高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法的标准曲线法流程
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色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
高效液相色谱法的分离原理
高效液相色谱法的分离原理
高效液相色谱法（HPLC）的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。
与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组成、比例和pH 值可灵活调节，分离模式多样。
在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。
高效液相色谱特点
高效液相色谱法（HPLC）具有高压、高速、高效、高灵敏度、高选择性等特点，广泛应用于医药、环保、石化、食品、化工等行业，是现在分离分析的重要方法。
以下是对这些特点的概述：
1.高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色
谱柱，必须对载液加高压。
2.高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析
一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
3.高效：分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精
馏塔和气相色谱的分离效高出许多倍。
4.高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。
5.应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是
高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
6.柱子可反复使用。
以上特点使HPLC成为一种极其重要的分离和分析方法，对于大量复杂样品的分析和分离具有显著的优势。
hplc的注意事项
HPLC，即高效液相色谱法，是一种在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着广泛应用的技术。
在使用HPLC进行实验时，需要注意以下事项：流动相的纯度：流动相必须是高纯度的，以保证色谱柱和检测器的性能。
如果流动相中含有杂质，可能会堵塞色谱柱，影响分离效果。
流动相的脱气：流动相在使用前需要进行脱气处理，以避免在实验过程中产生气泡，干扰实验结果。
样品处理：对于复杂的样品，需要进行适当的预处理，如提取、浓缩、纯化等，以去除干扰物质，提高分离效果。
色谱柱的清洗和维护：色谱柱是HPLC的核心部件，需要定期清洗和维护，以保证其性能和使用寿命。
检测器的选择：根据实验需求选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等。
实验条件的选择：根据实验需求选择合适的实验条件，如流速、流动相组成、柱温等。
数据的记录和处理：实验过程中需要记录详细的实验数据，并采用适当的软件进行数据处理和分析。
总之，使用HPLC进行实验需要注意细节，严格遵守实验操作规程，以保证实验结果的准确性和可靠性。
hplc工作原理
hplc工作原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术，通过溶液中物质分子
之间的分配和相互作用来实现成分的分离。
HPLC的工作原理
如下：
1. 液相：
HPLC使用液相作为移动相，通常是溶解在溶剂中的样品溶液。
液相必须满足一定的要求，如流动性好、化学稳定性高、与样品充分溶解等。
2. 固定相：
HPLC中的固定相通常是一种固体填料，填充在柱子中。
填料
的性质决定了分离的效果和速度。
常用的填料有C18疏水相、氢氧化铝等。
3. 注射：
样品溶液经过稀释、过滤等预处理后，用注射器将准确的样品注入到HPLC装置中。
注射器通常设有自动进样器，使得样
品的注入过程更加准确和稳定。
4. 色谱柱：
色谱柱是HPLC系统中最重要的组成部分。
样品在色谱柱中
与固定相发生相互作用，不同组分的分配系数不同，从而实现分离。
色谱柱可以通过调整填料的性质来控制分离效果。
5. 产物检测：
HPLC系统通常设有检测器，用于检测柱前和柱后流出液中的
化合物。
常用的检测器有紫外-可见吸收检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器将信号转化为电信号，通过电子积分器测定分离物质的峰面积和峰高。
6. 数据处理：
HPLC系统通过计算机控制和数据处理软件进行数据获取和处理。
常用的数据处理方法有峰面积计算、峰高计算、保留时间计算等。
通过上述步骤，HPLC可以实现对复杂样品中各种成分的分离
和定量分析。
高效液相色谱法的基本原理
高效液相色谱法的基本原理
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，
简称HPLC）是一种以液相为工作介质的色谱分析技术。
其基
本原理包括以下几个方面：
1. 选择合适的固定相：HPLC中的固定相多数是疏水材料，常
见的包括疏水性化合物、正相材料和离子交换树脂等。
固定相的选择要根据待分离物的性质和目标进行，以实现分离的目的。
2. 样品的进样：待分离的样品通过自动进样器进入HPLC系统，通常通过注射器来确保精确的进样量。
3. 流动相的选择：流动相是在HPLC柱中进行分离的介质，
包括溶剂和缓冲溶液，可以根据实验要求选择不同的组合。
