当归多糖联合阿糖胞苷对移植性人白血病小鼠模型肝脏的作用机制

当归多糖联合阿糖胞苷对移植性人白血病小鼠模型肝脏的作用机制白血病是造血系统的恶性肿瘤，白血病细胞极易进入血液并浸润、损伤肝脏。

本室既往研究表明，当归多糖（APS）能抑制白血病细胞的增殖和分化，但治疗白血病时对肝脏的影响未见报道。

本研究通过尾静脉移植K562细胞建立人白血病NOD/SCID小鼠模型，通过腹腔注射APS、阿糖胞苷（Ara-c）以及两者联合（APS+Ara-c）治疗白血病小鼠，研究对肝脏的影响及其机制。

结果表明，与白血病小鼠对照组相比，APS或Ara-c治疗后，外周血白细胞数显著降低；肝功能损伤减轻：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性与总胆红素（TBiL）降低，白蛋白（Alb）升高；肝脏抗氧化能力下降得以抑制；抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）降低；炎症因子IL-1β，IL-6水平降低；肝指數减少；白血病细胞对肝小叶浸润减少，且凋亡率增加。

APS+Ara-c联合治疗后肝脏病理恢复更加显著。

综上所述，APS和Ara-c可减少肝脏内白血病细胞聚集，降低肝功能损伤和炎症因子水平，提高肝组织抗氧化能力，提示APS+Ara-c 联合治疗可以发挥更好作用。

标签：K562 细胞株；人白血病小鼠模型；当归多糖；阿糖胞苷；肝损伤白血病是造血系统的恶性肿瘤，白血病细胞具有较强的游走能力，很容易离开原发部位进入血液并浸润肝脏、肺等非造血器官。

迄今，治疗白血病的药物主要以非靶向细胞毒药物为主，如甲氨蝶呤、6巯基嘌呤、阿糖胞苷等，它们对正常的组织细胞也会造成严重损害。

肝脏是大多数药物分解代谢的器官，抗肿瘤药物在治疗肿瘤时对肝脏损伤值得高度关注。

有研究证明，抗白血病药物在肝脏内潴留时间较短，且药物浓度相对较低，这些因素可能使肝脏成为白血病细胞的庇护所[1]。

当归多糖（Angelica polysscharides，APS）是传统补血中药当归的主要有效成分之一。

本室既往研究表明，APS对正常细胞和肿瘤细胞存在双向调节作用，即APS既能促进造血干/祖细胞的增殖分化，又能抑制白血病细胞的增殖并诱导其向成熟方向分化[2-3]。

本研究在成功建立人白血病NOD/SCID小鼠模型基础上，通过APS，阿糖胞苷（Ara-c）单独以及联合治疗白血病模型小鼠，观察在治疗白血病时对肝脏形态与功能的影响及其相关作用机制。

1 材料与方法1.1 动物雄性NOD/SCID小鼠，8～10周龄，体重18～23 g，由重庆医科大学实验动物研究所提供。

1.2 药品、试剂与仪器当归多糖购自陕西慈缘生物技术有限公司（批号CY130421，甘肃岷县当归提取，纯度95%，注射用生理盐水配制为20 g·L-1，过滤除菌）。

阿糖胞苷（国药准字H20055127，相对分子质量279.68，注射用生理盐水配制为2.5 g·L-1）。

SOD，MDA，GSH，GSH-Px购自南京建成生物工程研究所。

IL-1β，IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

TUNEL 试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

550酶标仪（BIORAD），CM 1950冰冻切片机（Leica），IX71-A12FL/PH荧光显微镜（Olympus），HFX-IIA光学显微镜（Nikcon）。

1.3 人白血病小鼠模型的建立动物随机分为正常组、模型组、当归多糖治疗组（APS组）、阿糖胞苷治疗组（Ara-c组）、当归多糖与阿糖胞苷联合治疗组（APS+Ara-c组）。

除正常组注射等量生理盐水外，其余组按本课题组方法，建立移植性人白血病NOD/SCID小鼠模型[4]，即给小鼠腹腔注射环磷酰胺每只2 mg，qd，2 d，第3天从尾静脉注射移植对数生长期K562细胞（2×107个/只），接种K562细胞30 d后模型建立成功。

从第31天开始分别腹腔注射APS（200 mg·kg-1·d-1），Ara-c（2.5 mg·kg-1·d-1）以及APS （200 mg·kg-1·d-1）+Ara-c（2.5 mg·kg-1·d-1）联合治疗各组小鼠，共14 d，接种K562细胞45 d处死小鼠取材。

1.4 外周血白细胞计数与分类和肝功能检测各组小鼠取尾静脉血，自动血细胞分析仪测定白细胞总数，血涂片经Wright′s染色，光镜下分类计数。

取小鼠眼球血制备血清，全自动生化仪检测ALT，AST，Alb，TBiL等肝功能指标。

1.5 肝指数与肝组织病理学检查颈椎脱臼处死小鼠前称各组小鼠体重，迅速取下整体肝脏，吸去血液后称肝脏质量。

按公式计算肝指数：肝指数=肝脏湿重（mg）/体重（g）。

取各组小鼠新鲜肝组织进行冷冻切片，厚度10 μm，HE和TUNEL染色，观察肝脏病理形态学与细胞凋亡情况，具体操作按照说明书进行。

1.6 肝组织抗氧化能力的检测各组小鼠分别取0.5 g肝组织，制备10%的组织匀浆，留取上清用于后续检测。

BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组上清液的蛋白浓度，SOD，MDA，GSH，GSH-Px检测按照试剂盒说明书进行。

