农杆菌介导玉米转基因的研究
农杆菌介导玉米转基因的研究 摘 要：转基因技术在玉米育种中运用很广泛，本文主要通过查阅文献，结合专业所学知识，从转基因技术、农杆菌介导的受体以及影响农杆菌转化的因素和玉米转基因的现状等方面，综述了在玉米中农杆菌介导转基因的研究进展。 关键词：玉米，转基因，农杆菌介导法，育种
转基因作物指将一种或几种植物、动物乃至人类的基因导人某种作物，使其基因重新组合，增强其抗逆性、抗病虫害、抗杂草等优良性状。转基因玉米的研究与开发已取得了显著进展。许多外源基因已经被导入玉米，以改良玉米的某些性状，并取得了很好的成效。２０世纪８０年代后期，一些研究者尝试用根癌农杆菌接种玉米幼苗。采用病毒感染以及外源DNA与花粉混合授粉等方法，试图将外源DNA导入到玉米中，虽得到一些转化表现，但均未得到分子生物学证据。Fromm等用电激法把抗除草剂基因Pat转入玉米原生质体中，开创了玉米遗传转化研究的先河。Rhodes等用电激法把NptII基因转入玉米原生质体中，经过抗性筛选、分化再生得到抗Km的转基因植株。Fromm、Gordon－Kamm等利用基因枪轰击原生质体获得可育的玉米转基因植株。农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段。根癌农杆菌是许多双子叶植物肿瘤病的病原菌，它含有Ti质粒，其中的T-DNA能够转移到植物基因组上。农杆菌在双子叶植物中的转化已经十分完善，但是由于玉米等单子叶植物不是其天然的寄主，所以转化工程比较困难。但最近几年的研究表明农杆菌可以介导玉米上的基因转化。 1.常用玉米转基因的方法 在现代育种技术中，常用的转基因方法往往结合使用，以提高转基因的效果。明小天等通过基因枪提高了根癌农杆菌转化水稻的转化效率蚓。花粉管通道法既可以用普通的质粒，也可用农杆菌Ti质粒。另外，还有PEG介导法、超声波法、子房注射法、阳离子转化法和电击法等。 1.1 基因枪法 1989年Klein第1次使用基因枪介导法转化玉米。。Philippe等用山梨糖醇和甘露醇处理A188XB73的胚性悬浮细胞，用基因枪把GUS基因导入玉米，结果表明经山 梨糖醇和甘露醇处理过的细胞转化频率提高2.7-6.8倍。基因枪法是玉米遗传转化的主要方法，受体组织类型对基因枪法的转化有一定的影响。基因枪法具有不受基因型的限制、受体广、转化率高的优点，但外源基因整合的拷贝数多。 1.2 花粉管通道法 花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源基因沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法始于1975年Pandey对烟草的研究。Hess报道了利用外源DNA花粉得到花色变异的矮牵牛。周光宇在分析远缘杂交成功经验的基础上，提出了DNA片段杂交假设，为花粉管通道法提供了理论基础。花粉管通道法无需建立愈伤组织等组织培养体系，同时不受植株基因型的限制，但由于授粉时间短，使得不能转化大片段的外源DNA。 2.根癌农杆菌介导玉米遗传转化 根癌农杆菌转化系统具有许多优点：成功率高，效果好，外源基因整合位点较稳定，且大多数是单位点整合；显性表达率较高，共抑制现象相对较少；遗传稳定性好，大多符合孟德尔遗传规律等。利用该方法转化植物的研究始于20世纪80年代初。由于单子叶植物不是农杆菌天然受体，所以遗传转化研究落后于双子叶植物。Byteier用带有Nos-nptII的Ti质粒转化刁石柏愈伤组织，得到了抗Km生植株。 2.1 农杆菌介导转化玉米的研究历程 付永彩将农杆菌介导禾本科作物转化的研究历程分为3大阶段，所以农杆菌介导的玉米转基因研究也可分为3个阶段。 第1个阶段，证明农杆菌能够侵染玉米。Grimsley等将带有MSV基因的胭脂碱型根癌农杆菌注入玉米幼苗，发现98%叶片出现感染症状，而条斑病毒与玉米单独共培养时不能感染，说明可以通过农杆菌介导病毒进入玉米细胞。 第2个阶段，获得转化细胞，但未能获得转基因植株。Shen等用农杆菌与芽尖共培养、Tshige用农杆菌转化胚性愈伤都得到了稳定的转化体系但未得到植株。 第3个阶段，获得转基因植株，并有分子杂交证据。Gould报道了农杆菌转化玉米茎尖分生组织获得成功。Ishida等构建农杆菌超级双元载体转化体系，使转化频率高达5%-30%，并且用农杆菌浸染A188的幼胚，得到的转Bar、GUS植株70%可育。Escudero等用农杆菌浸染玉米幼胚，发现不同时期，幼胚感染率不同，而且发现 T-DNA的转移受到基因国内玉米农杆菌的转化研究起步较晚。1999年黄璐、卫志明首次用农杆菌介导法把NptII、GUS、Hpt基因转入玉米，转化率为8.1%。张荣等用农杆菌浸染玉米幼胚，初步建立转化体系，但未获得转化植株。 2.2 农杆菌介导的转基因受体 2.2.1原生质体,Fromm、Rhode、Wang等以玉米的原生质体为受体，对玉米进行遗传转化。作为转化受体，原生质体具有转化效率高、嵌合体少、适宜各种转化系统等优点，但原生质体同时具有培养周期长、再生频率低、遗传稳定性差、再生植株变异大等缺点。马力耕等以黄化叶片为材料，通过2步酶解获得了原生质体。文仁来等通过酶解以花药培养获得的单倍体愈伤组织，得到的原生质体可用于体细胞杂交。支那英等将小麦和玉米的原生质体进行杂交得到体细胞杂种。 2.2.2愈伤组织，Armstrong把玉米愈伤组织分为2种类型：I型，白色，紧密坚硬，干燥，表面皱起，生长慢，易发生器官分化；II型，黄绿色，颗粒状，较紧密，较湿润，生长快，易发生胚状体。II型是目前玉米转化的常用受体：具有较高的转化频率和再生频率。但玉米胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制，能诱导较高胚性愈伤组织的报道目前仅局限于A188、B73等少数基因型材料中。目前已经从玉米叶片、幼穗、茎尖、幼胚、花药等外植体诱导出愈伤组织，其中幼胚是较好的外植体。同时，愈伤组织的诱导还受到外植体生理状态和放置方式的影响。 2.2.3丛生芽,丛生芽是由于玉米茎尖伸长受阻，而从叶腋中长出的大量不定芽。每个不定芽都有形成幼苗的能力，而丛生芽的诱导相对愈伤组织容易，并且不用再诱导发芽，从而提高后代的生成率，降低工作量。李国圣等利用玉米丛生芽，结合基因枪法获得转基因植株懈。 