小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控Sox30基因表达的机制
基因转录水平调控概念
基因转录水平调控概念
基因转录水平调控是指调控基因在转录过程中产生的mRNA
量的机制。
基因转录是DNA转录为mRNA的过程，是基因表达的第一步。
基因转录水平的调控可以通过多种机制实现，包括转录因子的结合与解离、染色质结构的改变、RNA聚合酶
的活性调控等。
转录因子是一类能够结合到DNA上并调控转录过程的蛋白质，它们可以促进或抑制转录因子的结合，从而影响基因的转录水平。
转录因子的结合位点通常位于基因的启动子区域，能够与RNA聚合酶相互作用，促进或抑制转录的进行。
染色质结构的改变也能够影响基因的转录水平调控。
染色质是复杂的DNA和蛋白质组成的复合体，能够在较大范围内影响
基因的表达。
染色质状态的改变可以通过DNA甲基化、组蛋
白修饰等方式实现，进而影响基因的转录活性。
此外，RNA聚合酶的活性调控也是基因转录水平调控的重要
机制。
RNA聚合酶是负责合成RNA的酶，其活性的调节可以通过环境信号的作用以及转录调控因子的结合来实现。
这些机制能够影响转录因子的结合与解离、RNA链的合成速率以及RNA聚合酶的招募等，从而影响基因的转录水平。
总而言之，基因转录水平调控是通过调控基因的转录过程中产生的mRNA量来实现基因表达调控的过程。
通过转录因子、
染色质结构和RNA聚合酶等的调控作用，可以实现对基因转
录水平的精细调节。
hox 转录因子
hox 转录因子
Hox基因是一类高度保守的基因，编码Hox蛋白质是一类转录因子，主要参与胚胎发育和组织分化过程中的基因表达调控。
Hox转录因子在动物体内起着至关重要的作用，特别是在后轴发育和模式形成中。
Hox基因编码的Hox蛋白质是一类DNA结合蛋白，通常包含一个高度保守的DNA结合结构域，称为homeodomain。
这个结构域使得Hox蛋白质能够与特定DNA序列结合，从而调控靶基因的转录。
Hox基因通常以多基因簇的形式存在，基因排列的顺序与其在体轴中的表达顺序高度一致，这种空间排列的规律称为Hox 基因簇的空间规则。
Hox转录因子在发育过程中的作用主要表现在胚胎发育的模式形成和组织器官的定位上。
在早期胚胎发育中，Hox基因的表达受到严格的调控，不同的Hox基因在不同的胚胎区域中表达，从而确定了不同的器官和组织的形成。
Hox基因的缺失或突变会导致发育异常，表现为器官的错位、缺失或过度发育。
Hox转录因子在成体细胞中的作用也备受关注。
研究发现，Hox基因在肿瘤的发生和发展中也发挥着重要的作用。
Hox基因的异常表达会导致细胞的增殖、分化和凋亡失衡，从而促进肿瘤的发生。
因此，Hox转录因子不仅在胚胎发育中起着关键作用，也在成体细胞的生物学过程中扮演重要角色。
总的来说，Hox转录因子是一类重要的转录因子，参与了胚胎发育和成体细胞的基因表达调控。
它的发现和研究为我们理解生物发育的分子机制提供了重要的线索，也为相关疾病的研究提供了新的思路。
希望未来的研究能够更深入地揭示Hox 转录因子的作用机制，为生物学和医学领域的发展做出更大的贡献。
小鼠胚胎早期发育过程中OCT4作用的研究进展
小鼠胚胎早期发育过程中OCT4作用的研究进展引言小鼠胚胎早期发育是一个复杂的过程，其中涉及到许多基因的调控和表达。
其中一个关键基因是OCT4，是一种转录因子，对于胚胎干细胞的自我更新和分化具有重要作用。
在过去的几十年里，科学家们对OCT4在小鼠胚胎早期发育中的作用展开了大量研究，取得了一系列重要的进展。
本文将综述这些研究成果，探讨OCT4在小鼠胚胎早期发育过程中的作用及其潜在机制。
OCT4的功能和表达调控OCT4是一个关键的转录因子，它在胚胎干细胞中的作用被广泛研究。
OCT4对于维持胚胎干细胞的干性、自我更新和多能性具有重要作用。
在小鼠早期胚胎发育中，OCT4的表达模式也备受关注。
研究显示，OCT4在小鼠受精卵后期的囊胚阶段开始表达，并且在早期内细胞（ICM）中高度表达。
随着胚胎发育的进展，OCT4的表达范围逐渐限制在胚胎内细胞中，而在外细胞中逐渐减少。
这种表达模式的调控与胚胎干细胞的定向分化密切相关。
OCT4调控基因表达的机制OCT4通过调控多个基因的表达来维持胚胎干细胞的干性和多能性。
在早期的研究中发现，OCT4可以与其他转录因子（如SOX2、NANOG等）形成复合物，共同调控多个靶基因的表达。
近期的研究进展显示，OCT4还可以通过与表观遗传修饰因子相互作用，影响染色质结构和可及性，从而调控基因的表达。
OCT4还可以通过miRNA的调控网络影响胚胎干细胞的功能。
这些新的研究成果为我们深入理解OCT4的作用机制提供了新的思路。
