗体染色显微法观察PRRS病毒感染Marc 145细胞过程，A指PRRS病毒感染24hr，B和C指PRRS病毒感染后42－46hr，D指PRRS病毒感染后72hr。