2.2.4悬浮细胞,通过细胞悬浮液分散细胞，并将其分散培养，在多次继代培养后，将细胞团诱导成小的愈伤组织，然后在固体培养基上继续培养、分化获得再生植株。孙世孟等利用获白X莱1029的愈伤组织，建立了4个悬浮细胞系，得到7个再生植株。向太和等提出悬浮细胞系建立的几个关键技术及判断胚性悬浮细胞系的参考标准。马莲菊等认为，基因型和培养基对悬浮细胞系的建立有影响，尤其是基因型。 2.2.5子房和幼穗,虽然愈伤组织、悬浮细胞、原生质体、丛生芽都可以获得 转基因植株，但T0代是嵌合体，不容易得到转基因种子，而且在嵌合体中基因易丢失。若通过雌配子或刚刚授精的合子，则T0代就是带有目的基因的转基因种子，而后代基因保存中只是进行自交，基因检测较容易。由于农杆菌具有单细胞侵染能力，所以未授粉的成熟雌配子浸在大量农杆菌液体中，有可能被农杆菌侵染而获得转基因植株。由于雌配子能够忍受外源DNA或变异染色体，所以可以通过雌配子传递以避免嵌合体存在于后代种子，从而得到稳定的后代。 2.3 影响农杆菌转化的因素 农杆菌介导遗传转化主要包括5个过程：①农杆菌在植物细胞上的吸附；②Ti质粒上的Vir区被激活；③T-DNA切割与T-DNA复合物的形成；④T-DNA复合物进入植物细胞；⑤T-DNA整合到植物染色体上。农杆菌介导遗传转化关键在于农杆菌能否在植物细胞上吸附，Vir区基因是否被诱导，植物感受态细胞是否存在。 2.3.1 Vir区基因的诱导, 单子叶植物与双子叶植物对创伤的反应不同，单子叶伤口附近常发生木质化或硬化，细胞伤流液中不含有Vir基因诱导物。所以，目前主要采用添加诱导物的办法诱导Vir基因的表达。现已发现有７种酚类化合物与Vir基因表达有关，其中AS和OH-AS最为有效。另有报道指出一些小分子量糖类，如半乳糖和葡萄糖等，在AS浓度很低或没有时也可极大地促进Vir基因的有效表达。 2.3.2 感受态细胞,Sehlappi和Hoil用Agroinfection法研究不同发育阶段3个玉米品系幼胚对农杆菌的感受性，发现授粉后14-16d的幼胚感染频率最高。Jesus等在玉米分生细胞的T-DNA转化中发现授粉后10d前的未成熟胚不能被农杆菌感染，而授粉12-30d的未成熟胚转化频率逐渐增高。夏光敏等研究了７种不同基因型小麦不同发育阶段的幼胚及胚性愈伤组织转化，发现生长旺盛的II型愈伤组织是适宜的转化材料。由此可见，不同时期的细胞或组织对于感染的成功与否非常重要。 2.3.3其他因素,不同菌株或载体对玉米的转化有一定的影响。目前玉米上普遍使用的菌株是LBA4404和EHA101。研究发现，玉米幼嫩组织分泌物中有特异阻遏毒性基因表达的物质MDIBOA。研究人员正在寻找一种可抵抗MDIBOA的农杆菌菌株，以期能提高转化效率。受体的基因型也是影响转化效率的一个重要因素。许多试验表明，大多数玉米基因型细胞表面缺乏供农杆菌识别并与之附着的位点。 2.4 标记基因 标记基因的作用是在相应抗生素选择压力下，筛选出转化体。目前玉米遗传转化中使用的标记基因有NptII、npt和Bar等。Hpt和Bar作为标记基因很好，但玉米对Km不敏感，使用NptII选择效果不好。 3.应用 3.1 抗虫基因 张艳贞等以玉米自交系340、4112为材料，用带有PGBII04质粒的根癌农杆菌LBA4404转化幼胚及其初始愈伤组织，培养3d，在PPT培养基上连续筛选3代，获得了再生植株。张艳贞等发现抗性植株平均发生率11.21%，平均转化率2.35%，降低温度至22℃共培养，转化率可达4.44%，部分转化植株已经结实。权瑞党等利用农杆菌AGL0侵染玉米胚性愈伤组织，将雪花莲凝聚素基因转入玉米骨干自交系齐319和掖515中，获得转基因植株。伍晓丽等利用带质粒PBUSCK-Hyg农杆菌LBA4404将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因cpti转入玉米自交系18-559中，cpti对玉米螟、粘虫、玉米根叶甲等多种害虫具有广谱抗性。 3.2 抗病毒 美洲商陆抗病毒蛋白是从美洲商陆植物体内提取出来的一种碱性蛋白，属I型核糖体失活蛋白，具有广谱抗病毒能力。它对7个植物病毒属成员具有抑制作用，并且对细菌、真菌和H/V有一定的抑制作用。孙晓丽等将PAP转入玉米，得到了具有广谱抗性的玉米植株。 3.3抗盐 尹小燕等以玉米骨干自交系DH4866、齐319和AtNttXl和Hpt基因转入玉米培养细胞，经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织和再生植株，经PCR检测和Southem．blot验证，确定了22.8%再生植株为转基因植株。农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响。外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性，在部分株系中表现出孟德尔遗传规律。耐盐筛选表明，一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性，部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长。 3.4工程制药上的应用 玉米不仅是重要的粮食，而且是很好的生物反应器，利用玉米可以生产高效
转基因技术的研究报告综述及利弊关系
转基因技术的研究综述及利弊关系转基因技术作为生命科学的前沿技术之一，已经逐渐走入了人们的生活。
转基因技术可以认为是在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向开展的技术。
通过对转基因技术的介绍，阐述了该技术的利弊关系，指出只有通过正确的引导和规管理，才能很好地利用该技术，使它为人类效劳。
关键词转基因技术开展历程利弊关系1 前言转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。
自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停顿过作物的遗传改进。
过去的几千年里农作物改进的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。
遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进展优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改进。
因此，可以认为转基因技术是与传统技术一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进展遗传改进。
但在基因转移的围和效率上，转基因技术与传统育种技术有两点重要区别，第一，传统技术一般只能在生物种个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制；第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进展，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对*个基因进展操作和选择，对后代的表现预见性较差。
而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。
因此，转基因技术是对传统技术的开展和补充。
将两者严密结合，可相得益彰，大提高动植物品种改进的效率。
2 转基因技术的介绍转基因技术是指用人工别离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术，可分为转基因动物与转基因植物两大分支。
人们常说的"遗传工程〞、"基因工程〞、"遗传转化〞均为转基因的同义词。
2.1 转基因植物技术转基因植物是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得的具有新的遗传性状的植物。
RNA干扰抗矮花叶病转基因玉米培育的开题报告
RNA干扰抗矮花叶病转基因玉米培育的开题报告一、背景矮花叶病是玉米最严重的病害之一，其主要病原为玉米矮缩病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV）。
传统的防治手段为化学农药喷洒，但存在着环境污染、残留物超标等问题，同时也会导致病毒产生抗药性。
因此，利用基因工程手段培育抗病转基因玉米已成为解决该病害问题的重要途径。
RNA干扰技术是一种广泛应用于基因功能研究和抗病育种中的生物技术手段。
该技术利用RNAi途径寄主RNA引发RNA降解，从而实现基因表达的抑制。
由于该技术具有高效、精准、可逆等特点，因此在抗病育种中具有重要的应用价值。
二、研究目的通过RNA干扰技术抑制玉米中病毒感染相关基因的表达，培育抗病转基因玉米，探究RNA干扰技术在抗病育种中的应用前景。
三、研究内容1. 筛选目标基因针对病毒感染相关基因进行筛选，利用基因芯片或转录组学分析技术，分析玉米在感染MDMV后的基因表达谱，筛选出与病毒感染相关的差异表达基因。
2. 构建RNA干扰载体根据筛选出的目标基因序列，设计并合成siRNA，将其克隆至RNA干扰载体中，构建符合转基因玉米转化需求的RNA干扰载体。
3. 玉米遗传转化将构建好的RNA干扰载体导入玉米愈伤组织，利用农杆菌介导法进行玉米遗传转化。
4. 筛选并鉴定转基因玉米通过PCR扩增、南方杂交等技术筛选出携带RNA干扰载体的转基因玉米，同时对其进行多代世代稳定性评估和安全性评估等鉴定工作。
四、研究意义研究利用RNA干扰技术培育抗病转基因玉米，对于玉米矮花叶病的研究具有重要的应用价值。
同时，该研究可为RNA干扰技术在农业生产中的应用提供实践经验，推动RNA干扰技术在抗病育种中的发展和应用。
抗草甘膦基因的玉米转化及后代遗传分析
抗草甘膦基因的玉米转化及后代遗传分析王秀红;史向远;白建荣;孙毅;刘惠民【摘要】利用农杆菌介导法将一个新型抗草甘膦基因导入玉米优良再生材料Hi-II 中,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在15株T0转基因植株中有10株,经PCR初步检测呈阳性;T1转基因植株用2%草甘膦进行抗筛选性后,4个穗行符合3:1的遗传分离比,3个穗行符合1:1的遗传分离比.对35个T2转基因植株以株系为单位混收进行PCR检测,结果表明,有32个T2株系表现阳性.对籽粒色泽纯度高且呈阳性的株系依次进行田间草甘膦涂抹、PCR和RT-PCR检测,结果显示,田间草甘膦筛选效果明显,植株全部存活,选10株PCR呈阳性的植株进行RT-PCR 检测,9株出现1.2 kb的目的条带,说明抗草甘膦基因能够遗传至T2且能有效进行转录和翻译.%A new glyphosate-resistant gene was introduced into Hi-Ⅱ by Agrobacterium-mediated transformation,the To transformation and progeny genetics were analyzed. Ten plantlets were positive by PCR analysis from fifteen T0 transformed plants. After being painted with 2％glyphosate for 14 days,four spike lines accorded with 3:1 Mendelian segregation ratio and three spike lines accorded with 1:1 segregation ratio in T1. 32 spikes lines were positive by PCR from 35 T2 transformed plants. The spikes lines with high purity grain were selected to further glyphosate painting,PCR and RT-PCR analysis and all plants survived after glyphosate painting and 1.2 kb bands were obtained in nine from ten positive plants. The results showed that glyphosate-resistant gene was able to inherit to the T2 progeny,and transcribed and translated effectively.