OCT4在转基因技术中的应用随着对OCT4功能的深入研究，人们发现OCT4在胚胎干细胞和再生医学领域具有广阔的应用前景。
利用OCT4转基因技术可以实现胚胎干细胞的高效自我更新和多能性维持，并且为再生医学提供了丰富的细胞来源。
OCT4还可以通过调控其下游的基因网络，促进器官再生和损伤修复。
OCT4在转基因技术中的应用潜力巨大，将为再生医学领域带来革命性的进展。
结论OCT4在小鼠胚胎早期发育过程中发挥着重要作用。
转录因子c3h的作用
转录因子c3h的作用转录因子是一类在基因转录调控中起关键作用的蛋白质，通过结合到特定的DNA序列上，控制基因的表达。
其中，转录因子c3h在分子遗传学研究中备受关注，因为它在调节细胞分化、发育和代谢过程中具有重要作用。
在本文中，我们将探讨转录因子c3h的作用及其在不同生物过程中的表现形式。
在细胞分化和发育过程中，转录因子c3h可以促进干细胞向不同细胞类型的分化。
例如，在菌株Pseudomonas aeruginosa中，c3h对于生殖胞形成以及对环境压力的适应具有重要作用。
在果蝇Drosophila melanogaster中，c3h也起到使干细胞分化为神经元的作用。
在哺乳动物中，研究表明c3h可以诱导间充质细胞向肝脏细胞的分化，并且c3h在干细胞的分化过程中可以协调多个细胞信号通路。
这些研究表明，c3h在细胞分化和发育中具有广泛和重要作用。
除了在细胞分化和发育过程中起关键作用外，转录因子c3h还可以调节代谢途径。
在厌氧菌中，c3h可以在缺氧条件下启动乳酸代谢，以维持细胞的生存。
在酿酒酵母中，c3h在合成脂肪酸的过程中也起到调控作用。
在小鼠的胰岛细胞中，c3h可以控制胰岛素的合成和分泌。
这些研究表明，c3h不仅在细胞分化和发育中发挥重要作用，而且在代谢过程中也具有调控作用。
另外，转录因子c3h还在哺乳动物的生物钟和节律控制中起关键作用。
在小鼠中，c3h和其他转录因子一起调节睡眠和醒来的控制机制。
在果蝇中，c3h与其他时钟蛋白共同调节生物钟的节律性。
这些研究表明，c3h作为转录因子在生物钟和节律控制中具有重要地位。
总的来说，转录因子c3h在细胞分化和发育、代谢途径以及生物钟和节律控制等多种生物过程中发挥重要作用。
研究c3h的作用机制和调节途径，不仅可以深入理解分子生物学的基本原理，还可以为人类健康和疾病的治疗提供新的思路和方法。
生殖细胞发育过程中的表观遗传学调控
生殖细胞发育过程中的表观遗传学调控生殖细胞发育是体细胞向生殖细胞转化的过程，其关键环节是表观遗传学调控。
表观遗传学是指一代与另一代之间基因序列不变的情况下，基因表达的不同。
在生殖细胞发育过程中，通过基因启动和调控产生稳定的表观遗传学信息，才能产生健康的卵子和精子。
生殖细胞发育过程中的表观遗传学调控涉及到DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等多个方面。
DNA甲基化是指在DNA分子的CpG位点上添加甲基基团，阻止DNA结构调控蛋白的结合，从而导致某些区域的基因沉默。
在生殖细胞的发育过程中，DNA甲基化修饰是发生最为显著的变化，通常包括DNA去甲基化和DNA重新甲基化。
DNA去甲基化是指DNA甲基化酶的作用下，去除DNA上的甲基基团。
DNA重新甲基化是指在DNA的顺式甲基化酶1（DNMT1）的作用下，新合成的DNA分子被甲基化。
组蛋白修饰是指在染色质上相关区域的蛋白质上附着不同的化学基团（如乙酰基、甲基、泛素等），以及不同的酶对这些基团的结构进行调整，从而影响基因的启动和沉默。
在生殖细胞发育中，组蛋白修饰的重要作用主要源自于以下两类酶：一类是histone modification enzymes（HMEs），能够添加、删除和识别组蛋白上的化学修饰基团，从而改变核小体的三维构型和染色质的可达性；另一类是chromatin-remodeling enzymes（CREs），能够解构并重构核小体，增强某些基因的可达性，或者降低某些基因的可达性。
组蛋白修饰在生殖细胞发育的过程中会发生动态变化，从而产生特异的表观遗传学信息。
非编码RNA是指无法翻译成蛋白质的RNA分子，包括长链非编码RNA （lncRNA）、微小RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA）等。
非编码RNA能够作为信号分子或调控因子，集中或分散某些基因群的表达。
在生殖细胞的发育中，非编码RNA发挥了非常重要的作用，调控着某些基因在生殖细胞中的表达和沉默。
真核生物起始因子功能解析及其调控机制
真核生物起始因子功能解析及其调控机制概述在真核生物中，起始因子是基因转录的关键调节因素之一。
它们是启动转录复合物的组成部分，通过结合到基因启动子上来识别转录起始位点并促进转录起始。
