小鼠早期胚胎发育的研究 )
小鼠胚胎操作实验手册
小鼠胚胎操作实验手册小鼠胚胎操作实验手册目录1. 引言1.1 胚胎操作实验的意义1.2 实验前的准备工作2. 实验器材和试剂准备2.1 实验器材清单2.2 试剂准备和储存要点3. 小鼠胚胎操作步骤3.1 小鼠交配和胚胎收集3.2 胚胎培养和处理3.3 胚胎移植和植入3.4 胚胎标记和观察4. 数据记录和结果分析4.1 数据记录要点和格式4.2 结果分析和统计方法5. 安全注意事项和实验规范5.1 生物安全操作要求5.2 实验规范和伦理要求6. 实验故障排除和常见问题解决6.1 常见操作问题和解决方案6.2 实验故障排除建议7. 参考文献和扩展阅读7.1 相关研究文献推荐7.2 扩展阅读和资源推荐引言1.1 胚胎操作实验的意义胚胎操作实验是研究胚胎发育和基因功能的重要手段，通过对小鼠胚胎的操作和处理，可以揭示胚胎发育的机制和影响因素。
1.2 实验前的准备工作在进行胚胎操作实验之前，需要进行充分的准备工作，包括实验器材和试剂的准备、实验操作流程的熟悉、实验动物的选取和饲养等。
实验器材和试剂准备2.1 实验器材清单列举常用的器材和仪器，并说明其用途、规格和供应商信息，包括显微镜、离心机、培养皿、吸管、移液器等。
2.2 试剂准备和储存要点介绍常用的试剂，包括培养基、胚胎染色剂、抗体等，说明其配制方法、储存条件和稳定性要求。
小鼠胚胎操作步骤3.1 小鼠交配和胚胎收集阐述小鼠交配的方法和时间安排，以及胚胎的收集和处理步骤，包括解剖、体外培养和胚胎筛选等。
3.2 胚胎培养和处理详细描述胚胎的培养方法和处理步骤，如细胞培养、转染、基因敲除、基因表达等实验操作。
3.3 胚胎移植和植入介绍胚胎移植和植入的方法和注意事项，包括手术操作、不同器官的移植方式和移植成功率的评估等。
3.4 胚胎标记和观察说明如何对胚胎进行标记和观察，包括荧光染料标记、显微镜观察和胚胎发育阶段的划分等。
数据记录和结果分析4.1 数据记录要点和格式指导实验者如何记录实验过程中的数据和结果，包括实验条件、样本信息、实验数据和观察结果等，并规范化数据记录格式。
不同发育时期小鼠卵巢腔前卵泡的分布及形态学研究
不同发育时期小鼠卵巢腔前卵泡的分布及形态学研究张耀君【摘要】通过石蜡切片-HE染色技术，系统研究小鼠生后不同发育时期即3，5，7，10，15，20，30，45 d卵巢的卵泡分布、形态结构及发育规律。
研究结果表明，随着小鼠卵巢的发育，由最初的无皮髓质之分到皮髓明显可见，卵泡从只见聚集呈条索状到发育成原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡，直至有腔的形成。
从数量上看，原始卵泡逐渐减少，初次级卵泡逐渐增多，有腔卵泡数量也从无到有从少到多。
卵巢由最初的无卵泡发育到有许多大小不等、处于不同发育时期的卵泡、大部分有腔样结构。
在此发育过程中会伴有卵泡的闭锁。
小鼠卵巢中各级腔前卵泡的分布具有区域性。
%In this paper,we investigated follicledistribution,morphological structure and rule of development of ovary at postnatal 3,5,7,10,15,20,30,45 days of ages using by paraffin section-HE staining method. The results showed that with the development of mouse,ovary develops from non-cortex and medulla assigned in the initiato the situation that cortex can be seen apparently. Follicles developed from the streak were gathered so as to develop into primordialfollicles,primary follicles,secondary follicles,until cavity formation. Judging from the numbers, primordial follicles decreased in the initial stage follicles gradually,while primary follicles and secondary follicles increased gradually,and the number of antral follicles was from scratch to less than mature follicles relatively. Developing from the initial scratch to many non-sizes at different developmental stages of follicles,the majority of ovarianfollicle has cavity-like structure. The distribution of follicles in the ovaries is regional.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】4页(P1432-1435)【关键词】小鼠;腔前卵泡;分布;形态学【作者】张耀君【作者单位】渭南职业技术学院护理系，陕西渭南 714000【正文语种】中文【中图分类】S814.1卵泡是卵巢的结构和功能单位，卵巢内卵泡的数目、发育、成熟和闭锁，是反映卵巢内分泌功能和生殖能力的重要标志.关于哺乳动物胚胎期卵巢的组织发生，国内外学者已做过大量研究，但对生后发育进行研究的报道很少，且缺乏系统性［1-2］.本文通过石蜡切片-HE染色技术，系统研究小鼠生后不同发育时期腔前卵泡在卵巢内的分布状况及发育规律，选择适龄小鼠，分离出高质量的腔前卵泡奠定基础，此外，腔前卵泡的组织学特征还可为体外培养过程中卵泡发育状况提供参考.1.1 卵巢来源实验所用昆明系小白鼠从第四军医大学动物实验中心购买，买回后饲养，自然光照，自由摄食饮水.实验所需卵巢从生后3，5，7，10，15，20，30，45 d的小鼠中摘取.1.2 卵巢组织切片的制作随机取上述8个不同时期的小鼠卵巢，颈椎脱臼处死，打开腹腔取出卵巢，观察卵巢的解剖学位置、形态.将卵巢用磷酸缓冲液冲洗1～2次，固定于10%中性甲醛溶液.24～48 h后，然后按照常规切片制作方法进行制片.进行石蜡连续切片的过程中，切片厚度6～8 μm，每隔8张切片留连续切片8～10张切片.1.3 试验方法试验分为8组，每组取4个卵巢，每个卵巢随机取不同切面的20片组织切片，在倒置显微镜下观察卵泡在卵巢中的分布情况，各级卵泡的形态特征，测量腔前卵泡的直径及对应卵母细胞的直径，颗粒细胞的层数和观察透明带出现情况.2.1 不同发育时期小鼠卵巢的一般形态结构不同发育时期的小鼠在卵巢的形状上有较大的变化.生后20 d之前的卵巢表面光滑，呈浅红色；20 d之后期表面凸凹不平，有成熟卵泡突于表面变得不光滑，呈粉红色；35 d之后即可排卵，成熟卵泡与黄体可突出于卵巢表面，有的则无.3 d小鼠的卵巢无皮质髓质之分，实质内卵母细胞聚集呈条索状或团状，细胞边界不清，周围有扁平的卵泡细胞环绕，未见卵泡（图1 A）；5 d小鼠的卵巢，周边部可见原始卵泡出现，且有的聚集成簇（图1 B）.7 d小鼠的卵巢原始卵泡明显可见，数量增多，且常成群分布.初级卵泡也可见到，但数量不多，位于卵泡的里层（图1 C）.10 d小鼠的卵巢初级卵泡明显可见，数量较多且分布均匀（图1 D）.15 d小鼠的卵巢次级卵泡明显可见，有皮质髓质之分，但不明显（图1 E），20 d的小鼠卵巢，小米粒样外观，次级卵泡明显变大，有腔样结构产生（图1 F）.30 d后皮髓区分明显，表面上皮为单层立方或单层扁平，可见不同发育阶段的卵泡，并有卵泡闭锁（图1 G）.45 d后皮髓质明显可见，皮质部较厚，占卵巢实质的大部分，为致密结缔组织、染色较深、内有许多大小不等、处于不同发育时期的卵泡，且大部分有腔样结构（图1 H）.发育不同程度的生长卵泡以不同深度分布在卵巢皮质（图1 I）.2.2 小鼠腔前卵泡直径、卵母细胞直径和颗粒细胞层厚度的测量从表1可见，在次级卵泡之前，卵泡和卵母细胞直径都相应地增加.