1.7 肝组织炎症细胞因子反应检测1.6项步骤制备的上清用于检测IL-1β，IL-6，具体操作方法均按照说明书进行。

1.8 统计学处理所有数据以±s表示，运用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，LSD法进行组间两两比较，以P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果2.1 外周血白细胞计数以及分类接种K562细胞45 d，模型组与正常组相比较，外周血有核细胞数显著增加。

各治疗组与模型组相比，白细胞总数显著减少，中性粒细胞百分比有下降趋势，APS+Ara-c联合治疗与单独治疗相比，白细胞和中性粒细胞数下降明显，见表1。

表1 小鼠外周血白细胞计数及分类比较（±s，n=5）Table 1 Comparisons of WBC count and classification among the groups（±s，n=5）注：与正常组比较1）P＜0.05；与模型组比较2）P＜0.05。

2.2 肝功能指標检测接种K562细胞45 d，模型组与正常组相比较，血清检测肝功能指标ALT，AST，TBiL以及肝指数均增加，Alb含量降低。

与模型组相比较，APS治疗组的ALT，AST和肝指数显著降低；Ara-c组和APS+Ara-c 组Alb和肝指数显著降低，TBiL显著升高，ALT和AST无明显差异。

联合治疗与单独治疗相比，ALT，AST和肝指数显著降低，Alb显著升高，见表2。

表2 小鼠肝功能血清各指标以及肝指数的差异（±s，n=5）Table 2 The difference of live function and liver index among the groups（±s，n=5）注：与正常组相比1）P＜0.05；与模型组相比2）P＜0.05；与联合治疗相比3）P＜0.05（表3，4，图1同）。

2.3 肝组织抗氧化损伤能力检测模型组与正常组相比较，抗氧化酶SOD含量，GSH和GSH-Px活性均显著降低，MDA含量显著增高。

APS和Ara-c单独治疗与模型组相比，SOD含量、GSH和GSH-Px活性均显著升高，MDA含量显著降低，APS+Ara-c治疗组与单独治疗组比较，SOD含量，GSH和GSH-Px活性均显著升高，MDA含量显著降低，见表3。

2.4 肝组织炎症因子检测模型组与正常组相比较，肝组织炎症细胞因子IL-1β，IL-6浓度均显著升高。

各治疗组与模型组相比，IL-1β，IL-6浓度均显著降低，联合治疗与单独治疗相比，IL-1β，IL-6浓度均显著降低，见图1。

表3 小鼠肝组织SOD，MDA，GSH，GSH-Px的比较（±s，n=5）Table 3 Comparisons of SOD，MDA，GSH and GSH-Px in the liver among the groups（±s，n=5）图1 小鼠肝组织炎症细胞因子IL-1β，IL-6浓度的比较Fig.1 Comparisons of the concentration of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in the liver among the groups2.5 肝组织病理学检查模型组与正常组比较，肝组织有明显浸润的白血病细胞，肝细胞空泡样变，经APS和Ara-c单独治疗后，肝组织中浸润的肿瘤细胞明显减少，肝细胞空泡仍严重，两者联合治疗后炎症及病理变化减轻，见图2。

2.6 肝组织内凋亡细胞阳性率检测模型组与正常组相比，肝组织损伤严重，凋亡细胞阳性率增加，经APS，Ara-c单独和APS+Ara-c治疗后，凋亡阳性率显著增加，联合治疗与单独治疗相比，凋亡细胞阳性率显著增加，见图3，表4。

3 讨论迄今，白血病的治疗仍主要采用大剂量联合化疗，这种治疗方法对机体的造血系统和免疫系统破坏最大，对全身各组织器官的损伤也极大，病人最终多死于化疗所致全身衰竭。

由于肝脏特殊的解剖结构和生理功能，抗肿瘤药物很容易造成肝脏损害，且研究表明[5]，抗白血病药物在肝脏内潴留时间较短，且药物浓度相对较低，这些因素可能使肝脏成为白血病细胞的庇护所。

A.正常组；B.模型组；C.APS组；D.Ara-c组；E.APS+Ara-c组（图3同）。

图2 各组小鼠肝脏的病理变化（HE，×200）Fig.2 The pathological changes in the liver of mouse among the groups（HE staining，×200）图3 各组小鼠肝组织细胞凋亡情况（TUNEL，×200）Fig.3 The apoptotic positive cell of the liver among the groups（TUNEL staining，×200）本室既往研究表明，APS对正常的造血细胞和白血病细胞存在双向调节作用，即APS既能促进造血干/祖细胞的增殖分化，又能抑制白血病细胞的增殖并诱导其向成熟方向分化[2-3]，且APS具有增强机体免疫系统的功能，提高组织抗氧化损伤能力[6-7]。

本室既往已经成功建立人白血病细胞移植小鼠白血病模型，并证明了移植白血病细胞的生物学特点[4]。

本研究在成功建立人白血病NOD/SCID小鼠模型基础上，旨在通过APS，Ara-c单独以及联合治疗白血病模型小鼠，观察在治疗白血病的同时对肝脏形态与功能的影响及其作用机制。