起始因子的功能解析及其调控机制对于理解基因转录的调控网络和细胞发育过程具有重要意义。
一、起始因子的功能解析起始因子在基因转录中具有多种重要功能。
1. 识别转录起始位点：起始因子能够结合到基因启动子的特定序列上，以识别转录起始位点。
这一过程是基因转录的第一步，起始因子的准确识别能够确保转录过程的正确进行。
2. 促进转录起始：通过与RNA聚合酶Ⅱ和其他辅助蛋白结合，起始因子能够形成转录起始复合物，从而促进转录的起始。
它们能够与转录激活子和共激活因子相互作用，形成复杂的调控网络。
3. 调节基因的表达水平：起始因子可以通过调节基因的转录起始水平来影响基因的表达水平。
它们可以与转录抑制子相互作用，从而调节基因的活性。
二、起始因子的调控机制起始因子的功能受到多种调控机制的影响。
以下是常见的调控机制。
1. 转录因子的调节：许多转录因子可以与起始因子相互作用，从而影响其功能。
这些转录因子可以作为转录激活子和共激活因子，增强或抑制起始因子的活性。
例如，转录因子可以通过与起始因子相互作用来招募辅助蛋白，从而增强转录起始复合物的形成。
2. 染色质结构的调控：染色质结构的状态也可以影响起始因子的功能。
染色质的松弛与紧缩状态可以影响起始因子的结合能力和识别特异性。
染色质修饰酶能够添加或去除染色质上的化学修饰基团，从而影响起始因子的结合和活性。
3. 表观遗传学调控：起始因子的功能还受到表观遗传学调控的影响。
DNA甲基化和组蛋白修饰是常见的表观遗传学调控方式，它们可以通过改变染色质状态来影响起始因子的结合和招募。
三、起始因子的研究进展随着高通量测序技术的发展，研究人员能够对起始因子的功能进行全面的分析。
许多研究利用ChIP-seq技术来鉴定起始因子的结合位点和靶基因，从而揭示起始因子在转录调控中的作用。
精子发生调控因子的生物学功能及其在生殖中的应用
精子发生调控因子的生物学功能及其在生殖中的应用随着生物科学的发展，对生殖生物学的研究也越来越深入。
而在生殖过程中，精子的发生调控因子起着至关重要的作用。
它们不仅在精子发生过程中发挥着调节作用，还可以在诊断和治疗生殖系统疾病方面提供一定的帮助。
一、精子发生调控因子的生物学功能精子发生调控因子是调控精子发生的一类生物分子，它们包括转录因子、信号通路相关蛋白、代谢酶等。
这些因子参与了不同的信号途径，调控精子成熟过程中的基因表达，从而维持着精子的正常发育。
1. 转录因子转录因子是一类调节基因表达的蛋白质，主要通过调控DNA的转录来参与其中。
在精子发生过程中，转录因子可调控从无性生殖细胞向精子发生的转变。
其中，SOHLH2、DMRT1、PRDM14等转录因子参与了调控睾丸育索干细胞的分化和早期精子分化。
2. 信号通路相关蛋白信号通路相关蛋白即作为信号途径的组成部分的蛋白质。
它们在精子发生过程中也扮演着非常重要的角色。
例如，GDNF/RET信号途径可调控绿藻亚科干细胞的增殖和存活，C-kit/SCF信号途径则可促进睾丸细胞分化为早期精子细胞。
3. 代谢酶代谢酶是催化生化反应的酶，可在细胞代谢和信号途径等方面发挥重要功能。
在精子发生过程中，代谢酶可维持睾丸育索干细胞的能量代谢，从而保障精子的发育和成熟。
例如，磷酸酵母酸激酶(MAPK)是一个重要的代谢酶，可增强睾丸育索干细胞的生存和增殖。
二、精子发生调控因子在生殖中的应用精子发生调控因子的研究不仅仅是为了解析生殖发育的分子调节机制，还为生殖医学研究提供了一些思路。
1. 男性不育的诊断和治疗男性不育是一种常见的生殖系统基础疾病，近年来其发病率还在不断增加。
精子发生调控因子的异常表达与男性不育密切相关，在不育症的诊断和治疗中具有潜在价值。
例如，在一些研究中，SOHLH2和DMRT1的基因异常与男性不育有关。
2. 人类体外受精助孕人类体外受精是现代生殖医学的一项技术，它可以为一些不孕不育夫妻带来孩子。
精子发生过程中基因表达转录水平的调控
HEREDITAS (Beijing) 2011年ISSN 0253-9772 精子发生过程中基因表达转录水平的调控∗张秀军1, 2，刘美玲1，贾孟春11. 国家人口计生委科学技术研究所，北京 100081；2. 河北联合大学生命科学学院，唐山 063000摘要：哺乳动物精子发生于睾丸的生精小管，是一个高度复杂的细胞分裂和分化过程，涉及到错综复杂的基因表达调控过程，包括转录和转录后水平的调控，其中任何一个环节出错都可能导致雄性不育。
因此，揭示精子发生过程中的分子调控机理，对发现新的男性避孕方法及治疗不育症有重要意义。
文章重点综述了近年有关雄激素及其受体、雌激素及其受体、转录因子和染色质相关因子在精子发生转录水平调控的研究进展。