次级卵泡发育后期，卵泡及卵母细胞直径急剧增加，颗粒细胞层厚度随卵母细胞直径的增加而增加.2.3 不同发育时期小鼠卵巢各级腔前卵泡形态2.3.1 原始卵泡一般来说由中央的卵母细胞和外包一层扁平卵泡细胞组成，卵泡细胞体积小，紧贴卵母细胞.原始卵泡单个或三五成群的不均匀的分布于皮质浅层（图1 J）.卵母细胞呈圆形或扁圆形，卵母细胞胞质染粉红色，均匀一致，卵母细胞中有一个较大的核（图1 K）.这个时期的卵黄膜还没有形成.原始卵泡的平均直径约为（28.53±2.53）μm.卵母细胞的平均直径为（19.83±2.54）μm.生后7 d 的卵巢卵泡主要以原始卵泡形式存在，且比较均匀地分布在卵巢的皮质表层（图1 C）.生后10 d的卵巢的原始卵泡开始减少，体积变大并逐渐发育为初级卵泡（图1 D）.生后15 d的卵巢的原始卵泡明显减少，卵泡主要以初级、次级卵泡的形式存在（图1 E）.2.3.2 初级卵泡初级卵泡，卵母细胞体积逐渐增大，卵泡细胞为单层扁平变为单层立方形或矮柱状，并开始增殖.一层颗粒细胞及基膜细胞包绕在卵母细胞周围，早期无卵泡膜结构.卵泡膜细胞和卵泡细胞之间为基膜（图1 L）.在初级卵泡中卵泡的层数不变，颗粒细胞以及卵母细胞会增长，但初级卵泡的大小差异不大.初级卵泡的直径为（44.06±1.93）μm.卵母细胞的直径为（29.83±2.35）μm.初级卵泡在生后10 d的卵巢数量增多（图1 D）.2.3.3 次级卵泡次级卵泡，卵母细胞迅速增大，颗粒细胞由单层扁平变为单层立方或单层柱状或复层（2～4层），次级卵泡逐渐移至皮质深层，基膜外形成明显的卵泡膜，卵泡膜逐渐加厚变得清晰，卵母细胞由卵泡细胞紧紧包围（图1 M）.随着卵泡细胞层增殖，卵泡细胞会排列疏松，靠近卵母细胞的卵泡细胞紧密地包围着卵母细胞，此时期，次级卵泡的直径约为（106.68±6.67）μm，卵母细胞的直径约为（49.84±6.71）μm，颗粒细胞增至4～6层.次级卵泡在15 d时期数量增多（图1 E）.2.4 小鼠腔前卵泡在不同发育时期卵巢中的分布小鼠的腔前卵泡分布在卵巢的皮质部，其中原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的分布具有明显的区域性.在卵巢皮质的最外层分布有大量的原始卵泡，密度较高，有的成簇可见（图1 N）；7 d小鼠的原始卵泡较为密集，常集群分布，而30 d小鼠和45 d小鼠的原始卵泡则较为稀少，散布于皮质外层（图1 G、图1 H）.初级卵泡一般出现在原始卵泡层的下面，10 d小鼠的初级卵泡常有集群（图1 O）.次级卵泡则多数位于初级卵泡的里面，即最内层，在皮质部与髓质部的交界处分布相对较多，15 d小鼠的次级卵泡开始增多且大小相对一致（见图1 P），20 d小鼠可以观察到有腔卵泡分布在卵巢的边缘，而30 d小鼠和45 d小鼠的次级卵泡则大小差异较大，分布也不均匀（图1 Q、图1 H）.可见，从小鼠卵巢由表面往内部腔前卵泡逐渐增大，数量明显减少.颗粒细胞层逐渐增多（图1 R）.哺乳动物卵泡的发育是一个极为复杂的过程.动物的原始卵泡的形成时间因动物品种不同而异，家畜和人类等卵巢在胚胎时期形成原始卵泡库，比如：猪会在妊娠第56天猪胎儿时期形成原始卵泡［3］，啮齿类比如，兔则于新生儿的早期阶段［4］.本实验的研究结果是在观察生后3 d的小鼠卵巢时，还未见卵泡.第5天时周边部已经可见原始卵泡，第7天时原始卵泡数量增多，且常成群分布.原始卵泡的形成和发育直接影响到雌性整个生育阶段的可用卵泡数量.原始卵泡形成后基本停止发育，要到初情期后在促性腺激素的作用下才继续发育.本研究结果发现，10 d小鼠的卵巢初级卵泡明显可见，数量较多且分布均匀.15 d小鼠的卵巢次级卵泡明显可见，20 d的小鼠卵巢、次级卵泡明显变大，有腔样结构产生.据报道，猪原始卵泡发育到有腔阶段需要长达84 d［5］.这提示形成有腔卵泡的时间因物种会有所不同，但最早有报道小鼠部分原始卵泡发育到出生后第16天，开始形成腔体［6］.与本实验结果不一致，原因尚不清楚.哺乳动物卵泡的闭锁发生于整个的发育过程中.早在胎儿时期卵泡形成时即已开始，出生前达到高峰，到出生时丢失绝大部分卵泡.但本研究在第30天才见有卵泡闭锁，原因需进一步探讨.第45天后大部分有腔样结构，这也意味着卵巢已能分泌雌激素.发育不同程度的生长卵泡以不同深度分布在卵巢皮质的最外层，密度较高，没有血管；初级卵泡位于皮质的中层，血管稀少；而次级卵泡则位于血管丰富的皮质最内层，这一点与人的卵泡分布相似［7］，提示从次级卵泡开始需要大量的营养物质，这种现象可能是卵泡分泌了某些因子促使血管在其周围增生.这与其他研究结果相似［8］.研究发现，小鼠各级卵泡及卵母细胞直径与家畜类、人等同期相比要小，提示着可能是小鼠腔前卵泡比家畜、人等腔前卵泡容易培养的原因之一.本研究结果显示在次级卵泡之前，卵泡和卵母细胞直径都相应地增加.次级卵泡发育后期，卵泡及卵母细胞直径急剧增加，卵泡的直径增长远远大于卵母细胞，颗粒细胞层厚度也急剧增加.这提示颗粒细胞的维持对卵泡生长发育是至关重要的.但在整个牛腔前卵泡时期，卵泡和卵母细胞直径增长大体相等［9］，这可能是物种差异造成的.在颗粒细胞层增加的时候，发现颗粒细胞并不是在卵母细胞周围同时、同步生长增殖的，而是先从一侧生长并增殖为多层，将卵母细胞推向尚未增殖的一侧.这与冯贵雪［10］等研究结果一致，但生长模式的机理也不清楚，有待于进一步研究.在猪、双峰驼等原始卵泡和初级卵泡中可看到两个或两个以上的卵母细胞的多卵卵泡现象，但在小鼠中只能看到一个卵泡中一个初级卵母细胞的情况［11］.随着小鼠卵巢的发育，由最初的无皮髓质之分到皮髓明显可见，卵泡从只见聚集呈条索状到发育成原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡，直至有腔的形成.从数量上看，原始卵泡逐渐减少，初次级卵泡逐渐增多，有腔卵泡数量也从无到有从少到多.卵巢由最初的无卵泡发育到有许多大小不等、处于不同发育时期的卵泡、大部分有腔样结构.在此发育过程中会伴有卵泡的闭锁.小鼠卵巢中各级腔前卵泡的分布具有区域性：卵巢皮质的最外层分布有大量的原始卵泡，密度较高，有的成簇可见.初级卵泡出现在原始卵泡层的里面.次级卵泡则多数位于初级卵泡的里面，即最内层，在皮质部与髓质部的交界处分布相对较多.小鼠卵巢由表面往内部卵泡逐渐增大，数量明显减少，颗粒细胞层逐渐增多.【相关文献】［1］ Kerr J B，Duckett R，Myers M，et al.Quantification of healthy follicles in the neonatal and adultmouse ovary：evidence formaintenance of primordial follicle supply ［J］.Rep roduction，2006，132：95-109.［2］ Koji Takagi，Teruo Yamada，Yukari Miki，et al.Histological observation of the development of follicles and folicular atresia in immature rat ovaries［J］.Acta Med Okayama，2007，61（5）：283-298.［3］Bielan˜ska-OsuchowskaZ.Oogenesis in pig ovaries during the prenatal period：ultrastructure and morphometry［J］.Reproductive Biology，2006，6（2）：161-193. ［4］刘素娟.哺乳动物卵泡发生及发育调控［J］.黄牛杂志，1995，21：64-67.［5］成志军，陶勇，章孝荣.胎猪卵巢发生过程中的组织学变化［J］.四川动物，2009，28（5）：746-749.［6］ Sorensen R A，Wassarman P M.Relationship between growth and meiotic maturation of the mouse oocyte［J］.Dev Biol，1976，50：531-536.［7］施旭东.人类卵母细胞的体外发育与存活卵泡的形态学研究［D］.南京：南京农业大学，2001.［8］陈大元，孙青原，李光鹏，等.受精机制与生殖工程［M］//受精生物学.北京：科学出版社，2000：146-155.［9］高立云，高建明，吴学清，等.牛卵巢卵泡及卵母细胞生长发育的组织学研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2002（6）：5-6.［10］冯贵雪，杨素芳，石德顺.水牛腔前卵泡的分布及形态学研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2007（4）：11-13.［11］陈秋生，刘宗平，陈北享.双峰驼卵巢的组织学结构［J］.中国兽医学报，2002，22（4）：381-383.。
