农杆菌介导玉米转基因的研究

农杆菌介导玉米转基因的研究 摘 要：转基因技术在玉米育种中运用很广泛，本文主要通过查阅文献，结合专业所学知识，从转基因技术、农杆菌介导的受体以及影响农杆菌转化的因素和玉米转基因的现状等方面，综述了在玉米中农杆菌介导转基因的研究进展。 关键词：玉米，转基因，农杆菌介导法，育种

转基因作物指将一种或几种植物、动物乃至人类的基因导人某种作物，使其基因重新组合，增强其抗逆性、抗病虫害、抗杂草等优良性状。转基因玉米的研究与开发已取得了显著进展。许多外源基因已经被导入玉米，以改良玉米的某些性状，并取得了很好的成效。２０世纪８０年代后期，一些研究者尝试用根癌农杆菌接种玉米幼苗。采用病毒感染以及外源DNA与花粉混合授粉等方法，试图将外源DNA导入到玉米中，虽得到一些转化表现，但均未得到分子生物学证据。Fromm等用电激法把抗除草剂基因Pat转入玉米原生质体中，开创了玉米遗传转化研究的先河。Rhodes等用电激法把NptII基因转入玉米原生质体中，经过抗性筛选、分化再生得到抗Km的转基因植株。Fromm、Gordon－Kamm等利用基因枪轰击原生质体获得可育的玉米转基因植株。农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段。根癌农杆菌是许多双子叶植物肿瘤病的病原菌，它含有Ti质粒，其中的T-DNA能够转移到植物基因组上。农杆菌在双子叶植物中的转化已经十分完善，但是由于玉米等单子叶植物不是其天然的寄主，所以转化工程比较困难。但最近几年的研究表明农杆菌可以介导玉米上的基因转化。 1.常用玉米转基因的方法 在现代育种技术中，常用的转基因方法往往结合使用，以提高转基因的效果。明小天等通过基因枪提高了根癌农杆菌转化水稻的转化效率蚓。花粉管通道法既可以用普通的质粒，也可用农杆菌Ti质粒。另外，还有PEG介导法、超声波法、子房注射法、阳离子转化法和电击法等。 1.1 基因枪法 1989年Klein第1次使用基因枪介导法转化玉米。。Philippe等用山梨糖醇和甘露醇处理A188XB73的胚性悬浮细胞，用基因枪把GUS基因导入玉米，结果表明经山 梨糖醇和甘露醇处理过的细胞转化频率提高2.7-6.8倍。基因枪法是玉米遗传转化的主要方法，受体组织类型对基因枪法的转化有一定的影响。基因枪法具有不受基因型的限制、受体广、转化率高的优点，但外源基因整合的拷贝数多。 1.2 花粉管通道法 花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源基因沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法始于1975年Pandey对烟草的研究。Hess报道了利用外源DNA花粉得到花色变异的矮牵牛。周光宇在分析远缘杂交成功经验的基础上，提出了DNA片段杂交假设，为花粉管通道法提供了理论基础。花粉管通道法无需建立愈伤组织等组织培养体系，同时不受植株基因型的限制，但由于授粉时间短，使得不能转化大片段的外源DNA。 2.根癌农杆菌介导玉米遗传转化 根癌农杆菌转化系统具有许多优点：成功率高，效果好，外源基因整合位点较稳定，且大多数是单位点整合；显性表达率较高，共抑制现象相对较少；遗传稳定性好，大多符合孟德尔遗传规律等。利用该方法转化植物的研究始于20世纪80年代初。由于单子叶植物不是农杆菌天然受体，所以遗传转化研究落后于双子叶植物。Byteier用带有Nos-nptII的Ti质粒转化刁石柏愈伤组织，得到了抗Km生植株。 2.1 农杆菌介导转化玉米的研究历程 付永彩将农杆菌介导禾本科作物转化的研究历程分为3大阶段，所以农杆菌介导的玉米转基因研究也可分为3个阶段。 第1个阶段，证明农杆菌能够侵染玉米。Grimsley等将带有MSV基因的胭脂碱型根癌农杆菌注入玉米幼苗，发现98%叶片出现感染症状，而条斑病毒与玉米单独共培养时不能感染，说明可以通过农杆菌介导病毒进入玉米细胞。 