基于四氢异喹啉-3-羧酸骨架的热休克蛋白90抑制剂的设计、合成及抗肿瘤活性研究
第二节 多肽在医药中的应用
第二节多肽在医药中的应用一多肽抗生素研究进展多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，一般具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。
按照化学结构的不同，多肽抗生素可分为5类：①具有螺旋结构的线性多肽；②富含某种氨基酸的线性多肽；③含有一个二硫键的多肽；④含有两个或两个以上二硫键的多肽；⑤羊毛硫抗生素。
根据作用机理的不同，多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。
多肽抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面，并且有着很大的发展潜力。
多肽抗生素是指相对分子质量通常在1×104以下，具有抗菌活性的多肽类物质。
但是由于区分小肽与蛋白质的界限不很严格，不同学者对多肽抗生素的分子量上限有不同的观点。
最初，人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“antibacterial peptides”，中文译为“抗菌肽”，其原意应为“抗细菌肽”。
后来发现有些“抗细菌肽”还具有抗真菌等其它微生物的功能，便称之为“antimicrobial peptides”。
但是随着研究的深入，人们相继发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌细胞等功能，尤其是随着这类多肽物质在医药学上的应用，许多学者倾向于称之为“peptide antibiotics”――“多肽抗生素”。
也许是由于几乎所有的多肽抗生素都具有抗细菌的功能，“抗菌肽”作为一个约定俗成的名称，在国内依然被广泛采用。
如果没有特殊说明，本文中的多肽抗生素特指由基因编码，在核糖体上合成的多肽抗生素。
那些在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质的抗生素，如杆菌肽、多粘菌素E、短杆菌肽S等不在本文的讨论范围之内。
二多肽物质分离与分析方法研究进展近几年来多肽类物质的提取分离与分析方法，主要包括高效液相色法、电泳、质谱及核磁共振等方法在肽类物质研究中的最新应用进展。
多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。
泊沙康唑临床应用专家共识
属于第二代三唑类抗真菌药物,其抗菌谱和药物代
代氯,同时侧链进行羟基化,一系列结构改造使其
谢过程有别于其他三唑类药物,口服混悬液、肠溶
和真菌亲和 力 更 强,稳 定 性 更 高,细 胞 毒 性 增 加,
片和注射剂分别于 2005、2013 和 2014 年经美国食
品药品监督管理局批准先后上市。在我国,泊沙康
片多中 心 PK 研 究 (n =65,AML/MDS) 显 示,
[ ]
泊沙康唑在预防和治疗肺真菌病时,虽然血药浓度
泊沙 康 唑 在 体 内 消 除 缓 慢, 半 衰 期 为 27~
35h,其中仅 约 的 药 物 在 肝 脏 转 化 为 多 种 形
式的 葡 萄 苷 酸 化 衍 生 物 经 肾 脏 排 泄, 而 大 部 分
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sn 1673
436X 2020 04 001
近年来,随 着 各 类 免 疫 缺 陷 人 群 及 危 重 疾 患
的增多, 侵 袭 性 真 菌 病 (
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[
1
5]
, 且 非 白 念 珠 菌、
IFD)的整体发病 率 逐 年 上 升
曲霉及毛霉等 真 菌 感 染 的 比 例 在 血 液 科、 呼 吸 科、
范围广泛。本共识对泊沙康唑的 临 床 药 理 特 性、 现 有 临 床 研 究 资 料 以 及 编 写 组 专 家 的 临 床 应 用
经验进行了系统的复习和总结, 在 此 基 础 上 对 其 临 床 应 用 做 出 了 全 面 建 议, 这 些 建 议 涉 及 了 泊
沙康唑在预防和治疗侵袭性真 菌 病 中 的 临 床 应 用 原 则、 在 特 殊 人 群 中 的 使 用 原 则、 治 疗 药 物 监
维尔斯迈尔-哈克-阿诺德反应
Me
Me
NH C+ O
POCl3
R -HOPOCl2
HN C
Cl
MFA
HO
R
C
H2O
-HN(CH3)C6H5
-HCl
R
R = aromatic ring-activating
(3)
electron-donor substituent
通过对反应机理的探讨和应用范围的扩展，该方法现在已经成为各种活性芳 烃和杂环芳烃甲酰化的通用方法。这就是经典的 VH 反应 (或称 Vilsmeier 甲 酰化反应)，其中 N-甲基甲酰苯胺 (MFA) 和 POCl3 生成的加合物被称为 VH 试剂 (简称 Vilsmeier 试剂)。
Me N CH3
O
POCl3
Me
N MeN(Me)Ph来自Cl + Me
Cl (2)
N(Me)Ph
Cl
4
二. VH 反应和 VHA 反应的定义
2.1 VH 反应
1927 年，Vilsmeier 和 Haack 发表了题为“在卤代磷与烷基甲酰苯胺作用 下的对位取代仲/叔-烷基氨基苯甲醛的制备新方法”论文[1]。该论文报道了由 N甲基甲酰苯胺 (N-Methylformanilide, MFA) 和 POCl3 组成的加合试剂与推电子 取代基团活化的芳烃 [R = N(CH3)2] 发生的反应。如式 3 所示：反应首先形成 了一个亲电取代的中间体 (季铵盐)，通常这类季铵盐中间体呈各种不同的红色。 经水解使红色消除后 (验证了 Friedel 实验现象)，得到了相应的芳香(甲)醛产 物。由此，他们发现了一个在芳烃环上引入甲酰基的简便方法。
1
六. VHA 反应在天然产物和药物合成中的应用 ………………………………60 6.1 天然产物 Homofascaplysin C 的全合成…………………………………60 6.2 天然产物 FR-900482 的全合成…………………………………………61 6.3 天然产物 (±)-Illudin C 的全合成…………………………………………62 6.4 临床药物苹果酸舒尼替尼的合成…………………………………………62
药物化学及药物合成反应实验指导书.