Wnt通路调控胚胎早期神经发育的研究进展
Wnt通路调控胚胎早期神经发育的研究进展摘要：Wnt通路是胚胎早期神经发育的关键调控通路之一。
该通路在神经干细胞增殖、分化和迁移等过程中发挥着重要作用。
Wnt通路主要包括Wnt蛋白家族、Frizzled受体 family、β-连环蛋白等重要因子。
Wnt蛋白通过结合Frizzled和LRP受体形成受体复合体,引导β-连环蛋白信号转导进入细胞内,影响下游基因的表达调控细胞功能。
Wnt通路失调与多种神经系统疾病的发生发展密切相关。
本文查阅国内外相关文献发现，Wnt通路失调易导致神经系统发育异常。
Wnt通路调控胎儿期赖氨酸水平也影响神经细胞的增殖分化。
本文为进一步阐明其在神经疾病发生机制中的重要参与提供了理论依据。
关键词：Wnt通路；胚胎；早期神经发育；神经干细胞神经系统的发育始于胚胎时期，并在出生后仍在继续。
胚胎早期神经发育的关键事件包括神经干细胞的增殖、分化和迁移。
神经发育过程中存在多种细胞参与，神经胶质细胞、中间神经元及其他神经元间形成的连接[1]。
如胚胎干细胞中神经运行过程中获得的(神经诱导)可由骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和Wnt信号传导控制[2]。
可见，神经诱导是神经干细胞发育成神经细胞的最初步骤，并且与胚胎身体轴的发育密切相关[3]。
神经发育缺陷可导致严重且常见的结构性出生缺陷，例如颅面异常和先天性心脏病[4]。
而Wnt通路是神经细胞神经传导过程中较为重要的通路之一。
研究显示，Wnt-1和 Wnt-3a 基因编码富含半胱氨酸的分泌信号的 Wnt 家族成员，在发育中的神经管的背侧中线共表达，与背侧模式一致[5]。
Wnt 信号传导介导胚胎发生过程中的主要发育过程，并调节成年哺乳动物干细胞的维持、自我更新和分化[6]。
也有研究显示，Wnt/β-catenin 可调节神经祖细胞的自我更新及促进分化[7]。
同时，神经祖细胞在神经发育过程中能够产生颗粒神经元[8]。
在神经系统中，Wnt通路参与了神经干细胞的增殖、分化和迁移等过程。
oir小鼠模型原理
oir小鼠模型原理
OIR小鼠模型是一种用于研究视网膜疾病和血管异常的实验动物模型。
OIR是“缺氧性视网膜病变”的缩写，它模拟了早产儿视网膜疾病的特征，如增殖血管生成和视网膜缺血再灌注损伤。
OIR小鼠模型的建立在胚胎发育阶段进行。
首先，小鼠妊娠期特定日龄的妊娠小鼠被置于低氧环境中，这导致胎鼠暴露在缺氧的条件下。
接着，小鼠在适当的时间点被转移到正常氧气水平的环境中，模拟了早产儿出生后视网膜缺血再灌注的情况。
这个过程通常持续一到两周。
在OIR小鼠模型中，最主要的特征是新生血管生成。
在低氧环境下，视网膜中的缺氧和细胞损伤促使血管增殖因子（如VEGF）的释放增加。
这些血管增殖因子刺激了视网膜内新生血管的生长，形成异常的血管结构。
然而，这些新生血管并不稳定，容易发生渗漏和出血，最终导致视网膜功能的损害。
OIR小鼠模型还可以通过观察和评估视网膜的形态学和组织学变化来研究视网膜疾病的发病机制。
例如，通过染色和显微镜观察，可以检测到新生血管的形成、视网膜厚度和细胞损伤等重要指标。
此外，还可以使用各种生物学和分子生物学方法来研究与视网膜疾病相关的信号通路和分子机制。
总的来说，OIR小鼠模型是研究视网膜疾病和血管异常的有效工具，通过模拟早产儿视网膜疾病的特征，可以更好地理解相关疾病的发病机制，并为新药的研发提供实验基础。
小鼠卵细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠卵细胞的采集、培养和成熟方法。
2. 观察卵细胞在培养过程中的形态变化和成熟程度。
3. 为后续胚胎发育实验提供成熟的卵细胞。
二、实验原理小鼠卵细胞培养成熟是胚胎发育研究的基础，通过体外培养和成熟，可以观察到卵细胞从生发泡到成熟卵细胞的全过程。
本实验采用小鼠卵巢组织，通过体外培养，使卵细胞在适宜的培养条件下完成成熟过程。
三、实验材料1. 小鼠卵巢组织：雌性小鼠，体重20-25g。
2. 培养基：卵细胞培养液（CO2饱和）。
3. 仪器设备：超净工作台、显微镜、解剖显微镜、培养皿、移液器、剪刀、镊子等。
四、实验步骤1. 采集小鼠卵巢组织：将雌性小鼠麻醉后，剖腹取出卵巢组织。
2. 处理卵巢组织：将卵巢组织置于超净工作台，用剪刀剪成小块，放入培养皿中。
3. 卵细胞采集：用镊子轻轻挑取生发泡，将其置于培养皿中。
4. 卵细胞培养：将采集到的卵细胞放入CO2饱和的培养液中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
5. 观察卵细胞成熟：每隔24小时观察卵细胞形态变化，记录成熟程度。
6. 取成熟卵细胞：当卵细胞达到成熟程度时，用移液器将卵细胞收集到另一培养皿中。
7. 实验结束：将收集到的成熟卵细胞进行后续实验或保存。
五、实验结果1. 卵细胞采集：成功采集到生发泡，其中含有一定数量的初级卵母细胞。
2. 卵细胞培养：在培养过程中，观察到卵细胞逐渐从生发泡状态发育为成熟卵细胞。
3. 卵细胞成熟：经过48小时的培养，大部分卵细胞达到成熟程度，出现第一极体。
六、实验分析1. 本实验成功采集到小鼠卵巢组织中的初级卵母细胞，为后续实验提供了充足的卵细胞资源。
2. 在卵细胞培养过程中，观察到卵细胞逐渐成熟，说明本实验所采用的方法对卵细胞成熟具有促进作用。
3. 实验结果表明，小鼠卵细胞在体外培养条件下可以成熟，为胚胎发育研究提供了技术支持。
七、实验总结1. 本实验成功实现了小鼠卵细胞的采集、培养和成熟，为后续胚胎发育实验奠定了基础。
小鼠胚胎肺分支形态发生的分子机制
ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2008年11月24(11):1001～1007・综述・小鼠胚胎肺分支形态发生的分子机制王 昕, 林钧浩, 黄义德, 张彦定3(发育与神经生物学福建省高校重点实验室,福建师范大学生命科学学院,福州 350108)摘要 哺乳动物在早期胚胎发育过程中,肺发育经历了气管分支的形态发生、树样结构上皮管道的形成,并伴随着血管的发育而发生的气体通路和肺泡的分化等过程.肺发生涉及到许多复杂的分子机制.肺形态学的变化受到一系列持家基因、激素、核转录因子、生长因子及其他因素的综合调控.目前已经发现决定肺分支形态发生的许多重要因子.本文根据目前最新研究进展,阐述了小鼠胚胎肺在分支形态发生过程中,上皮与间充质之间诱导的信号通路之间的相互作用及其对呼吸树形态建成的调控机制.关键词 胚胎肺;上皮;间充质;信号通路;相互作用中图分类号 Q344+114Molecular Mechanism of Embryonic Lung BranchingMorphogenesis in the MouseW ANG X in ,LI N Jun 2Hao ,H UANG Y i 2De ,ZH ANG Y an 2Ding3(Higher Education K ey Laboratory o f Fujian Province for Developmental Biology and Neuroscience ,College o f Life Sciences ,Fujian Normal Univer sity ,Fuzhou 350108,China )Abstract In the early stages of mammalian embry o ,lungs underg o a series of developmental events ,including the extensive branching m orphogenesis ,the formation of tree 2like structures of epithelium tubes ,the differentiation