关键词：精子发生；转录调控；转录因子；染色质相关因子Regulation of gene expression during spermatogenesis at transcription levelZHANG Xiu-Jun1,2, LIU Mei-Ling1, JIA Meng-Chun11. National Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China;2. School of Life Sciences, Hebei United University，Tangshan 063000, ChinaAbstract: Mammalian spermatogenesis is a highly complex cell division and differentiation process occurring in the seminiferous tubules of the testis. This processes are regulated at both transcriptional and post-transcriptional levels, any mistake in this process can lead to infertility. Unveiling the molecular mechanisms of spermatogenesis has important implications for exploring novel contraceptive approach and treatment of infertility. This review addresses recent progress towards understanding the regulation of androgen, estrogen and their receptors, transcription factors and chromatin-associated factors for spermatogenesis at transcriptional level.Keywords: spermatogenesis；transcriptional regulation；transcription factor；chromatin-associated factor收稿日期:2011-01-20；修回日期:2011-03-14基金项目:国家自然科学基金项目(编号：81072093)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(国家人口计生委科学技术研究所)项目(编号：2009GJSSJKB03) 资助作者简介:张秀军，博士后，专业方向：细胞生物学。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控Sox30基因表达的机制齐婉婧;孙奇;李媛;张雪;金美玉;何岩;郑志红【摘要】目的 SOHLH1(Spermatogenesis-and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1)和SOX30(SRY box)是与精子发生相关的转录因子,Sohlh1与Sox30的基因敲除雄鼠均丧失生育能力.出生后7天Sohlh1基因敲除雄鼠DNA芯片显示Sox30表达显著下调,本文探究了早期发育相关转录因子SOHLH1对精子发生后期的关键基因Sox30基因的转录调控作用.方法构建Sox30启动子荧光素酶表达质粒,瞬时共同转染Sox30荧光素酶表达质粒和Sohlh1真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值.通过染色质免疫共沉淀实验检测SOHLH1与Sox30启动子DNA序列特异序列的结合情况筛选主要激活位点.结果共转染Sohlh1真核表达质粒和Sox30启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组.SOHLH1与Sox30启动子上的特异性位点结合,在-489 bp位点的结合作用最强.结论精子发生早期重要转录因子SOHLH1可以直接激活顶体形成相关基因Sox30转录,-489 bp(CAGGTG)为主要特异性结合位点,丰富了精子发生中延时翻译表达调控的现象并进行了调控机制的初步探索.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2019(029)007【总页数】6页(P36-41)【关键词】精子发生;Sox30;ChIP;SOHLH1;小鼠【作者】齐婉婧;孙奇;李媛;张雪;金美玉;何岩;郑志红【作者单位】中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001【正文语种】中文【中图分类】R-33雄性生殖细胞经历一系列特定基因程序性表达，使具有有丝分裂活性的原始生殖细胞发育为成熟精子的过程被称为精子发生。