第2个阶段，获得转化细胞，但未能获得转基因植株。Shen等用农杆菌与芽尖共培养、Tshige用农杆菌转化胚性愈伤都得到了稳定的转化体系但未得到植株。 第3个阶段，获得转基因植株，并有分子杂交证据。Gould报道了农杆菌转化玉米茎尖分生组织获得成功。Ishida等构建农杆菌超级双元载体转化体系，使转化频率高达5%-30%，并且用农杆菌浸染A188的幼胚，得到的转Bar、GUS植株70%可育。Escudero等用农杆菌浸染玉米幼胚，发现不同时期，幼胚感染率不同，而且发现 T-DNA的转移受到基因国内玉米农杆菌的转化研究起步较晚。1999年黄璐、卫志明首次用农杆菌介导法把NptII、GUS、Hpt基因转入玉米，转化率为8.1%。张荣等用农杆菌浸染玉米幼胚，初步建立转化体系，但未获得转化植株。 2.2 农杆菌介导的转基因受体 2.2.1原生质体,Fromm、Rhode、Wang等以玉米的原生质体为受体，对玉米进行遗传转化。作为转化受体，原生质体具有转化效率高、嵌合体少、适宜各种转化系统等优点，但原生质体同时具有培养周期长、再生频率低、遗传稳定性差、再生植株变异大等缺点。马力耕等以黄化叶片为材料，通过2步酶解获得了原生质体。文仁来等通过酶解以花药培养获得的单倍体愈伤组织，得到的原生质体可用于体细胞杂交。支那英等将小麦和玉米的原生质体进行杂交得到体细胞杂种。 2.2.2愈伤组织，Armstrong把玉米愈伤组织分为2种类型：I型，白色，紧密坚硬，干燥，表面皱起，生长慢，易发生器官分化；II型，黄绿色，颗粒状，较紧密，较湿润，生长快，易发生胚状体。II型是目前玉米转化的常用受体：具有较高的转化频率和再生频率。但玉米胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制，能诱导较高胚性愈伤组织的报道目前仅局限于A188、B73等少数基因型材料中。目前已经从玉米叶片、幼穗、茎尖、幼胚、花药等外植体诱导出愈伤组织，其中幼胚是较好的外植体。同时，愈伤组织的诱导还受到外植体生理状态和放置方式的影响。 2.2.3丛生芽,丛生芽是由于玉米茎尖伸长受阻，而从叶腋中长出的大量不定芽。每个不定芽都有形成幼苗的能力，而丛生芽的诱导相对愈伤组织容易，并且不用再诱导发芽，从而提高后代的生成率，降低工作量。李国圣等利用玉米丛生芽，结合基因枪法获得转基因植株懈。 2.2.4悬浮细胞,通过细胞悬浮液分散细胞，并将其分散培养，在多次继代培养后，将细胞团诱导成小的愈伤组织，然后在固体培养基上继续培养、分化获得再生植株。孙世孟等利用获白X莱1029的愈伤组织，建立了4个悬浮细胞系，得到7个再生植株。向太和等提出悬浮细胞系建立的几个关键技术及判断胚性悬浮细胞系的参考标准。马莲菊等认为，基因型和培养基对悬浮细胞系的建立有影响，尤其是基因型。 2.2.5子房和幼穗,虽然愈伤组织、悬浮细胞、原生质体、丛生芽都可以获得 转基因植株，但T0代是嵌合体，不容易得到转基因种子，而且在嵌合体中基因易丢失。若通过雌配子或刚刚授精的合子，则T0代就是带有目的基因的转基因种子，而后代基因保存中只是进行自交，基因检测较容易。由于农杆菌具有单细胞侵染能力，所以未授粉的成熟雌配子浸在大量农杆菌液体中，有可能被农杆菌侵染而获得转基因植株。由于雌配子能够忍受外源DNA或变异染色体，所以可以通过雌配子传递以避免嵌合体存在于后代种子，从而得到稳定的后代。 2.3 影响农杆菌转化的因素 农杆菌介导遗传转化主要包括5个过程：①农杆菌在植物细胞上的吸附；②Ti质粒上的Vir区被激活；③T-DNA切割与T-DNA复合物的形成；④T-DNA复合物进入植物细胞；⑤T-DNA整合到植物染色体上。农杆菌介导遗传转化关键在于农杆菌能否在植物细胞上吸附，Vir区基因是否被诱导，植物感受态细胞是否存在。 