of airways and alveolization ,and the coupled angiogenesis and vasculogenesis.The respiratory organogenesis inv olves many com plex m olecular mechanism.At different developmental stages ,from embry onic to newborn ,the lung architecture underg oes profound changes made by a series of regulated events by master genes ,nuclear transcription factors ,horm ones ,growth factors and other m olecules.The im portant factors which determine the branching m orphogenesis were found.In this view ,we summarize the latest research regarding the interactions of s ome im portant signaling pathways induced by mesenchyme and epithelium ,suchas FG F10ΠFG FR2,Shh ,BMPs ,and Wnt Πβ2catenin.K ey w ords embry onic lung ;epithelium ,;mesenchyme ;signaling pathway ;reciprocal interaction收稿日期:2008204207;接受日期:2008206227国家自然科学基金项目(N o.30771132)3联系人 T el :0591222868218;E 2mail :Y dzhang @Received :April 7,2008;Accepted :June 27,2008Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30670423)3C orresponding author T el :0591222868218;E 2mail :Y dzhang @ 小鼠肺器官的发育起源于前肠腹侧的内胚层.根据气道(airway )形成的组织形态学特征,可把小鼠肺的发育分为4个阶段:(1)假腺肺阶段(pseudoglandular stage ,E9152E1616,即小鼠怀孕的第91521616d ),呼吸树开始发育,上皮组织生长并分支,形成几乎全部的相互通连的气管和各级支气管,并在细支气管末端再分支形成短管束;(2)微管肺阶段(canalicular stage ,E16162E1714),分支的短管束伸长,并进一步向外周分支,扩展形成终末导管,肺泡开始发育,血管开始形成并整合入肺泡上皮细胞之间;(3)囊状肺阶段(saccular stage ,E17152P5),终末导管扩大并分隔为由含双层毛细血管网的中央结缔组织及两侧上皮细胞构成的原始肺泡;(4)泡状肺阶段(alveolar stage ,P5230),原始肺泡进一步分隔、重建,肺泡数量和表面积大大增加,肺的体积扩张[1].早期的研究已阐述了上皮与间充质相互作用在调控肺分支形成过程中所发挥的作用[2].肺上皮能对来自间充质的信号做出应答,而间充质包含了决定肺上皮如何生长和分化的因子及分支信息.在发育过程中,基因表达受到转录因子和生长因子的时空调控,在胚胎器官形成过程中起重要作用的调控因子已被人们发现并广泛研究.成纤维生长因子(fibroblast growth factors,Fg fs)是上皮2间充质相互作用的重要调控因子.Fg fs信号对早期胚胎肢芽、肝脏和胰腺、颅骨、中枢神经系统、牙齿等的形态发生都起着重要的调控作用[3,4].骨形态发生蛋白(bone m orphogenetic protein,Bm p)信号通路与骨骼、牙齿、肺2支气管和神经系统等的发育密切相关[5,6].WntΠβ2 catenin信号通路则是胚胎发育很重要的信号通路,在牙齿、肝脏、机体新陈代谢等各方面都发挥重要作用[7,8].肺的发育也不例外,在过去十几年里,关于肺形态发生和细胞分化决定子的研究已取得了相当大的进展.内胚层的发育不仅受到本区域表达的转录因子的影响,同时也受到从邻近细胞扩散而来的生长因子的影响.一方面,可扩散的信号分子通过诱导负调控子(negative regulator),建立反馈环来调节自己的活性,控制形态发生,因此,在不同的时空中可能产生不同的效应;另一方面,多信号通路的时空特异性组合,指导了细胞迁移、增殖和分化的过程,从而导致了肺芽分支的形态发生.在肺早期发育的各个阶段,各信号通路如何共同参与调控肺的发育已成为研究的重点之一,揭示肺发育的分子机制是肺部疾病基因治疗的基础.1 小鼠胚胎肺发育过程的调控因子111 成纤维生长因子及其受体Fg fs是个复杂的生长因子家族,随着研究的深入,有越来越多的Fg f家族成员不断被发现,目前发现已超过20个成员,通过4个同类的酪氨酸激酶Fg f受体(Fg frs)传递信号.Fg fs家族的成员Fg f1,7,9,10和18等都在肺间充质中表达,并且表达区域相互重叠,而其受体则位于上皮细胞中.复杂的配体2受体间的相互作用激活了发育系统中一系列调控细胞增殖、分化和形态建成的细胞内信号通路.Fg f2Fg fr信号对于最初气管分支的形成和发育过程中终末端肺芽分化为支气管以及胚胎肺血管形成起着核心作用,Fg fs指导上皮的形态发生很可能与其指导上皮细胞增殖和分化的能力有关.Fg fs的不同成员在肺发育中的作用截然不同:Fg f10与分支形成过程中上皮—间充质相互作用的诱导有关,是Fg fs家族中唯一一个与早期肺分支发生紧密相连的分子[9];Fg f9和18则在间充质发育中起作用[10];Fg f1会刺激上皮的增殖导致肺芽分支的形成[11];Fg f7也会促进上皮的增殖而形成囊泡样结构,并会刺激上皮细胞的分化,使其表达S p2a、S p2b[11].而Fg f信号通路最重要的受体Fg fr2在肺发育早期阶段的呼吸管上皮中强烈表达[12].其中,Fg f102Fg fr2信号通路对初级肺芽的形成起着重要的调控作用.Fg f10与肺芽的形成有关,是触发初级肺芽形成、次级分支及随后肺芽不断分支的信号分子.Fg f10表达的精确的时空调控和对上皮增殖的控制是肺芽在特异位点形成(初级肺芽形成)以及在随后气管分支过程中控制肺芽延长所必需的.Fg fr2b是Fg f10的主要受体,Fgf10或Fgfr2b突变体小鼠完全缺失肺部,这是Fg f10是肺发育过程重要调控子的有力证据[13].但是,诱导肺芽形成并不是Fg f10特有的.Fg f1也具有诱导肺芽形成的趋化作用,体外培养时Fg f1也能引起成芽反应[14],但其作用会弱于Fg f10[15]. Fg f1能够有效地与所有的Fg frs结合,它很可能激活Fg fr2b,而Fg fr2b能传递Fg f10的信号.但是,这个影响似乎与体内肺早期成芽无关,因为在早期肺部并未发现Fg f1的mRNA,并且它的表达类型与Fg f10完全不同[15].所以,肺发育过程中Fg f1的作用仍不是很清楚.此外,Fg f7的序列与Fg f10具高度相似性并使用同一个受体,但Fgf7是通过促进上皮的生长而不是通过对上皮的趋化性来影响肺成型的,它通过扩大细胞增殖诱导囊样结构的形成,并能诱导产生Π型肺泡细胞样细胞[10,14],但Fg f7敲除小鼠肺表面看起来并无明显异常,猜测它与其它调控因子一起调控肺的发育[11].112 转化生长因子2β及其受体转化生长因子2β(trans forming growth factor2β,T g f2β)家族是T g f2β超家族的3个亚族(activin,T g f及Bm p)之一.哺乳动物有3种T g f2β的亚型:T g f2β1、2、3.它们和T g f2βΙ型和Π型受体均在胎肺中表达,但有不同的分布[16,17]:T g f2β1在间充质,尤其是远端上皮末梢分支点处的间充质中表达,T g f2β2在肺远端上皮表达[18],而T g f2β3则在近端上皮与间充质中表达.