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2011(026)001【总页数】5页(P117-121)【关键词】抗草甘膦基因;玉米;遗传分析【作者】王秀红;史向远;白建荣;孙毅;刘惠民【作者单位】山西大学,生命科学与技术学院,山西,太原,030006;山西省农业科学院,现代农业研究中心,山西,太原,030031;山西省农业科学院,现代农业研究中心,山西,太原,030031;山西省农业科学院,作物遗传研究所,山西,太原,030031;山西省农业科学院,山西,太原,030006;山西省农业科学院,山西,太原,030006【正文语种】中文【中图分类】Q786草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)因其价格低廉、低毒性和有效的广谱除草特性,已成为农业生产上应用较多的除草剂，此外，抗草甘膦作物的培育成功也是其成为全世界利用率最高的化学除草剂的原因之一[1]。
转基因玉米技术流程
转基因玉米技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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②载体构建：使用酶和DNA连接酶将目的基因与载体（如质粒）结合，构建重组DNA分子。
载体需具备易于识别和筛选的标记基因。
③转化受体细胞：通过农杆菌介导、基因枪或花粉管通道等方法，将重组DNA分子转入玉米细胞内。
④细胞筛选与培养：将转化后的细胞置于特定培养基上，筛选出成功携带并表达外源基因的细胞，诱导其脱分化形成愈伤组织。
⑤再生植株：愈伤组织进一步分化为胚状体，再发展成完整的转基因玉米试管苗。
⑥鉴定与验证：运用分子生物学技术（如PCR、Southern杂交）验证外源基因是否整合到玉米基因组中，及表达情况。
⑦田间试验：将验证合格的转基因玉米苗移栽至温室或田间，观察其生长表现、环境适应性及目标性状是否稳定遗传。
⑧安全性评估：进行全面的食品安全、环境影响评估，确保转基因玉米的安全性。
⑨商业化审批：通过国家相关部门的安全性审查与批准后，方可进行商业化种植与推广。
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立
农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立作者：孙传波，郭嘉，袁英来源：《湖北农业科学》 2014年第12期孙传波，郭嘉，袁英（吉林省农业科学院生物技术研究所，长春１３００３３）摘要：以玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）ＨｉＩＩ的幼胚为外植体，β－葡萄糖苷酸酶基因（ＧＵＳ）为报告基因，通过农杆菌介导转化法对影响遗传转化体系的外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素进行优化，以建立农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系。
结果表明，幼胚大小为１．０～１．５ｍｍ，农杆菌菌液的ＯＤ６００ｎｍ为０．５，４０℃热处理３ｍｉｎ，侵染８ｍｉｎ，共培养３ｄ和恢复培养４ｄ，１００ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素作为抑菌剂，双丙氨膦作为筛选剂时为最佳遗传转化条件。
通过该优化体系已获得多种转基因玉米材料，表明该体系具有较高的可重复性和可靠性。
关键词：农杆菌介导转化法；玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）；幼胚；遗传转化中图分类号：Ｓ５１３；Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１４）１２－２７４３－０４收稿日期：２０１４－０２－１９基金项目：吉林省财政厅育种专项［吉财农指（２０１２）１０６２］作者简介：孙传波（１９８０－），男，山东莒县人，助理研究员，硕士，主要从事玉米遗传转化研究，（电话）０４３１－８７０６３２５６（电子信箱）４５１０３９１０６＠ｑｑ．ｃｏｍ；通讯作者，袁英，研究员，主要从事植物转基因育种研究，（电子信箱）ｃｈｕａｎｂｏｓｕｎ＠１６３．ｃｏｍ。
玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）是重要的粮食作物和工业原料作物之一，在国民经济生产中具有重要战略地位。
利用基因工程技术手段创制性状优异的转基因玉米新种质具有重要的理论和现实意义，为玉米育种技术开辟了新途径。
自１９８８年Ｒｈｏｄｅｓ等［１］首次获得转基因玉米完整植株，１９９６年Ｉｓｈｉｄａ等［２］初步建立农杆菌遗传转化体系以来，玉米遗传转化研究得到了迅速发展，目前已有多种转基因玉米商业化生产。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated transformation）是一种常用的转基因技术方法，用于将外源基因导入目标植物的基因组中。
该方法利用一种土壤细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes）作为载体，将目标基因转移到植物细胞中。
农杆菌介导转化法具有高效、广谱、可逆和整合性等特点，因此被广泛应用于农业和植物基因工程研究中。
2.转化农杆菌：将农杆菌和构造体进行共转化。
这个步骤需要确保构造体能够稳定地进入到农杆菌的细胞质中，并且能够被菌体所拷贝。
一般使用电击法、化学法或冷冻法来完成这个步骤。
3.培养农杆菌：将转化后的农杆菌分别培养在选择性培养基上，以筛选出带有目标基因的菌落。
4.感染植物：通过注射或浸渍等方式将培养得到的农杆菌菌体引入植物的组织或细胞中。
农杆菌会通过分泌细菌素（也称为转化素）的方式进入植物细胞，并在转化素环境下将目标基因导入到植物基因组中。
5.再生转化植株：利用组织培养方法，将含有目标基因的植物细胞培养至完整植株。
这个步骤需要将转化素与细胞分裂激素配比得当，以促进细胞分裂和组织再生。