药物化学及药物合成反应实验指导书（供药学、制药工程、药剂、药学专升本、药学专科、药分专科专业用）药物化学-制药工程教研室编写安徽中医学院自编前言我国加入世界贸易组织（WTO）以来，制药行业迎来难得的发展机遇，也面临着前所未有的挑战。
我国的药物研究正经历着一个从仿制为主到创制新药为主的历史性转变时期，如何抓住机遇，顺利实现这个历史性转变，关键在于创新型人才的培养。
药物化学是药学类各专业和制药工程专业重要的专业课，也是一们实验性很强的课程，在药学类创新型人才培养方面发挥着重要作用。
安徽中医学院药物化学-制药工程教研室积极探索药物化学与药物合成反应实验课教学改革，并依据药物化学及药物合成反应教学大纲的要求编定了本实验指导用书，目的是通过实验加深理解药物化学的基本理论和基本知识，掌握合成药物的基本方法，掌握对药物进行结构改造与修饰的基本方法，了解拼合原理在药物化学中的应用，进一步巩固有机化学实验的操作技术及有关理论知识，培养学生理论联系实际的作风，实事求是，严格认真的科学态度与良好的工作习惯。
在实验指导用书的编写中，介绍了药物的绿色合成内容和文献来源，安排了一些中药有效成分的合成，以及中药活性物质的结构修饰与改造内容，充分体现了中医药院校的特色和实用性。
本实验指导用书由三部分组成，第一部分介绍了实验室的安全常识和基本知识；第二部分介绍了十六个药物合成和中药有效提取、合成及结构改造与修饰内容；第三部分为附录介绍了生产工艺中避免使用和限制使用的溶剂和部分与药物化学或合成相关的文献来源，供实际工作中参考使用。
本实验教材是药化化学-制药工程教研室教学经验的集体总结，限于水平，难免有误，我们要在使用过程中不断总结经验，收集反映，以便进一步修正提高。
安徽中医学院药物化学-制药工程教研室2008年12月目录第一部分实验须知一、实验室安全二、化学药品、试剂的存储及使用三、废品的销毁四、实验室中一般注意事项五、实验记录和实验报告第二部分实验项目一、苯妥英的制备二、贝诺酯的制备三、磺胺醋酰钠的制备四、对羟基苯乙酮的制备五、桂皮酰哌啶的制备六、烟酸的制备七、香豆素-3-羧酸的合成八、苯佐卡因的合成九、1,4-二氢吡啶类钙离子拮抗剂的绿色合成十、阿司匹林的合成十一、哌嗪枸橼酸盐的合成十二、阿魏酸哌嗪盐的合成十三、氟哌酸的合成十四、去甲斑蝥素中间体的合成十五、苦参生物碱的提取十六、氧化苦参碱的化学合成附录一：生产工艺中避免使用和限制使用的溶剂附录二：部分与药物化学或合成相关的文献来源第一部分实验须知一、实验室安全药物化学及药物合成反应和有机化学一样是一门实践性很强的学科，因此，在进入实验室工作之前，希望参加实验者必须对实验课程的内容，要有充分的准备，而且要通晓实验室的一些基本规则，遵守实验室安全操作须知，才能避免可能发生的一些危险情况。
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基于四氢异喹啉-3-羧酸骨架的热休克蛋白90抑制剂的设计、合
成及抗肿瘤活性研究
热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)是ATP依赖的分子伴侣蛋白,
参与客户蛋白的构象成熟和功能稳定,防止蛋白经由泛素蛋白酶体系统降解。在
Hsp90调控的客户蛋白中,有很多是致癌信号通路中的原癌基因表达蛋白或重要
的信号转导因子,参与调控肿瘤细胞的基本特征,与肿瘤的发生和发展关系密切。
因此,针对Hsp90单一靶点的单一用药抑制其伴侣功能,导致多种客户蛋白
的降解,多重阻断肿瘤信号通路,最终摧毁肿瘤赖以生存的整个信号通路网络,能
够同时拮抗多个甚至全部肿瘤细胞的标志性特征,有效减少药物耐受。在充分调
研文献的基础上,针对Hsp90蛋白N端ATP结合域的三维结构及Hsp90与其抑制
剂的作用模式进行了深入的研究。