体外培养时T g f2β1和2都能抑制肺芽分支的形态发生、生长和分化,但T g f2β2比T g f2β1所起的作用更大[19].T g f2β3则在肺受伤修复反应中调控肺泡上皮细胞的增殖.Tgf2β3基因敲除突变体也会造成新生小鼠肺部不成熟,使得新生小鼠很快死亡[20]113 骨形态发生蛋白及其受体2001中国生物化学与分子生物学报24卷Bm ps是T g f2β超家族的另1个亚族,在胚胎肺形态发生中起着重要的作用.在胚胎肺发育过程中有许多Bm ps及Bm prs表达,比如Bm p3、4、5、7和Ⅰ型、Ⅱ型Bm pr[20,21].在肺发育中,研究最多的便是Bm p4,E11212,Bm p4的mRNA大量定位于肺芽的远端上皮,在肺近端的间充质中则呈低水平表达[21].另外,Bm p4的胞内下游组分Alk3、Smad1同时在胚胎肺部的上皮和间充质中存在[22,23].Bm p4是肺远端形态发生的重要因子,能促进肺远端上皮的分化,抑制Bm p4会导致肺远端上皮分化的抑制,近端分化的促进[24].114 Wnt信号小鼠胚胎肺中存在许多Wnt配体、受体及Wnt 经典通路的许多下游组分.WntΠβ2catenin信号参与调控肺P2D轴(proximal2distal axis,近2远端轴线)的细胞分化[25].剔除β2catenin基因或过表达Wnt信号通路的抑制子Dkk1都会阻断Wnt经典通路,从而阻止末端肺芽的形成,并显著地妨碍分支的形态发生.尽管β2catenin具有双重作用,它既是Wnt经典通路(canonical)的组分,同时也能调节细胞的附着而影响细胞的增殖,但该实验已表明,β2catenin与肺上皮细胞的增殖无关[25].所以,作为使Wnt信号失活的2种模型,即剔除β2catenin基因或过表达Wnt信号通路的抑制子Dkk1,目前已被广泛应用于研究Wnt信号的作用. 115 刺猬蛋白家族成员Shh刺猬蛋白家族成员之一S onic hedgehog(Shh)是果蝇hedgehog基因在小鼠中的同源物,它在小鼠肺上皮中沿P2D轴呈梯度表达,在肺芽远端上皮末梢中表达最强烈[26].Patched(Ptc)基因则在远端肺芽周围的间充质中高度表达,它编码了一个Shh信号通路所需的多次跨膜受体.在与Shh结合后,Ptc受体就释放另一种称为Sm oothened(Sm o)的基因产物,一旦它被释放,G li就被激活从而作为转录激活子而起作用.Shh对于肺芽分支是必需的,它诱导了间充质细胞的增殖并调节了一系列间充质基因的表达[26]. Shh的异位表达将导致上皮和间充质的大量增殖,并产生包含大量间充质而无功能性肺泡的致死性的肺.并且伴随Ptc基因表达的上调[27].因此,Shh对胚胎早期肺远端间充质细胞的增殖起着重要作用,并且能同时诱导邻近间充质中Ptc基因的表达. 116 视黄酸视黄酸(retinoic acid,RA)是维生素A的衍生物,它以不同的异构体形式存在.RA的效应通过2个核受体家族Rars和Rxrs介导,这些受体各由3个亚型(α,β,γ)组成,它们之间通过形成有功能的异二聚体来传递RA信号[28].RA在许多器官的发育和维持机体动态平衡中都发挥着重要作用,是肺芽形成起始必需的信号,在肺原基中具有高度活性.肺部Fgf10的表达和肺芽的形成依赖于RA,RA能促进Fgf10的表达并能通过抑制Fgf10的下游因子而对Fgf10的表达进行调节[29].2 小鼠胚胎肺分支形态发生的分子机制211 肺芽形成的分子调控机制前肠内胚层细胞中Fg f10信号的激活对肺原基的形成是必需的.肺分支起始于远端间充质预定气管形成区中Fgf10的表达,随后Fg f10扩散并与位于上皮的受体Fg fr2b结合,从而激活该信号通路,并诱导肺芽的形成[9].同时,位于Fgf10下游的一种编码木瓜蛋白酶家族成员之一的溶酶体半胱氨酸蛋白酶基因———组织蛋白酶H(Ctsh)也被Fg f10诱导表达[30],但在肺芽刚形成时(E8152915),小鼠前肠中RA的合成很显著.RA会抑制由Fg f10诱导的Ctsh 在上皮的表达,也就是说,在肺发育早期,RA能够通过调节Ctsh的表达而参与调控由Fgf10诱导的肺芽形成[28,31].现将肺芽形成过程中各基因之间的相互关系总结如Fig11.Fig.1 The regulation role of Fgf10signaling p athw ay on lung bud morphogenesis Branching initiates with local Fgf10expression in the distal mesenchyme.Actually,Fg f10 diffuses and binds locally to Fg fr2b,which expresses throughout the lung epithelium.I t activates signal pathway and induces a bud.The expression of Ctsh,which can be induced by Fg f102 Fg fr2b and be inhibited by RA,can regulate the initiation of lung bud212 肺芽延长及分支形成中的分子调控机制初级肺芽必须经历一系列的分支才能最终形成呼吸树.小鼠胎肺的这个发育阶段大约开始于3001第11期王 昕等:小鼠胚胎肺分支形态发生的分子机制 E1015,随着次级肺芽的形成,分支过程一直持续至大约E17,此时肺芽远端形成肺泡囊.各种信号分子、转录因子介导了上皮—间充质的相互作用,这些因子间的相互作用共同调控了肺芽分支的形成和分化.首先,位于间充质中的Fg f 信号是启动肺芽分支的一个重要枢纽.E915时,在前肠前部刚形成的2个小肺芽周围的间充质中就检测到Fgf 10的表达.到了E1015,Fgf 10则在小鼠肺远端上皮管周围的间充质中分散分布,将来这些位点将形成肺芽.随后,在次级肺芽最末端的间充质中也发现Fgf 的强烈表达.体外培养时,这些位点处的Fg f10信号对肺上皮具有趋化性,能诱导上皮发生迁移和增殖,从而影响肺芽形成[15].随着分支的进行,新形成的肺芽处上皮和间充质细胞间信号的交换形成了许多反馈环,从而进一步控制气管的大小、分支的类型和细胞的命运.Fgf 10的表达受到精确的时空调控,从而调控着肺的正确分支.已有研究表明一些调控Fgf 10表达的因子位于肺上皮中.比如有实验表明间充质中Fgf 10的表达受到来自上皮的Shh 的负调控.Shh 突变体Fgf 10的表达大大上调且出现表达错位,Fgf 10的表达不再受限于某个区域,而是在肺远端间充质中广泛分布,并且表现出严重的分支异常,上皮发展为大的胞囊结构而不是形成典型的肺芽[32].这正是因为Shh 的缺失解除了其对Fgf 10的抑制作用,结果Fgf 10的表达变得没有规律.Shh 正是通过控制肺芽的大小,并且通过阻止Fg f10在间充质的广泛表达来控制肺芽的分布及形状.但近年的研究表明,高水平的Hhip1也会抑制Shh 信号,从而抑制Shh 对Fg f10的抑制作用.Hhip 1突变体小鼠的肺由于Shh 的活性增强,Fgf 10的表达几乎被抑制而抑制了分支的发生[33].此外,Shh 的高水平表达并不意味着Shh 的活性一定很高,Shh 表达的上升也会诱导Hhip1和Ptch1表达的提高,一旦Ptch1的量超过了正常Shh 信号通路所需的量,Ptch1和Hhip1就会屏蔽掉大部分Shh 蛋白,反而使Shh 信号下调.Fg f 信号通路和肺分支也被一类称为S prouty (S pry )的富含半胱氨酸的蛋白家族所调控.它是肺上皮中最早被Fg f10诱导表达的靶基因之一[34].Spry 通过与Frs2,G rb2和Raf 绑定,同时与G ap1及Shp2分离来抑制Fg f102Fg fr2的信号[35].当肺芽形成时,它会限制肺上皮的增殖或迁移.随着分支芽向间充质中F f g 10的表达源方向延伸,Spry 2在分支远端上皮中的表达强度不断增强.当气管延伸到靠近肋部的终点时,Spry 2的表达达到最高水平,抑制了分支管道的继续延伸.此时,Fgf 10的表达移位到分支末端的两侧.这时就在分支的末端出现分叉,子代的气管分支又重新开始.如此不断重复的分支过程,最终导致具有三维立体结构的呼吸树的形成.此外,分别在间充质和上皮中表达的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor ,Hg f )和它的受体c 2met ΠHg f 在肺分支过程中也能够与Fgfs 相互作用.