6.筛选转化株：利用选择标记基因识别并筛选出携带目标基因的转化株。
一般使用抗生素选择法或草酮酸合酶标记法进行筛选。
7. 鉴定转化株：对筛选出的转化株进行鉴定，确认目标基因已经整合到植物基因组中。
一般利用PCR、Southern blot或Northern blot等方法进行鉴定。
通过以上步骤，农杆菌介导转化法可以实现将外源基因导入目标植物中，从而改变植物的性状或增强植物对生物胁迫的抗性。
该方法已经广泛应用于农作物的育种研究以及植物的分子生物学研究中。
农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素
农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素刘石泉 余沛涛 (上海师范大学生命与环境科学学院)关健词 农杆菌 高等植物 基因转化 影响因素 简述了近年来农杆菌转化的基本原理和载体系统的进展,同时着重阐述了不同属性农杆菌、不同植物基因型和外植体、不同再生植株的细胞起源、不同培养方法、不同药物选择以及在叶绿体与细胞核中转化等因素影响农杆菌介导高等植物基因转化,以及这个研究课题的进展现状. 转基因产品目前已引起了国内外各界的广泛关注.面对目前全球已有近4000万公顷种植面积的转基因作物[1],市场上有近4000种转基因食品[2],预计每年转基因作物的产值为100亿美元以上[3].转基因技术已经在200多种植物中获得成功,特别是转基因棉花、水稻、大豆、玉米、烟草、蔬菜等均已在生产上发挥了重大作用[4].利用转基因技术可以冲破物种界限,实现种间遗传育种,并改良现有的物种性状,具有不可估量的前景.一、农杆菌转化的基本原理 农杆菌(Agrobacterium)是一种天然的基因转化系统.农杆菌分为根瘤农杆菌(A.tumefacious)和发根农杆菌(A.rhizogenes).根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导质粒(T i),其上含有可转移DNA(T-DNA)区、毒性区(Vir区)以及冠瘿碱代谢基因编码区.T-DNA两端是两个25bp的重复序列,分别称为左边界和右边界,两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因.Vir 区中含有多个基因段,如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等,每个基因段都含有多个基因.当植物受到伤害时,分泌含有酚类化合物的汁液,如乙酰丁香酮等,这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因(chvA、chvB 等)介导的催化作用促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面;另一方面则被T i质粒上由VirA 和VirG组成的双组分调节系统识别,从而诱导其他Vir 基因的表达.VirD1和VirD2共同作用,由T-DNA右边界开始向左边界切割产生一条T-DNA单链(T-链),T -链5’末端与一分子VirD2结合,其余部分与VirE2结合,组成T-复合体.T-复合体被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上VirB蛋白组成的通道进入到植物细胞内. VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别,经主动运输过程通过核孔进入细胞核内,在VirD2的帮助下,插入植物核染色体中,完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程[5]. 发根农杆菌的转化过程与根瘤农杆菌类似,只是其中含有的质粒称为根诱导质粒(Ri),其中T-DNA区同样含有与发根农杆菌生成有关的植物激素的合成基因及冠瘿碱合成基因. T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似,因而可以不在农杆菌中表达,而在植物中表达.T-DNA整合进入植物细胞染色体后,其中的生长素和细胞分裂素合成酶类基因表达,导致植物细胞大量增殖,形成肿瘤.随着被转化细胞的增殖,T-DNA也被大量扩增,冠瘿碱合成酶类基因拷贝数也随之增加,从而可以合成越来越多的冠瘿碱.冠瘿碱是农杆菌的主要碳源和氮源,其他土壤微生物不能代谢,从而使农杆菌在自然界中为自己赢得了独立的生存空间.二、农杆菌转化系统的发展1.菌株的改造 农杆菌根据转化能力的强弱可分为超毒菌株和普通菌株.超毒菌株是H ood等[6]报道的,他们利用双元载体策略,对农杆菌菌株A281进行了改造.他们构建了两种质粒,一种含有pT iBo542的T-DNA区,另一种含有pT iBo542的其余部分(即pEHA101).进一步的研究结果是从pT iBo542衍生出了两种转化系统:一种是超毒菌株,如EHA101,EHA105;另一种是超双元载体.K omair[7]从pT iBo542中构建了pT OK162超双元载体,并由它衍生出Ptok233.超毒菌株和超双元载体系统后来被人们广泛使用.2.载体系统的发展 天然的T i质粒含有与冠瘿碱代谢有关的基因,T-・61・DNA区内含有生长素和细胞分裂素基因,这些基因在实际应用中是多余的或不利的,因而必须对之改造,方能应用于实际转化操作. 首先是卸甲T i质粒的发明.Z ambryski等[8]将T i质粒T-DNA区中导致肿瘤生成基因去除,制成了卸甲的T i质粒,并将其T-DNA区转入到了植物中.利用卸甲T i 质粒可以使材料转化处不再生成肿瘤,从而获得转基因植株. 农杆菌载体系统分为共整合载体系统和双元载体系统.共整合载体系统包括两个质粒:一个是在农杆菌中T i质粒,含有Vir区和T-DNA区;另一个是在大肠杆菌中的中间载体,可以在体外进行操作.将目的基因插入其中,通过三亲交配实验,在含有辅助质粒的第三种菌株的帮助下,促使大肠杆菌中的中间载体通过结合过程进入农杆菌. Vir区和T-DNA是反式作用的,二者置于两个质粒上而不影响二者的相互作用.根据这一原理,人们构建了双元载体系统,它由两个质粒组成:一个置于农杆菌中,含有Vir区;另一个含有T-DNA区.这个质粒可以作得比较小(10kb左右,因而能利用大肠杆菌方便地进行体外操作.