采用基于片段的药物设计(FBDD)方法,选取根赤壳霉素的5-氯-2,4-二羟基
苯甲酸片段,以四氢异喹啉-3-羧酸为骨架,设计、合成了(S)-Tic(A1-13)和
(R)-Tic(B1-13)两个系列的化合物。抗肿瘤细胞增殖活性实验揭示了目标化合物
的构效关系,含手性(R)-Tic骨架的分子活性更高。
CETSA靶向Hsp90α活性筛选结果印证了抗肿瘤细胞增殖活性实验结
果,(R)-Tic骨架的B系列化合物靶向Hsp90α,而且其芳香侧链提高化合物的活
性。两轮活性筛选结果表明,含(R)-Tic骨架的化合物B7呈现最强的抗肿瘤细胞
增殖活性和最佳的靶向Hsp90α活性。
CETSA“熔化曲线”和ITDRFCETSA(等温剂量反应)曲线证实化合物B7在胞
内直接与Hsp90α结合。此外,如同公认的Hsp90抑制剂GA,化合物B7同样能够
引起Hsp90客户蛋白水平下调和Hsp70水平上调,进一步证实了化合物B7靶向
Hsp90。
分子模拟结果阐明了化合物B7活性最佳的原因,(R)-Tic骨架维持小分子独
特的活性构象,苄胺侧链深入诱导疏水口袋,与氨基酸残基Phe138形成π-π相
互作用。所有的这些特性保证化合物B7是一个可靠的Hsp90抑制剂的先导化合
物。
为了提高先导化合物B7苄胺侧链与疏水口袋的空间适配,我们设计、合成了
C系列侧链苯环取代衍生物和D系列侧链芳杂环衍生物。活性筛选实验显示芳环
取代基的种类、个数、位置显著影响化合物的活性。
芳环对位单取代的氢键受体取代基有利于提高化合物活性,其中含对位吡啶
基的化合物D4活性最佳。CETSA“熔化曲线”和ITDRFCETSA曲线证实化合物D4
在胞内直接与Hsp90α结合。
此外,同GA 一样,化合物D4同样能够引起Hsp90客户蛋白水平下调和Hsp70
水平上调,进一步证实了化合物D4靶向Hsp90。分子模拟结果阐明了化合物D4
活性最佳的原因,5-氯-2,4-二羟基苯甲酰基片段与Hsp90 口袋底部结
合,(R)-Tic骨架维持D4独特的活性构象,酰胺侧链深入诱导疏水口袋,吡啶环不
仅与氨基酸残基Phe]38形成π-π相互作用,而且与氨基酸残基Tyr139形成氢键
结合。
抗肿瘤细胞增殖活性普筛实验表明化合物D4具有广谱的抗肿瘤细胞增殖活
性,并且这种活性呈现时间与浓度依赖性。在MDA-MB-453细胞中,D4诱导细胞
G0/G1期阻滞。
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和western blot实验证实D4诱导
MDA-MB-453细胞凋亡。在NF-κB信号途径中IKK是关键激酶。
Hsp90抑制剂D4不仅降低IKK的蛋白水平,而且还能通过磷酸化Hsp27降低
IKK的生物活性。通过对IKK的调控,D4成功地抑制TNF-α诱导的NF-κB的活
化。
综上所述,化合物D4是一个可靠的Hsp90抑制剂,具有进一步探索其生物作
用机制的价值。化合物D4的进一步结构优化集中在四氢异喹啉片段。
化合物D4的分子模拟结果显示四氢异喹啉的苯环临近Lys58并且朝向溶剂
暴露区,就此两种优化策略产生E系列化合物和F系列化合物。期望与Lys58产
生氢键作用提高靶向活性,同时优化物理化学性质和药代动力学行为,提高用药
安全性。
目前,这两个系列化合物的合成及活性筛选工作已完成,抗肿瘤机制研究正
在进行中。综上,本课题基于Hsp90 N端ATP结合域的三维结构及抑制剂与Hsp90
的作用模式,综合应用药物化学、化学生物学、计算机化学等前沿学科,合理设计、
合成了系列的四氢异喹啉-3-羧酸类化合物。
引入细胞热转变分析(CETSA)检验化合物的靶向性,并对代表性化合物进行
了深入的机制研究。本课题的研究内容拓展了 Hsp90抑制剂的结构类型,为下一
代抑制剂的研发提供了借鉴意义。