在体外培养的肺上皮中Hg f 能够加强Fg fs 对肺芽形成的刺激效应[36].近年的研究表明:Dicer 酶能通过产生siRNA 来调节基因的表达.在小鼠基因组中仅有一个Dicer 基因,在发育的组织中广泛表达.通过对剔除Dicer 基因的小鼠的研究表明,Dicer 突变体小鼠肺远端上皮出现一些与野生型相比较大的肺泡囊,但没有发育良好的肺芽分支[37].尽管Dicer 基因具有维持细胞存活的作用,但上述表型在上皮细胞死亡增多之前就已出现,所以有理由推测,Dicer 在调控肺上皮形态发生中起着特定的作用,而与其维持细胞存活的作用无关.同时发现,Dicer 突变体小鼠肺中Fgf 10的表达上调了,并在间充质中有所扩散[37].结合先前的研究即间充质中Fg f10的离散分布位点为上皮分支提供了化学趋向性,因此在Dicer 基因条件性剔除小鼠中Fgf 10表达的异常就有可能造成肺发育的异常.另一方面,Bm p4和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,Veg f )信号通路在呼吸树的形态建成过程中也是必不可少的,它们起到补充和促进发育进程的作用.Fgf 10能通过诱导Sp 2c 的表达和上调Bmp 4的表达来控制上皮的分化.肺体外培养时,在移植的Fg f10珠子旁边,Bmp 4被诱导表达[38].而当Bmp 4高水平表达时,Fgf 10也不能诱导肺芽进一步分支,只产生膨胀的单一肺芽而非树形的多分支肺芽[24].也就是说,Fgf 10和Bmp 4可能相互拮抗.但最近的研究表明,在肺芽分支形态发生过程中,在间充质存在的情况下,对于体外培养的肺,Bm p4也是分支的有效刺激因子.其实Bm p4信号可以通过自分泌和旁分泌被激活.当其在肺上皮中以自分泌的方式被激活时,细胞增殖被抑制[39],存在于终末肺上皮中的Bm p4有可能通过旁分泌方式激活邻近间充质中的Bm p4信号,从而增强了远端肺芽的增殖[24].在体内肺的发育中,肺远端高水平的Bmp 4表达并不影响Fgf 10诱导的肺芽生长,这可能是因为Bmp 4的诱导表达是个渐进的过程,并且仅4001中国生物化学与分子生物学报24卷在一定的浓度下才会抑制Fgf 10的表达.在预定肺芽处Fgf 10的表达先于Bmp 4的诱导表达,因此肺芽开始生长直至Bm p4达到一定的浓度.另一种可能是Bm p4信号能诱导特定抑制子来抑制Bm p4的活性.在肺发育中,肺上皮Bmp 4的调控很复杂并且依赖于如Wnt 、Fgf 10和Pod 1(Tcf 21)等信号.同时,Bm p 信号通路也受到诸如N oggin 和Chordin 等拮抗物的调控[40].Bmp 的表达区域与其它参与形态发生有关的信号分子的表达区域有所重叠,包括Hnf 23β、Wnt 22、Shh 和Fgf 10.由于Bm ps 和Shh 在相同的区域共表达,并且Bmp 在果蝇中的同源物受到Hedgehog 信号通路的调控,Bm ps 与Shh 的相互作用很可能在小鼠胚胎肺形态发生中起着重要作用.在Bmp 4和Shh 高水平表达的情况下,Fgf 10仍能维持其表达.尽管Bmp 4和Shh 都能调控Fgf 10的表达,它们二者却无相关性.Shh 突变体小鼠肺间充质中Bmp 4的表达下调,而上皮中Bmp 4的表达仍维持在一定的水平甚至更高[25].再过表达Bmp 4也不会改变Shh 的表达[21].这表明它们调控Fgf 10的作用是相互独立的,可能它们分别在不同的时期调节Fgf 10信号,Shh 信号与限制Fgf 10的表达有关,而Bm p4则与调控Fg f10的活性有关.此外,在分支形态发生过程中,RA 信号关闭,Ctsh 被Fg f10诱导表达,并且Ctsh 的表达与Bmp 4的表达在时空上相互重叠.已有实验表明,抑制Ctsh 的活性将导致Bm p4的显著堆积及分支形态发生异常[32],说明Ctsh 控制了成熟Bm p4蛋白的有效活性,Ctsh 能快速地从肺芽部位将Bm p4蛋白移走从而限制Bm p4的活性[30].随着肺芽的伸长,Fg fr2b 信号先诱导了Spry 2的表达及终末端肺上皮的Bm p4的表达(Fig.2).在随后的分支过程中,上皮中的Wnt 经典通路激活了Fgfr 2b 的表达,而间充质的Wnt (单独作用或与上皮中的Wnt 一起)则抑制了Fgf 10的表达.这就保证了肺芽仅出现在特定的位置.同时,在肺芽柄部的间充质中,Tgf β1的表达则抑制了Fgf 10在该区域的表达(Fig.3).T g f β1是肺上皮增殖和分化的负调控子,很可能与Fg fs 促进肺芽形成的效应相抵消而起到平衡肺芽生长的作用.同时,T g f β1还会诱导细胞外基质的合成,当它们沉积在上皮—间充质的分界面时,被认为会阻止该区域分支的发生[41].而肺远端间充质中的Shh 信号一方面抑制Fgf 10的表达,一方面激活Patched 受体,从而通过G li3、F ox f1积极调控其表达.另外,Shh 诱导的Hhip 的表达会反过来抑制Shh 信号而促进Fgf 10的表达.在肺芽远端,高水平的Shh 和Hhip 就导致了该区域较邻近的间充质有更少的Shh 信号,更多的Fgf 10的表达.而远离肺芽远端末梢处低水平的Shh 信号同样能诱导邻近间充质中更多Fgf 10的表达,这就将导致肺芽随后新的侧边分支的产生.在随后的肺发育过程中,间充质细胞的增殖依赖于上皮中的Shh 、Wnt7信号及胸膜中的Fg f9信号,而终末上皮细胞的增殖则依赖于n 2Myc 和Fg f10(Fig.3).Fig.2 The interactional regulation role of Fgf10signaling p athw ay on lung bud elongation As the bud elongates ,Fg fr2b signaling induces expression of regulators of Spry 2and Bmp 4in the distal epithelium.Bm p4possibly inhibits distal budding through autocrine signaling from the epithelium.On the other hand ,via an unidentified mesenchymal signal (?),it can als o enhance budding in a paracrine fashion.P od1(T cf21)in the mesenchymal regulates Bm p4 随着胚胎肺的进一步发育,肺泡开始分化形成.人们对肺泡分化调控机制的理解远不如对上皮分支机制的那么深入.已知Fg f 、血小板源性生长因子A(platelet 2dirived growth factor 2A ,Pdg fa )、Veg f 以及T g f β1构成的信号网络,与其分化是密切相关的[42].有关调控肺发育过程中近2远端轴的图式(pattern )和5001第11期王 昕等:小鼠胚胎肺分支形态发生的分子机制Fig.3 The regulation role of fgf102fgfr2b signalingp athw ay on lung branching morphogenesis Canonical Wnt signaling pathway activates Fgfr2b andBmp4expression in the lung epithelium whilemesenchymal Wnt signaling(alone or with epithelialWnt)inhibits Fgf101F ox f1,Tbx4and Tbx5caninduce expression of Fgf101Bm p4in the mesenchymeinhibits Fgf10,but the expression of itself is controlledby Ctsh.T g fβ1signaling in stalk mesenchyme may als oprevent Fgf10expression in the proximal mesenchyme.On one hand,Shh signaling in the distal mesenchymeinhibits Fg f10expression,on the other hand,via G li3als o controls expression of F ox f1,a positive regulator ofFgf101Als o,Shh induction of Hhip expression inhibitsShh signaling itself to allow Fgf10expression分化的分子机制的研究更为鲜见.