2.3.1 Vir区基因的诱导, 单子叶植物与双子叶植物对创伤的反应不同，单子叶伤口附近常发生木质化或硬化，细胞伤流液中不含有Vir基因诱导物。所以，目前主要采用添加诱导物的办法诱导Vir基因的表达。现已发现有７种酚类化合物与Vir基因表达有关，其中AS和OH-AS最为有效。另有报道指出一些小分子量糖类，如半乳糖和葡萄糖等，在AS浓度很低或没有时也可极大地促进Vir基因的有效表达。 2.3.2 感受态细胞,Sehlappi和Hoil用Agroinfection法研究不同发育阶段3个玉米品系幼胚对农杆菌的感受性，发现授粉后14-16d的幼胚感染频率最高。Jesus等在玉米分生细胞的T-DNA转化中发现授粉后10d前的未成熟胚不能被农杆菌感染，而授粉12-30d的未成熟胚转化频率逐渐增高。夏光敏等研究了７种不同基因型小麦不同发育阶段的幼胚及胚性愈伤组织转化，发现生长旺盛的II型愈伤组织是适宜的转化材料。由此可见，不同时期的细胞或组织对于感染的成功与否非常重要。 2.3.3其他因素,不同菌株或载体对玉米的转化有一定的影响。目前玉米上普遍使用的菌株是LBA4404和EHA101。研究发现，玉米幼嫩组织分泌物中有特异阻遏毒性基因表达的物质MDIBOA。研究人员正在寻找一种可抵抗MDIBOA的农杆菌菌株，以期能提高转化效率。受体的基因型也是影响转化效率的一个重要因素。许多试验表明，大多数玉米基因型细胞表面缺乏供农杆菌识别并与之附着的位点。 2.4 标记基因 标记基因的作用是在相应抗生素选择压力下，筛选出转化体。目前玉米遗传转化中使用的标记基因有NptII、npt和Bar等。Hpt和Bar作为标记基因很好，但玉米对Km不敏感，使用NptII选择效果不好。 3.应用 3.1 抗虫基因 张艳贞等以玉米自交系340、4112为材料，用带有PGBII04质粒的根癌农杆菌LBA4404转化幼胚及其初始愈伤组织，培养3d，在PPT培养基上连续筛选3代，获得了再生植株。张艳贞等发现抗性植株平均发生率11.21%，平均转化率2.35%，降低温度至22℃共培养，转化率可达4.44%，部分转化植株已经结实。权瑞党等利用农杆菌AGL0侵染玉米胚性愈伤组织，将雪花莲凝聚素基因转入玉米骨干自交系齐319和掖515中，获得转基因植株。伍晓丽等利用带质粒PBUSCK-Hyg农杆菌LBA4404将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因cpti转入玉米自交系18-559中，cpti对玉米螟、粘虫、玉米根叶甲等多种害虫具有广谱抗性。 3.2 抗病毒 美洲商陆抗病毒蛋白是从美洲商陆植物体内提取出来的一种碱性蛋白，属I型核糖体失活蛋白，具有广谱抗病毒能力。它对7个植物病毒属成员具有抑制作用，并且对细菌、真菌和H/V有一定的抑制作用。孙晓丽等将PAP转入玉米，得到了具有广谱抗性的玉米植株。 3.3抗盐 尹小燕等以玉米骨干自交系DH4866、齐319和AtNttXl和Hpt基因转入玉米培养细胞，经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织和再生植株，经PCR检测和Southem．blot验证，确定了22.8%再生植株为转基因植株。农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响。外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性，在部分株系中表现出孟德尔遗传规律。耐盐筛选表明，一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性，部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长。 3.4工程制药上的应用 玉米不仅是重要的粮食，而且是很好的生物反应器，利用玉米可以生产高效