第二个质粒可以通过液氮冻融高效地转入农杆菌中.利用双元载体系统,可以实现载体和任意农杆菌的搭配,有利于找到高效的转化组合. 另外,K omari等[9]发展了另一种双元载体系统.他们把抗生素基因和G US基因分别放在两个T-DNA区上,将两个T-DNA区构建到同一个质粒中.利用含有这个质粒载体的农杆菌LBA4404转化烟草和水稻,两个基因的共转化频率为47%,只含带G US基因T-DNA区和只含带抗生素抗性基因T-DNA区的植株占被转化植株的一半以上.这有助于解决抗生素抗性基因存在于转基因植物中的问题,获得只含有目的基因、屏弃了抗生素抗性基因的转基因植株.3.植物农杆菌转化的发展 农杆菌的天然寄主是双子叶植物,植物的农杆菌转化也就由双子叶植物开始,并取得了一系列成功.已有多种双子叶植物,如烟草、马铃薯、番茄、茄子、大豆、甜菜、拟南芥菜以及十字花科芸薹属植物等被转化成功.对于双子叶植物而言,农杆菌的转化是比较容易的,但是,农杆菌介导的单子叶植物的转化直到20世纪90年代之后才取得一系列进展.目前已经转化成功的有石蒜科、百合科、鸢尾科、薯蓣科和禾本科的植物[5].三、影响农杆菌介导植物基因转化的 因素 Dandekar等[10]在对胡桃的研究中和Martin等[11]在对葡萄的研究中认为影响转化效率的两个重要因素为:用于转染的农杆菌菌株和目标植物受侵染的部位.实际上,农杆菌介导的遗传转化有两个关键过程:农杆菌侵染转化材料及转化材料的再生.各种因素对于转化效率的影响都可以归于对这两个过程的影响,而这两个过程需要相辅相成.下面就影响上述两个过程的诸多因素有关研究进行分析.1.不同属性农杆菌对转化的影响 农杆菌作为植物基因转化的工具,其属性对转化的成功有决定性的影响,这也是长期以来在转化过程中将研究重点放在选择和处理农杆菌的原因.农杆菌依其代谢冠瘿碱的种类可分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型等类型,不同的菌种会影响基因转化的效果. 由于农杆菌T i质粒上Vir区编码产物负责接受外界信号、T-DNA的加工、转移及整合等功能,所以该区对菌种的侵染力起决定性作用,因此,农杆菌Vir基因的表达及表达水平的高低直接影响到转化,这也是到目前为止对农杆菌的研究热点仍然集中在Vir基因及其编码产物上的原因. 植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物对农杆菌Vir 基因的表达有诱导作用.目前广泛使用乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮及植物细胞培养液来诱导农杆菌,并在一些转化中取得好的转化效果[12,13].已有实验表明,一些自身不能产生对Vir基因具有高效诱导的酚类化合物的植物,使用乙酰丁香酮能产生较好的效果.同样,在共培养时间短、难以诱导Vir基因表达的情况下,酚类物质的使用可能会产生良好的效果[14].乙酰丁香酮的使用还可以减小植物基因型的差异[15].而在另一些植株的转化上,如草莓等,乙酰丁香酮的使用无效甚至有害[16]. 其他物质对Vir基因有诱导作用,如肌醇[17]、非代谢糖类(2-脱氧葡萄糖、6-脱氧葡萄糖[18]等).采用渗透保护剂甜菜碱和脯氨酸也可以诱导Vir基因的表达[19].此外,不同菌种Vir基因的诱导效果还与诱导培养基的pH有关[20]. 一般说来,农杆菌Vir基因诱导必须注意以下几点:①诱导培养基pH介于5～6之间.②农杆菌培养温度应在28～30℃.③避免在培养基中含有酵母提取物.・71・④培养基中需含有较高的糖浓度.2.植物基因型及外植体对转化的影响 大多数农杆菌能侵染多种植物,但其侵染性因植物种类而不同,有的甚至局限于某种植物的某种基因型.一般认为,基因型的特异性与细胞的生理状态有关,所以在进行转化之前必须对植物的基因型进行选择.在莴苣、拟南芥、马铃薯的转化中,基因型的差异表现比菌种的差异大.来源于植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农杆菌的侵染具有不同的敏感性.总的说来,分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最为敏感.幼叶、幼胚、茎尖顶端分生组织、小孢子、愈伤组织、悬浮细胞培养物等均可作为外植体.一般认为,幼嫩的外植体比老的外植体好.杨广东等[21]以大白菜3d苗龄带柄子叶为外植体,经根癌农杆菌介导,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入大白菜自交系“G P-11”和杂交种“中白4号”,并获得了对菜青虫具有一定抗性转基因植株.欧阳波等[22]通过根癌农杆菌介导转化番茄下胚轴,将外源双价基因导入番茄,获得了一批卡那霉素抗性苗.研究表明,番茄下胚轴是良好的遗传转化受体.烟草细胞看护培养能够提高外植体的转化效率和减少农杆菌对外植体的污染.从实际情况看,农杆菌感染外植体主要在切口部位,即使较老的外植体,其切口细胞受伤后,在内外源激素的作用下,转化成具有分生能力很强的细胞团.例如,有些外植体经预培养后,由于植物细胞启动脱分化,再与农杆菌共培养,对农杆菌侵染的敏感性增强,其受农杆菌侵染的细胞年龄就不能依据其外植体进行判断.当然对于外植体的发育阶段的确定是必要的.张建全等[23]对马铃薯反义AcInv基因,经农杆菌介导入生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究.结果表明,在愈伤组织诱导过程中,外植体的预培养为:茎段2d,叶盘3d效果较好;茎段和叶盘侵染时间分别达8min和10min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2d和3d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上产生苗,形成正常植株,其再生率为11.2%,聚合酶链反应(PCR)扩增检测表明,大部分转基因植株为阳性.另外判断某种植物对农杆菌侵染的敏感性,不能纯粹以一种或几种外植体来判断,必须研究尽可能多的外植体类型.以木薯胚状体萌发出的子叶为外植体,获得很高的瞬时表达[24].从组培角度来讲,所选的外植体必须具有较高的分生能力、脱性强的细胞.3.