现有的实验结果认为,Bm p4和经典Wnt信号作为形态发生子(m orphogen),以浓度梯度的方式调控P2D轴的细胞命运.在上皮中过表达Bm p的拮抗物(N oggin和G ermlin),抑制Bm p4,能促使周边的组织近端化,发育形成纤毛细胞和细支气管细胞[43].敲除β2catenin 或过表达Wnt经典通路的抑制物Dkk1也得到了类似的表型[25,44].新近的研究发现,非经典通路的Wnt 信号分子Wnt5a在经典Wnt信号作用之后(肺发育的中期,肺泡形成时),对远端的发育起着重要的决定作用.剔除Wnt5a,导致小鼠胚胎肺上皮的过度分支;过表达则分支不足,远端气道明显膨大[45～47].参考文献(R eferences)[1] T en Have2Opbroek2A A.Lung development in the m ouse embry o[J].Exp Lung Res,1991,17(2):1112130[2] M asters J R W.E pithelial2mesenchymal interactions during lungdevelopment:the effect of mesenchymal mass[J].Dev Biol,1976,51(1):982108[3] K ettunen P,Laurikkala J,It ranta P,et al.Ass 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去透明带方法的选择对小鼠早期胚胎体外培养的影响
ZP ） 是一层包绕在所有哺乳动 透明带（ zona pelluccida ， 物卵母细胞外围的非细胞的糖蛋白结构， 对卵子的发育、 受 精以及着床前胚胎发育起着关键性作用 。IVF（ in vitro fertilization， 体外受精） 、 体外人工核移植以及其他需要对早期胚 胎显微操作的研究都需要在着床前胚胎即透明带尚未消失 前进行， 所以透明带的存在成为上述研究的一种障碍， 因此 确定一种简单易行、 快速去除透明带且对胚胎损伤最小的方 法可以为上述研究打下良好的基础 。 现阶段去除透明带的方法主要为： 酸性台式液去透明带 0． 5% 链酶蛋白酶去透明带法 。 本研究观察了应用两种 法、 方法去透明带以后受精卵体外分裂的情况， 以单细胞受精卵 分裂为 2 － 细胞受精卵的卵裂率为观测指标， 探讨酸性台式 液去透明带法及 0． 5% 链酶蛋白酶去透明带法中哪种更适合 作为去除透明带的首选方法以及对小鼠早期胚胎体外培养 有何影响。 1 1． 1 材料与方法
第 20 卷第 2 期 2012 年 2 月
中国医学工程 China Medicaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Engineering
Vol． 20 No． 2 Feb， 2012
·临床研究·
去透明带方法的选择对小鼠早期胚胎 体外培养的影响
高 源， 秦书俭， 郑德宇， 刘建生， 马 刚
（ 辽宁医学院 人体解剖与组织胚胎教研室 ， 辽宁 锦州 121001 ）
0． 5% 链酶蛋白酶去透明 组： 分别为酸性台式液去透明带组 、 带组、 未去透明带组。 1． 2． 3． 1 台式液去透明带组 （ 在酸性台式液中添加 0． 5% PVP 的 以降低因去除透明带后受精卵产生的黏性） 将收集 用吸头的尖部上下 的单细胞受精卵部分移至酸性台式液中， 同时观察透明带的溶解情况 。 当透明带 反复轻柔吹打细胞， 立即将其转移到新的 FHM 液滴中反复洗涤以终止 溶解后， 酸性台式液的作用。 1． 2． 3． 2 链霉蛋白酶去透明带组 （ 在 0． 5% 链霉蛋白酶中 添加 0． 5% 的 PVP 以降低因去除透明带后受精卵产生的黏
大一组织学与胚胎学实验报告
大一组织学与胚胎学实验报告大一组织学与胚胎学实验报告一、实验目的本实验旨在通过对一般动物的胚胎发育过程的观察，以小鼠、家兔为例，系统进行组织学与胚胎学实验，了解小鼠胚胎发育的特点，为动物学以及实验动物繁育等提供参考。
二、实验材料1.小鼠胚胎、家兔胚胎；2.各类染色剂；3.小鼠和家兔胚胎的发育模型；4.实验室设备，如显微镜、烧杯、自动切片机、烧瓶、pH计等。
三、实验步骤1. 将小鼠胚胎切割成三个侧面的片段，采用低温脱水剥离技术，将三个侧面分别涂上不同的染色剂，冷藏24小时，以保证染色物质的稳定性；2. 根据小鼠胚胎的发育模型，按照胚胎的发育阶段进行观察，记录每一阶段的胚胎外观特征，对各个发育阶段器官的发育规律、发育轨迹及发育情况进行评估；3. 根据实验所得的化学物质分析结果，运用测定的化学指标，如碳水化合物、蛋白质、脂肪等，进行对比分析，从而推测小鼠胚胎的发育进程；4. 将家兔胚胎进行观察，根据胚胎的发育模型，按照胚胎的发育阶段进行观察，记录每一阶段的胚胎外观特征，对各个发育阶段器官的发育规律、发育轨迹及发育情况进行评估。
四、实验结果1. 小鼠胚胎的发育阶段主要包括：卵黄囊期、胚胎期、子宫孵化期、胎兔期、新生期等；2. 从相关化学指标测定结果可以看出，不同阶段小鼠胚胎碳水化合物、蛋白质、脂肪含量均有明显的变化；3. 家兔胚胎的发育阶段主要包括：胚胎期、子宫孵化期、胎兔期、新生期等；4. 各发育阶段的家兔胚胎形态差异明显，可以依据模型进行对比分析，明确各发育阶段及其细胞结构特征。
五、实验总结本次实验通过对小鼠和家兔胚胎发育的观察，系统进行组织学与胚胎学实验，熟悉了小鼠和家兔的胚胎发育特点，特别是认识到家兔胚胎阶段及变化的特性，为动物学研究以及实验动物繁育等提供了很好的参考。
采集小鼠受精卵
采集小鼠受精卵小鼠受精卵（早期胚胎）采集在基因工程小鼠的制备和保种中都是非常重要的步骤。
只有采集到足够数量和质量的受精卵，才能更有效地进行显微注射、胚胎移植或冻存复苏，保证获得高质量的子代小鼠。
那么受精卵到底是怎么采集的呢？今天我们就来介绍一下1细胞期与2细胞期胚胎的收集方法。
哺乳动物的受精过程发生在输卵管内，小鼠胚胎进入子宫着床时间大约为4天左右。
因此，需要在配种后或受精后的适当时间从超排供体收集不同时期的胚胎。
小鼠受精后4.5天内早期胚胎发育的过程：[图片来自：Genetics & Development]人、小鼠、大鼠胚胎发育阶段对应时间点：[图片来自：https://.au]受精卵获得的方法分自然排卵、激素诱发排卵和体外受精三种方法。
我们今天介绍的是诱发排卵（超排）后采集受精卵的方法。
雌鼠超排与合笼超排不同背景的小鼠超排周龄都是不同的，剂量也是不同的。
那以常用的C57小鼠为例，超排周龄为3-4周龄。
当达到超排周龄后，向雌小鼠腹腔内注射5个国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，然后约46-48h后再注射5 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12h后即可诱发排卵。
图1. 雌鼠超排与受精卵早期发育时间轴[图片来自：Ivan Bedzhov, et al. In vitro culture of mouse blastocysts beyond the implantation stages. Nature Protocols volume 9, pages 2732–2739 (2014)]合笼1）雌小鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼。
雄鼠交配一般是在夜晚发生，交配过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。
2）交配后过夜易见小鼠的阴道栓。
1-cell期胚胎采集输卵管切开1）通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。
2）将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。