常见的流动相如水、有机溶剂、酸、碱等。
4. 柱子的选择：HPLC中的柱子一般由不同材质制成，如不锈钢、硅胶、聚合物等。
根据待分离物的性质和目标，选择合适的柱子进行分离。
5. 进行分离：样品进入柱子后，固定相将会提供分离作用，不同组分会按照其相互作用力的大小而在柱子中发生分离。
分离的时间取决于各组分与固定相之间的相互作用力。
6. 检测和分析：通过检测器对分离出的组分进行检测，一般使用紫外光谱、荧光检测器等进行定量分析，从而得到各组分的峰高、峰面积等信息。
7. 数据处理和解释：对检测到的数据进行处理和解释，包括峰识别、峰面积计算、定量分析等。
总之，高效液相色谱法的基本原理是利用液相中溶质与固定相之间的相互作用力的差异来实现样品的分离和定量分析。
高效液相色谱法原理
高效液相色谱法原理高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物化学、药学等领域的分析技术。
它通过将待测物溶解在流动相中，在固定填料上进行分离和测定，具有分离效率高、分析速度快、分析灵敏度高等优点。
下面我们将详细介绍高效液相色谱法的原理。
首先，高效液相色谱法的原理是基于样品在流动相和固定相之间的分配行为。
流动相是一种溶剂，它可以将待测物溶解并带动其在固定填料上移动。
而固定填料则是一种多孔的固体颗粒，通常是以硅胶或聚合物为基础材料制成。
当样品溶液通过固定填料时，不同成分会因为在流动相和固定相之间的分配系数不同而发生分离。
其次，高效液相色谱法的分离原理主要包括吸附、分配、离子交换、排阻等几种机制。
其中，吸附是最常见的分离机制，它是指待测物与固定填料表面之间的相互作用。
分配则是指待测物在流动相和固定相之间的分配行为，不同成分的分配系数不同，因此会导致它们在固定填料上的停留时间不同而发生分离。
离子交换是指待测物中带电离子与固定填料表面带相反电荷的基团之间的吸附作用。
排阻则是指待测物在固定填料孔隙中的分布行为，分子尺寸较大的成分会在孔隙中停留的时间较长，而分子尺寸较小的成分则会较快地通过孔隙而分离。
最后，高效液相色谱法的检测原理是利用检测器对分离后的成分进行检测和定量。
常见的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
这些检测器能够根据不同成分的特性进行检测，并将检测信号转化为电信号输出，从而实现对待测物的定量分析。
在实际应用中，高效液相色谱法具有操作简便、分析速度快、分离效率高、灵敏度好等优点，因此被广泛应用于食品安全、环境监测、药物分析等领域。
同时，随着仪器技术的不断发展和完善，高效液相色谱法在分析领域的应用范围也在不断扩大，为科学研究和工业生产提供了强大的分析手段。
总之，高效液相色谱法的原理是基于样品在流动相和固定相之间的分配行为，通过不同成分之间的分配系数不同而实现分离。
同时，检测器对分离后的成分进行检测和定量，从而实现对待测物的分析。
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高效液相色谱法(HPLC) 一．概述 色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1． HPLC的特点 （1）适用范围广 已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。 （3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。 （5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。 2．HPLC分类 按分离机理分为四类：
PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.pdffactory.com 吸附色谱（液固）： 通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱： 不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱： 以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。用于分离无机或有机离子。固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱： 按物质分子量大小进行分离。不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。它又分为用于非水体系的凝胶渗透色谱（GPC），用于高聚物分子量及其分布的测定。又有适于分离和表征水溶性高聚物的凝胶过滤色谱。分子排阻色谱主要用于生物化学和高分子化学，在有机化学中应用也日益增多，已成为HPLC的一个重要分支。
上述四种是HPLC的重要分支，各有不同分离机理和应用领域，各有独到之处。
3． 气相色谱的基本理论对HPLC的发展起了指导和推动作用，并自然延伸到液相色谱。
二．液相色谱仪 HPLC流程 现代HPLC按用途分为分析型、制备型、专用型（GPC），其基本部件相同。HPLC仪由输液系统，进样系统，柱系统、检测和记录系统组成。高压泵，色谱柱和检测器为三大关键部件。
4． 溶剂贮存器和溶剂脱气
PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.pdffactory.com（1） 简单的贮液器为500ml 试剂瓶，盖严，防溶剂挥发，瓶内泵吸液管端装10ul不锈钢烧结滤头过滤溶剂。溶剂应预先过滤。
（2）流动相脱气 流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂。否则过柱以后，压力降低放出溶解的空气。气泡将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。