精子发生起源于精原干细胞，经历精原细胞的有丝分裂期和精母细胞的减数分裂期[1]，在精子形成期圆形精子细胞经历复杂的结构重塑最终成为成熟精子[2]。
精卵发生特异表达螺旋-环-螺旋转录因子1 (Spermatogenesis- and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1，Sohlh1)编码357个氨基酸含有一个bHLH结构域，SOHLH1可以形成异源二聚体或同型二聚体并与DNA上的E-box序列(CANNTG)结合[3]调控下游基因表达。
SOHLH1在雄性生殖细胞中特异表达，主要表达于A1-A4型精原细胞，在Int型及B型精原细胞中该蛋白逐渐消失[4]。
SOHLH1是涉及精原细胞分化的重要转录因子[4]，调控c-Kit表达[5]、与SOHLH2形成异源二聚体下调Stra8表达[6-8]并参与精子发生相关的重要信号通路[9]从而影响精原细胞发育和减数分裂。
本课题组前期研究发现Sohlh1基因敲除纯合子雄性小鼠不育，精原细胞发育及分化异常导致进入减数分裂的精母细胞减少，精母细胞大量凋亡，无成熟精子产生。
基因芯片检测结果显示出生后7天野生型雄鼠与Sohlh1基因敲除雄鼠睾丸组织中Sox30、Rnf17等精子发生中关键基因均出现表达差异[10]，推测SOHLH1可能直接或间接调控Sox30基因转录。
Sox30是睾丸生殖细胞特异表达基因Sox(Sry-related High Motility Group (HMG) box)家族H亚族唯一的成员，含有3个外显子，编码蛋白具有一个HMG box结构域[11]，参与性腺发生、精子发生[12]并且与顶体形成相关[13]。
Sox30基因敲除雄性小鼠无生育能力，精子发生阻滞于精子形成期，圆形精子细胞核表面没有参与顶体形成的顶体颗粒[14]。
目前，关于转录因子调控Sox30表达未见文献报道。
我们利用生物信息学预测 Sox30基因上游启动子区域，发现存在SOHLH1转录因子结合的E-box序列，本研究旨在探究精原细胞早期发育相关的重要转录因子SOHLH1参与精子发生后期相关基因Sox30的转录调控机制，并进一步筛选Sox30基因启动子序列上SOHLH1特异性结合位点的DNA序列。
1 材料和方法1.1 实验动物本实验中共使用7周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠9只(三次重复实验)，体重约22～24 g(误差不大于10%)，来源于中国医科大学实验动物部[SCXK(辽) 2018-0004]。
取材在中国医科大学实验动物科学部屏障动物实验设施进行[SYXK(辽)2018-0008]，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。
本实验经中国医科大学实验动物福利与伦理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)审查通过，审批编号：No. 2017018。
1.2 主要试剂与仪器Tris平衡酚(鼎国生物技术有限公司，北京)，PCR引物(Genescript，南京)，Q5® High-Fidelity DNA Polymerase(Cat.#M0491S，NEB，美国)，Axygen mini-prepare 质粒提取试剂盒(Cat.AP-MN-P-50)、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Cat.AP-GX-50)、AxyPrep PCR清洁试剂盒(Cat.AP-PCR-50)(Axygen，美国)，pMD18-T Vector、E. coli DH5α感受态大肠杆菌、限制性内切酶HindⅢ和KpnⅠ(宝生物公司，大连)，pGL3-Basic质粒、pRL-TK质粒(Promega，美国)，T4 DNA连接酶(NEB，美国)，pcDNA3.0-Sohlh1真核表达质粒(本课题组构建)[15]，转染试剂LipofectamineTM 3000(Invitrogen，美国)，Dual-Luciferase® Report Assay Systerm试剂盒(Cat.# E1980，Promega，美国)，EZ-ChIPTM -Chromatin Immunoprecipitation Kit试剂盒(Cat#17-371RF，Millipore，美国)，SOHLH1抗体(3∶50，ab41520，Abcam，美国)，PCR仪(Bio-Rad，美国)，Galaxy R二氧化碳培养箱(RS Biotech，德国)，多功能酶标仪(M200 PRO，Tecan，瑞士)。