2024年山东省烟台市中考生物真题卷及答案解析
2024年烟台市初中学业水平考试生物试题注意事项：1．本试卷共8页，共100分；考试时间60分钟。
考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回。
2．答题前，务必用0.5毫米黑色签字笔将自己的姓名、准考证号、座位号填写在试卷和答题卡规定的位置上。
3．选择题选出答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑；如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其它答案标号。
4．非选择题必须用0.5毫米黑色签字笔作答，答案必须写在答题卡指定区域内的相应位置；如需改动，先划掉原来的答案，然后再写上新的答案；不能使用涂改液、胶带纸、修正带。
5．写在试卷上和答题卡指定区域外的答案无效。
一、选择题（本大题包括25个小题，每小题2分，共计50分。
在每小题给出的四个选项中，只有一个选项符合题目要求）1. “不知细叶谁裁出，二月春风似剪刀。
”诗中体现的生物特征是（）A. 能生长B. 需要营养C. 能排出体内废物D. 能繁殖2. 菠菜焯水时，水会变成绿色，绿色成分来自细胞的（）A. 液泡B. 叶绿体C. 线粒体D. 细胞核3. 下列谚语能体现生物影响环境的是（）A. 大雪纷纷落，明年吃馍馍B. 山上多种树，胜似修水库C. 肥是庄稼宝，施足又施巧D. 白露天气晴，谷子如白银4. 小强在月季园里发现一株月季上开出多种颜色的花，培育这株月季的技术是（）A. 扦插B. 压条C. 嫁接D. 组织培养5. 动物的外骨骼能防止体内水分的大量蒸发。
以下动物具有外骨骼的是（）A. B.C. D.6. “花褪残红青杏小”，又到了杏子成熟的季节。
杏与银杏的主要区别是（ ）A. 有根、茎、叶分化B. 有输导组织C. 能产生种子D. 能形成果实7. 大熊猫的性别决定方式与人相同，其体细胞内有42条染色体，精子的染色体组成是（ ）A. 20+X 或20+YB. 41+XC. 41+YD. 20+XY 8. 小艾用显微镜观察水绵，发现水绵（ ）A. 由单个细胞构成B. 有带状叶绿体C. 没有细胞核D. 叶片呈长条状9. 香椿是一种乔木，香椿芽有“树上佳蔬”的美誉。
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小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计
所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学
学生姓名
学生学号
指导教师
XXXX年XX月XX日
小鼠早期胚胎发育的研究
一、引言
胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。
而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。
动物胚胎的发育过程
虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。
此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。
受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。
它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，
卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。
在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是
对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。
在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。
不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。
如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。
原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。
原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。
例如由内胚层发展而来，具有具有多潜能性的的间叶细胞，可以分化成纤维母细胞、软骨母细胞、硬骨母细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、横纹肌母细胞、造血母细胞等等。
器官形成:外胚层、中胚层与内胚层形成各种组织和器官的过程，称为器官形成，也称做器官发生。
以青蛙的胚胎为例，在器官形成的早期，外胚层会在突起之后向内凹陷，形成神经脊与神经管;中胚层则会形成中胚叶节(somite)与脊椎，中胚叶节包围的空间称为体腔。
小鼠应用于生命科学研究中已有上百年的历史，成为研究人类遗传疾病的最佳动物模型。
它是最小的哺乳动物之一，体形小，易于饲养管理;繁殖和发育速度都特别快;性情温顺，胆小怕惊;对外来刺激极为敏感;便于提供同胎和不同品系动物;成雌鼠在动情周期不同级段，阴道粘膜可发生典型变化，根据阴道涂片的细胞学改变，可以推断卵巢功能的周期性变化，且市场价格较低，。
虽然小鼠和人类在体型大小和形态上相差很大，但在生物进化上非常接近。
所以以小鼠作为研究人类遗传疾病的材料最为合适。
体外培养哺乳动物卵细胞技术是实验胚胎学和发育遗传学研究的重要手段。
实验哺乳动物如小鼠.仓鼠、大鼠和兔等卵细胞的体外培养已有许多报道，尤其是小鼠卵细胞的培养工作更多,可以说已是常规化了。
但是我国这方面的研究还较少,就连体外培养的早期受精卵,也往往不能发育。
本试验以小鼠为例，进行小鼠早期胚胎发育实验，为胚胎学或发育遗传学等方面的研究提供实验手段和依据。
二、实验方案
(一)实验目的
1、学习小鼠早期胚胎发育过程;
2、通过本次试验对包括小鼠在内的哺乳动物早期胚胎发育有一定的了解，
3、为胚胎学或发育遗传学等方面的研究提供实验手段和依据。
(二)实验条件
要求生活在清洁无尘，空气新鲜，温度在18,22?，相对湿度50,60,，噪音85 ,12次/小时的环境中。
分贝以下，通风换气8
(三)实验材料
200只2~3周龄的雌性小鼠，200只6~8周龄的雄性小鼠，孕马血清促性腺激素 (PMSG)，绒毛膜促性腺激素 (HCG)，CZB-HEPES 培养液， KSOM 培养液。
(四)实验步骤
1、将200只2~3周龄的雌性小鼠，每只腹腔注射 5 IU 的孕马血清促性腺激素(PMSG)以促进超排卵，在46 ~48h 后腹腔注射 5 IU 的绒毛膜促性腺激素(HCG)。
2、将注射了 HCG 的200只雌性小鼠与 6~8周龄大小的雄性小鼠按1:1的比例合笼进行交配，交配完毕后，分开雌性昆明小鼠，检查阴拴，有阴栓者提示以交配，并确定为受精。
3、将受精第 1 d的小鼠用颈椎脱臼法处死，用水合氯醛麻醉受体鼠，沿受体鼠背部中线最后一根肋骨水平切1cm左右切口，轻轻拨开切口，可见位于卵巢上方的白色脂肪垫.用小镊子夹住白色脂肪垫将其拉到体外，用小血管夹夹住，并靠其重力起固定作用，以防输卵管缩回体腔.用移卵管吸15,20个受精卵准备移植.将小鼠转到解剖镜下仔细寻找到输卵管.可见输卵管被一层呈半透明的囊膜所包绕，将囊膜撕破而暴露输卵管，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部. 将其置于预温的CZB-HEPES 液中，于解剖镜下用连有 1 mL 注射器的 5 号针头将输卵管壶腹部明显膨大处穿破，使胚胎流出。
4、所有胚胎用KSOM 培养基培养，以20只雌鼠的胚胎作为一小组，分为10组，进
行培养。
5、从受精后第 1 d的胚胎在含有纤维连接素的细胞外基质的 KSOM 培养基中开始培养，直至胚胎发育结束。
在实体显微镜下观察受精后每一天的胚胎发育情况，记录胚胎发育阶段及其数量。
6、对实验数据进行观察比较。
参考文献
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