再生植株的细胞起源对转化的影响 成功转化的关键是将外源基因导入那些具有脱性强的细胞.农杆菌介导的转化方法主要作用于表层细胞,如果细胞起源于深层,则很难得到转化株,即使得到转化株,其转化频率也很低,且转化株表现为嵌合体,这就是所谓再生与转化的矛盾.在油菜的转化中Mukho2 padhyay[25]等发现以胚轴切段为外植体很容易得到转化体,而以子叶为外植体则相当困难.解剖学研究表明,同样起源于维管束薄壁细胞的芽的发生方式有两种:一种是位于切面的维管束薄壁细胞先产生愈伤组织,然后产生芽;另一种是芽直接离从切面450～625μm的维管束细胞不经愈伤而直接形成芽.以胚轴切段为外植体,两种再生方式都存在,而只能以第一种方式获得转基因植株.而以子叶为外植体,只能通过第二种方式再生植株,从1000个外植体中只得到两株嵌合的转化株.以此推测,在子叶外植体中,由于具有再生能力的细胞团距离切口较远,细菌较难感染这些细胞,因而影响转化株的获得.柳建军[26]等研究建立了一套简单、高效的辣椒遗传转化系统.利用根癌农杆菌介导的带柄子叶转化法将豇豆胰蛋白酶抑制剂(C pTI)基因转入辣椒栽培品种益都羊角椒中获得转C pTI基因植株.杨广东[27]等以12～14 d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体,经根癌农杆菌介导,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甜椒杂交种“中椒5号”和常规种“茄门”中,室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明,转基因植株对棉铃虫具有一定抗性.木薯的转化中,幼叶外植体切口细胞对农杆菌比较敏感,且能从幼叶诱导高频的胚状体的发生,但以此系统为基础的转化没有得到转化株,其原因是切口部位受细菌感染的细胞,只能呈现愈伤生长,而胚状体起源于离切口一定距离的内层维管束细胞,细菌难达到这些细胞,因而也难得到转化株[28].4.培养方法对转化的影响 转化所用的组培不同于纯粹的组织培养方法.农杆菌介导的转化要经过几个步骤:外植体接种农杆菌、与农杆菌共培.外植体在含抑制农杆菌及筛选转化体的药剂的培养基上培养,要受到农杆菌和药剂的胁迫.因此为保证转化细胞的生长,必须:①合理掌握接菌的数量、时间和共培的时间,注意解决瞬时表达效率高及随后而来的细菌增殖所导致的外植体不能生长的矛盾.有些植物外植体生长易受农杆菌侵染后的抑制,还有些嫩的外植体经农杆菌侵染后不能生长[29].②采用预培的方法以减轻伤害胁迫,调整细胞状态.预培养还有可能减少・81・伤害胁迫而有利于农杆菌的感染[23].③采用化学药剂缓解胁迫对外植体生长的抑制.硝酸银是抑制乙烯生成的抑制剂,具有促进形态发生的功能,所以在油菜转化的培养基中加入较高浓度的硝酸银(70～90nm olΠL)就能提高再生频率,且是在选择条件下获得转化体的必要条件[25].在葡萄的转化中,旺盛生长的胚性愈伤组织在接种农杆菌后,生长受抑制,组织褐化以至细胞死亡,据测试,这是细胞的过氧化造成的.后来有人用抗氧化剂DTT (dithiothreitol)和PVPP(polyvinypolypyrrolidone),可使被侵染的细胞恢复生长,有高达63%的外植体能产生胚状体,进而获得转化株[29]. T aylor等[30]通过改变木薯次生胚状体诱导的培养基,以G D基本培养基代替MS培养基,以Picoram代替2、4-D,经反复继代,获得一种脆性愈伤,以这种愈伤为外植体,采用基因枪法获得了转化株[31].以木薯体细胞胚状体萌发出的子叶为外植体能诱导器官发生并再生植株,且由于细胞源于切口及其附近部位[32],采用结合农杆菌介导的转基因方法业已成功地获得了木薯的转基因株[24].5.不同选择药物对转化效率的影响 由于在植物基因转化中,外源基因稳定的整合频率低,故如何选择适当的筛选标记,以准确、有效地分离转化与非转化细胞,且不干扰细胞的正常生长,也不干扰再生植株的产生,是转化成功的重要环节之一.转化常用的筛选标记有:新霉素磷酸转移酶(NPTII)、潮霉素磷酸转移酶(HPT或HPH)、PPT乙酰基转移酶(PAT)及二氢叶酸还原酶(DHFR)等基因. 杨广东等[33]在培养基中添加不同浓度的卡那霉素、头孢霉素和羧苄青霉素,观察抗生素对大白菜基因型G P -11种子发芽以及离体子叶再生的影响.结果表明,G P -11种子在含有200mgΠL卡那霉素的MS培养基上发芽生长时,幼苗子叶完全黄化,侧根数为0;随卡那霉素浓度的增加,芽、主根和侧根生长均受到一定程度抑制,但发芽率和发芽势不受影响.4d苗龄的离体子叶在含有10mgΠL卡那霉素并附加一定激素的改良MS培养基生长时,基本无绿芽诱出,在含7.5mgΠL和5mgΠL卡那霉素的培养基中,诱导的绿芽率只有32.5%和40.2%;在仅含3mgΠL卡那霉素的生根培养基中,小苗完全丧失生根能力.在添加浓度高至400mgΠL的头孢霉素或羧苄青霉素的诱芽培养基中,G P-11诱芽率为0,且它们之间差异不明显,但在添加头孢霉素或羧苄青霉素的生根培养基中,小苗生根依然正常.试验结果表明,在农杆菌介导的基因转化中,对大白菜转化苗筛选的卡那霉素浓度在10mgΠL左右是适宜的,添加的抑菌剂浓度在能控制农杆菌生长的同时,尽量降低浓度,最好不超过400 mgΠL;在诱导生根培养基中,卡那霉素浓度不宜超过3mgΠL.另外,对T0代转基因种子进行遗传分析时,在发芽培养基中添加卡那霉素浓度应该达到200mgΠL. NPTII作为一种选择标记基因,可用于多种作物的转化,其中筛选中常用的抗生素为卡那霉素和geneticin.某些单子叶植物能耐高浓度的卡那霉素,一般用geneti2 cin进行筛选.然而玉米的转化以200mgΠL的卡那霉素筛选时,仍能得到转化株[34].在水稻的转化中,卡那霉素筛选会干扰绿色植株的再生,而用庆大霉素则得到转化的绿苗,绝大多数对潮霉素比对卡那霉素敏感,潮霉素用于禾谷类作物的转化比卡那霉素效果好.PAT可用于单子叶植物及双子叶植物的筛选.植物细胞对叶酸类似物MTX(metholtreate)非常敏感.该化学物质主要抑制植物DHFR,而从大肠杆菌质粒R67分离得到的DHFR对MTX不敏感,将该基因转入烟草细胞后,再生的植株能抗MTX.采用该选择标记已获得小麦的抗MTX转基因株[35]. 