脱气法：微型真空泵在线脱气，适于单一溶剂（如GPC）。吹He脱气，如He脱气机在线脱气。超声波脱气等。
5． 输液系统一高压泵 色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输液。泵为关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。
要求：A 输出压力高：一般为150~300kg/cm2压力，最高达500 kg/cm2. B 流量范围宽：0.1~10ml/min 连续可调 C 流量稳定: 流量恒定无脉冲,流量精度及重现性为+/- 0.5% 左右。
D 耐腐蚀： 耐各种有机溶剂、水和缓冲溶液。 E 密封性好： 泵室小便于清洗维修。 泵分为两类：恒流泵：柱阻力变化，流动相粘度变化，引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。恒压泵：流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，如装柱用的气动泵。HPLC广泛采用往复柱塞泵，由液缸，柱塞，单向阀和驱动机构组成。密封圈耐磨（PTF-石墨）单向阀，柱塞为人造红宝石。
泵流量不稳使保留变化，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大，最小检测量变大。
双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/- 0.1% ，流量准确度+/-
1% 。
双柱塞泵液缸容积很小（几微升~几百微升）适于梯度洗脱。 为提供无脉动的准确流量，在输液系统中还需加一些辅助设备：过滤器、混合器、阻尼器，测压装置。多元混合溶剂 需用比例阀，如二元、三元和四元比例阀。溶剂按预定比例，低压混合后，经高压泵输入系统。
PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.pdffactory.com6． 进样系统 HPLC采用六通阀进样，重现性好，操作方便，易于自动化，大大提高了分析精度。
注射器进样：绝对误差在5%左右，相对误差在1%。 阀进样：误差均在1%以内。进样量由定体积定量管和平头微量注射器控制，注射器体积应为定量管体积的2~3倍。HPLC柱可注入较大体积的稀溶液，进样体积在10~250ul。
7． 色谱柱 HPLC发展与柱技术的突破是分不开发。色谱柱是色谱仪的心脏，靠它实现分离。
柱要求：分离效率高，柱容量大，分析速度快。 色谱柱由柱管、凝胶填料、密封环、过滤板等部件组成。色谱柱要耐高压，耐腐蚀，抗氧化密封不漏液，柱内死体积小。对填料质量和装柱技术有严格要求。每根柱都附有测试谱图、色谱条件和柱效、对称因子等数据，供用户判断柱质量。
色谱柱均用指定溶剂充满，防干裂和空气氧化，因而应定期用指定溶剂冲洗。分析后，不能马上关机，应继续冲洗一段时间，保持柱内清洁。调流速时，逐渐增减柱压，压力陡然升降，易使柱内形成沟槽损坏。
保护柱：在分析柱入口端加5~50mm与分析柱固定相相同的短柱，吸留过滤流动相及样品中的有害组分，可经常更换，起到保护延长分析柱的作用，加保护柱虽然柱效有所损失，但在经济和实用方面是有益的。
8． HPLC检测器 连续地将柱中流出组分的含量随时间的变化，转变为易于测量的电信号记录为样品组分的分离谱图，进行定性定量分析。
在液相状态，流动相和样品的许多物理性质十分接近，找到既通用又灵敏的检测器是困难的。相对GC而言，HPLC检测器是有待进一步发展的薄弱环节。对检测器的要求：灵敏度高；对所有组分响应；线性范围宽，响应快；不易被溶剂腐蚀；死体积小，对流速，温度不敏感；操作方便。
通用型检测器：测定流出物（溶质+溶剂）某种整体参数的变化，如折射率，电导率，介电常数等。
示差折光检测器（RID）：通过连续测定流出液折光指数变化来测定样品
PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.pdffactory.com浓度 ，检测器灵敏度与溶剂和溶质性质都有关系。 响应信号：R=Z Ci ( n I- n o ) z：仪器常数，Ci溶质摩尔百分数，n I 溶质折射率，n o 溶剂折射率
响应值与溶质浓度成正比，为浓度型检测器，响应值与溶质与溶剂间折光指数差( n I- n o )成正比；只要n I与n o 有足够差，即可检测，所以为通用检测器。对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物，糖类，脂肪烷烃等都能检测，是GPC必不可少的检测器。
RID缺点： A 灵敏度低，为5 x 10-7 检测限：0.5ug/ml ; 比UVD低2-3个数量级 B 对流量和温度变化敏感。应严格控制，保持基线稳定，并带自动调零及自动冲洗检测池装置。为保持流量稳定对泵的流量稳定性有很高要求。RID带有恒温装置保持恒温，基于以上两点，RID仅用于常规分析也不能用于梯度洗脱。
（2） 选择性检测器：只对某些被测样品或组分响应灵敏，而对流动相响应甚小。如紫外、荧光和电化学检测器。
紫外（UV）检测器：几乎所有LC仪都配备。 用于检测能吸收紫外光的物质，选用工作波长无紫外吸收的溶剂作流动相。 工作原理：适用朗伯-比耳定律 A= ΣCL A：摩尔消光值 Σ：摩尔吸收系数 C：溶液摩尔浓度 L：光程长度 UV吸收与浓度成正比为浓度型检测器。 可变波长紫外检测器： 按照被测试样品的紫外吸收特性任意选择工作波长，以提高仪器的选择性。
其优点：
（1） 可以选择样品的最大吸收波长作为检测波长，提高检测灵敏度。 PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.pdffactory.com