1.3 实验方法1.3.1 基因组DNA提取剪取成年C57BL/6J雄鼠0.5 cm鼠尾组织，放入1.5 mL 离心管中并分别加入500 μL鼠尾消化液和5 μL蛋白酶K，55℃水浴锅中消化过夜。
鼠尾消化液配置方法如下：取NaCl 2.93 g，SDS 2.5 g，1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)5 mL，0.5 M EDTA(pH 8.0)10 mL混匀后定容至500 mL。
酚氯仿法提取基因组DNA，产物4℃保存。
1.3.2 Sox30基因启动子区域SOHLH1结合位点分析及引物设计针对Sox30转录起始位点上游2000 bp范围内启动子DNA序列使用Jasper软件预测SOHLH1特异性结合位点E-box(CANNTG)，根据评分及位点分布设计合成引物，构建三个启动子荧光表达质粒1784 bp-Sox30-promoter、984 bp-Sox30-promoter、876 bp-Sox30-promoter，启动子区域PCR引物序列为Sox30-JD1784-F：5’-TCTGCTTGATATCCTTCCCTTT CA-3’，Sox30-JD1784-R：5’- GTGCGAGAACCCTGG AATCA-3’，Sox30-JD984-F：5’-TTACTCAACAGTCG GCAC-3’， Sox30-JD984-R：5’-CGAGAACCCTGGAA TCAT-3’，Sox30-JD876-F：5’- AAGCACTTCAAAGGA CAT-3’, Sox30-JD876-R：5’- CGAGAACCCTGGAA TCAT-3’。
1.3.3 PCR扩增Sox30基因启动子片段以C57BL/6J雄鼠鼠尾DNA为模板进行PCR扩增，在50 μL PCR反应总体系内使用Q5® High-Fidelity DNA Polymerase扩增所需DNA片段，反应条件：98℃ 8 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。
1.5%琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增产物检测，切胶回收目的片段。
1.3.4 构建Sox30启动子全长和截短序列的pGL3-Sox30荧光素酶报告质粒纯化回收的DNA片段与pMD18-T Vector 16℃连接过夜。
连接产物转化E. coli DH5α感受态大肠杆菌，提取质粒DNA进行测序，筛选正确连接的菌种提取质粒。
限制性内切酶HindⅢ和KpnⅠ双酶切所提取的Sox30质粒DNA和pGL3-Basic质粒载体骨架，使用TaKaRa公司说明书提供的双酶切体系。
T4 DNA连接酶反应体系16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌，挑菌落克隆提取质粒DNA，测序鉴定。
1.3.5 转染293T细胞并检测双荧光素酶报告基因系统荧光素酶活性于37℃、5% CO2的培养箱中培养HEK293T细胞，当细胞处于对数生长期时，将细胞接种于96孔板中培养16 h，汇合度达到80%时进行转染。
将构建好的pGL3-Sox30启动子萤光素酶报告质粒(0.4 μg/孔)、pcDNA3.0-Sohlh1真核表达质粒(0.4 μg/孔)和内参pRL-TK质粒(0.008 μg/孔)按照LipofectamineTM 3000实验手册共转染293T细胞。
37℃、5% CO2在培养箱中培养48 h后，将共转染的HEK293T细胞取出，弃掉96孔板中培养基，每孔加入100 μL 1×PBS清洗细胞，弃掉PBS。
根据Dual-Luciferase® Report Assay Systerm操作手册指导，样品放入M200 PRO多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性及海肾荧光素酶活性，保存数据进行计算及统计分析。
1.3.6 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验筛选SOHLH1结合位点颈椎脱位法处死成年C57BL/6J雄鼠取双侧睾丸组织剥离出曲细精管，实验方法参照文献所述[10]，甲醛处理新鲜睾丸组织DNA与蛋白交联，按照EZ-ChIPTM - Chromatin Immunoprecipitation Kit试剂盒说明书提取SOHLH1抗体结合的DNA片段。