石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

1、组织的采集、固定和保存：

采取组织后，

方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固

定时间）或过夜

方法二：采用bouin '固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）

PBS缓冲液洗三次，每次5min , 4 C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：

固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚

4 -10 ^m，贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。

石蜡包埋：

保存于4C 70%乙醇中的组织样品

80% 乙醇15 min

95% 乙醇15 min

100% 乙醇15mi n 2

1/2乙醇1/2二甲苯15 min

-

二甲苯透明5-10 min

1/2二甲苯1/2石蜡30 min

石蜡(1) 1.5hr

石蜡（2） 1.5-2.5hr

石蜡（3）包埋

RT保存

3、石蜡组织切片的免疫组化方法：

密封保存于RT的组织切片

二甲苯(1) 20 min

二甲苯（2）20 min

100% 乙醇20min

95% 乙醇10 min

80% 乙醇10 min

通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈

切片在PBS中浸泡5 min*2

0.4%Trit onx RT 10 min

I

切片在PBS中浸泡5 min*3

3%H2O2 RT 10mi n

切片在PBS中浸泡5 min*3

0.25% 胰酶RT 10min

切片在PBS中浸泡 5 mi n*3

Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trito nx-100 in PBS) RT 6 0min

倾去blocking buffer ，勿洗

一抗4 C overnight in blocking buffer

取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡5 min*3

I

二抗in blocking buffer GAR1 : 200 (GAM1 100), RT 1h

切片在PBS中浸泡 5 min*3

DAB 显色5-10min（ 50 微升A+50 微升B+900 微升PBS+5 微升3%H2O2 ）

如果是增强型DAB只要1min即可。

切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s,

玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙

醇分色1〜2秒钟（或更久）

I

脱水85%乙醇5 min

95% 乙醇5 min

无水乙醇 5 min

无水乙醇5mi n

二甲苯⑴ 10min

二甲苯（2） 10min

中性树胶封片，室温干燥保存

4、石蜡组织切片的免疫荧光方法:

密封保存于RT的组织切片

二甲苯(1) 20 min

二甲苯(2) 20 min

100% 乙醇20min

95% 乙醇10 min

80% 乙醇10 min

通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈

切片在PBS中浸泡5 min*2

0.4%Trit onx RT 10 min

切片在PBS中浸泡5 min*3

切片在PBS 5 mi

n*3

0.25% RT 10min

切片在PBS 5 mi

n*3

Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trit on x-100 in PBS)

倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer

取出切片复温1h ,切片在PBS 中浸泡 5 min*3

I

荧光二抗 in blocking buffer GAR-cy3 1： 1000, GAM-4881:

切片在PBS 中浸泡 5 min*3

I

moil 封片，避光4 C 保存

RT 6 0min

1000RT1h