另外,为了证实已经获得转基因植株,近几年人们一般不只是单一地采用抗生素标记,而是结合其他手段予以证实.如杨广东等[21]将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入大白菜自交系“G P-11”和杂交种“中白4号”,并获得了卡那霉素抗性植株.PCR检测和S outhern blot杂交证实,sck基因已整合进大白菜基因组中;豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明,大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性.室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明,转基因植株对菜青虫具有一定抗性.武东亮等[36]构建了人工合成的G FM CryIA 杀虫基因和经过修饰的C pTI基因的融合杀虫基因高效植物表达载体p G BIF4ABC.通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得42株卡那霉素抗性植株,用棉铃虫杀虫实验检验表明具有抗虫性.对其中7株烟草植株进行PCR 和S outhern印迹,4株烟草基因组中有融合杀虫基因的整合,为转基因植株.其中2株的抗虫性为高抗,1株中抗,1株不抗.6.叶绿体转化与细胞核转化的不同影响 近20年来,外源基因向核中转化一直是转基因的主要方向,然而,随着研究的不断深入,人们发现核转化有很多弊端,如核基因组大、背景复杂,外源基因整合位点和整合拷贝数难以控制,易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象[37].自1988年有些学者相继开展了叶绿体遗传转化研究,使这项新的遗传转化技术的优越性・91・和发展前景日益为人们所认识并受到重视.到目前为止,已经在烟草[38]、水稻[39]、拟南芥[40]、马铃薯[41]和油菜[42]等植物中实现了叶绿体的转化,这一转化系统已开始成为植物基因工程中的新的生长点.四、结束语 农杆菌是天然的遗传工程师,自1983年被首次用于烟草基因转化以来,农杆菌已经广泛应用于高等植物的转化.目前由农杆菌介导的转基因植物已扩展到经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木及牧草等,有些已经实现了商品化,在改良植物的遗传性状方面发挥了重要作用[43].但是,农杆菌转化外来基因到植物体内是一个复杂的过程,目前有一些重要的作物或者它们的重要品种仍然不能用农杆菌来转化,或者转化效率太低.可以预见,随着对农杆菌感染机制的进一步阐明,影响农杆菌转化的因素进一步明朗化,人们按照自己的愿望设计未来作物将不再是梦想,遗传转化技术在植物分子改良以及分子生物学的研究中,也将会有更多的应用、更多的新突破.(2002年7月4日收到)刘石泉 硕士生,上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234余沛涛 副教授,上海师范大学生命与环境科学学院,上海2002341 刘谦,朱鑫泉.生物安全.北京:科学出版社,2001:452462 M etcalfe D.D.,Astw ood J.D.,T ownsend R.,et al.Assessment of the allergenic from genetically engineered crop plant.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996;36:S16521863 S imm M.G erman geneticists get s ome relief.Science,1994;263(7):23 4 陈祯.高等植物转基因研究.生物学通报,2002;3(8):6285 徐春晖,夏光敏,贺晨霞.农杆菌转化系统研究进展,2002;14(4): 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农杆菌介导遗传转化原理
农杆菌介导遗传转化原理农杆菌介导遗传转化是一种常用的遗传工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。
它的原理是利用农杆菌与植物之间相互作用的特点，通过构建适当的载体将外源基因导入农杆菌，然后通过农杆菌感染植物的细胞，将外源基因转移到植物细胞内，使其表达。
农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，具有携带可导致植物组织的病变形成的质体。
这种质体称为农杆菌的转座质粒（Ti质粒），其中包含了表达病原蛋白的基因。
在自然界中，农杆菌通过感染植物细胞并将自身质粒中转座基因转移到植物细胞中，从而引起植物组织的异常增生和瘤形成。
1.构建适当的载体：首先需要构建一个适合农杆菌介导遗传转化的载体，该载体通常包含农杆菌的图纸质粒与外源基因。
2. 转座基因的导入：将外源基因转移到农杆菌中，一般利用基因工程技术将外源基因插入到农杆菌的质粒中，通常选用表达农杆菌亲和素（VirA/VirG）基因的质粒。
这些基因能够诱导农杆菌感染植物细胞并转座到植物基因组中。
3. 农杆菌感染植物细胞：利用农杆菌对植物细胞的感染能力，将转座基因导入植物细胞中。
通常使用离体培养的植物组织进行转化，如幼苗的叶片、幼芽、胚轴等。
在转化过程中，植物组织被浸泡在含有农杆菌的培养液中，农杆菌利用其细菌素（VirE/VirF）蛋白，将转座质粒导入植物细胞中。
4.外源基因的整合与表达：经过转化的植物细胞在激素的诱导下会形成植物的癌瘤样结构，其中农杆菌转座质粒中的外源基因将被整合到植物基因组中。
随着癌瘤的生长，外源基因会在植物组织中得到表达。
5.植物再生和筛选：癌瘤样组织可通过激素的去除和调节激素比例来诱导植物再生。
然后通过选择合适的培养基和条件培养植物胚，获得含有外源基因的转基因植株。
农杆菌介导遗传转化技术广泛应用于植物基因工程中，可用于植物基因功能研究、育种改良、生产含有特定蛋白质的转基因植物等。
这种遗传转化技术具有高效性、简便性和广泛适用性的优点，已被应用于多种作物植物的转基因研究和应用实践中。