发酵液中谷胱甘肽含量测定方法的比较
GSH含量的测定.doc
主要目的：——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。
主要原理：参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG），由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。
用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。
实验室签章一、试剂——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）二、仪器设备—— 96 孔酶标板—— UV-Vis 可见多功能酶标仪——旋涡混匀器——离心机——移液枪及其相应量程枪头三、实验方法根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。
2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂二、试剂三、 mL 试剂四。
3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。
4.血清中 GSH含量计算公式GSH含量（ mg/L）测定 OD值 -空白 OD值-3 mmol/L）×标准品浓度（ 20×10标准 OD值-空白 OD值×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数组织中 GSH含量公式测定OD值-空白OD值-3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L）×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度（gprot/L ）参考文献Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.。
嗜热栖热菌发酵液延缓衰老及促进修复功效评价研究
SUBJECT R ESE AR C H丨学科研究嗜热栖热菌发酵液延缓衰老及促进修复功效评价研究嗜热栖热菌具有促进细胞生长、延缓衰老、阻抗日光对皮肤的损害和修复皮肤的能力。
本文采用高温发酵制备嗜热栖热菌发酵液（Thermus thermophilus fermentation broth)，从细胞层面对其安全性、延缓衰老、防晒和创伤修复能力进行评价。
结果表明，积分数<10%的嗜热栖热菌发酵液对人永生化表皮细胞（HAC AT)和人皮肤成纤维细胞（H SF)都是安全无毒的，并具有促进细胞增殖的作用；UVB光紫外照射损伤修复模型中，体积分数为1 %〜10 %的嗜热栖热菌发酵液均有较强的防晒能力和促进细胞生长能力，且具有延缓细胞衰老的功效；在细胞创伤修复模型中，体积分数为1 %~ 10 %的嗜热栖热菌发酵液具有不同程度的创伤修复能力。
上述结果表明嗜热栖热菌发酵液安全无毒，并具有一定的延缓衰老、防晒和创伤修复功效。
文/郑雅方颜贵卉姚雨辰章鹏坤编辑/姚丽China Cosmetic's Rev嗜热栖热菌中较为独特的“生长因子”以核酸、维生素 A、维生素B2、烟酰胺、P类胡萝卜素、谷胱甘肽、聚多氨（多聚氨基酸）等为主要成分，近年来，研究发现其还含有烟酰 胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide)等延缓衰老 的活性物质。
核酸是细胞代谢的必需物质，有助于表皮细胞 基因的营养及其损伤的修复，对皮肤进行深层滋润，使皮肤 柔软。
维生素、谷胱甘肽、多聚氨为细胞生长因子，能够恢复 和促进细胞生理机能，在慢性、非治疗伤口（如糖尿病溃疡 的伤口）修复时能够促进细胞生长，还可以减轻皮肤炎症反 应和抵抗日光的损害。
耐热活性酶使嗜热栖热菌在高温条 件下仍具备超强的D N A保护与修复能力。
利用该耐热特性，K.B.Mullis将嗜热菌中的t a q D N A聚合酶应用开发了多聚酶 链式反应,获得了 1993年的诺贝尔奖，基因工程研究也因此 技术得以飞速发展141。
土壤谷胱甘肽测定
土壤谷胱甘肽测定
土壤谷胱甘肽测定是一种分析土壤中谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的方法。
谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，对于维持土壤中微生物代谢活性和土壤生态系统的稳定具有重要作用。
谷胱甘肽测定可以通过不同的方法进行，常用的方法包括光谱法、显色法和高效液相色谱法等。
光谱法是一种简便快捷的方法，通过分析土壤中谷胱甘肽的光吸收特性来测定其含量。
在特定波长下，谷胱甘肽分子会吸收一定量的光线，通过测量吸收光的强度可以间接测定谷胱甘肽的含量。
显色法是一种常用的定性定量方法，通过化学反应使谷胱甘肽与某些试剂形成可见色素，然后通过比色测定色素的强度来判断谷胱甘肽的含量。
高效液相色谱法是一种精确和灵敏度高的测定方法，通过将土壤中的谷胱甘肽提取出来，并使用高效液相色谱仪进行分离和定量分析。
这种方法可以准确测定谷胱甘肽的含量，并且可以同时测定土壤中其他相关成分的含量。
土壤谷胱甘肽测定可以帮助研究者了解土壤中谷胱甘肽的含量和变化情况，进而评估土壤的养分供应能力、抗氧化能力以及土壤生态系统的稳定性。
这对于土壤质量评估、环境保护和农业可持续发展具有重要意义。
一种谷胱甘肽的检测方法
一种谷胱甘肽的检测方法嘿，小伙伴们！今天咱们来聊聊谷胱甘肽的检测方法，这就像是一场探秘之旅呢。
谷胱甘肽这个小家伙，就像是隐藏在细胞里的神秘小精灵。
要检测它呀，有一种高效液相色谱法。
想象一下，这个检测过程就像是一场超级精准的选美比赛。
那些流动相就像是带着选手（谷胱甘肽）前进的传送带，而固定相呢，就像是舞台，谷胱甘肽在这个舞台上展示自己独特的“姿态”，通过柱子的时候，就像模特走T台一样，被精确地识别和测量。
还有一种酶循环法。
这可有趣啦，酶就像是一群勤劳的小工匠。
谷胱甘肽就像是一块特殊的原料，小工匠们围绕着它忙个不停，通过一系列神奇的反应，把谷胱甘肽的含量给巧妙地反映出来。
这个过程就像是一群小精灵在魔法工坊里，把一块神奇的宝石（谷胱甘肽）的光芒一点点放大，让我们能看清楚它到底有多少。
比色法也能用来检测谷胱甘肽呢。
这就好比是一场色彩大比拼。
谷胱甘肽像是一位带着特殊色彩密码的小画家。
当它和特定的试剂混合后，就会产生独特的颜色变化，就像小画家在画布上挥动画笔，从无色变成有色，颜色的深浅就直接告诉我们谷胱甘肽的含量多少啦。
这颜色的变化夸张点说，就像是魔法棒一挥，从黑暗瞬间变成五彩斑斓。
电化学检测法也不甘示弱。
可以把检测电极想象成超级敏锐的小耳朵，谷胱甘肽呢，就像是在悄悄说话的小虫子。
当谷胱甘肽靠近电极这个小耳朵时，就会产生微弱的电流信号，这信号就像小虫子发出的独特叫声，通过检测这个信号的大小，就能知道谷胱甘肽的量啦。
荧光分析法也能派上用场。
谷胱甘肽就像是一颗隐藏在黑暗中的荧光宝石。
当特定的荧光试剂和它结合后，就会像黑夜里点亮了一盏明灯，发出耀眼的荧光。
这荧光的强度就像宝石的光芒强弱，准确地反映出谷胱甘肽的含量。
质谱法就更酷啦。
把谷胱甘肽分子想象成一群有着独特身份标识的小外星人。
质谱仪就像一个超级外星识别器，把谷胱甘肽分子打得粉碎，然后根据它们碎片的特征来识别和确定谷胱甘肽的存在和数量。
这过程就像是把小外星人拆开来研究它们的构造一样神奇。
酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究
实验号
１ ２ ３ ４
表 ２ 正交实验结果
Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｄ 含量（％）
１
１
１
１
０．４３
１
２
２
２
１．６４
１
３
３
３
１．４５
２
１
２
３
２．０１
—１７—
发酵科技通讯
第 ３７ 卷
５
２
２
３
１
１．３８
６
２
３
１
２
１．０４
７
３
１
３
２
１．２５
８
３
２
２
３
１．８３
９
３
３
１
１
０．９８
Ｋ１
３．５２ ３．６９ ２．４５ ２．７８
Ｋ２
４．４３ ４．８５ ５．４８ ４．５１
由 图 ３ 可 见 ＧＳＨ 对 照 品 的 出 峰 时 间 为 １２．９８ｍｉｎ。将图 ４ 与图 ５ 进行比较可以看出， 热水
—１８—
提取所得样品谱图中含有许多其他组分， 表明杂 质含量较多， 样品 ＧＳＨ 纯度为 １３．５６％， 而乙醇提 取所得样品谱图中部分组分峰面积减小， 甚至已 经不存在， 表明杂质含量减少， 样品 ＧＳＨ 纯度为 １９．８６％。测定结果表明， 乙醇提取法所得样品蛋 白质、核酸、色素等杂质溶出量少， 纯度较高， 从而 减少了后续分离纯化的工作量。
图 ２ 料液比对热水提取 ＧＳＨ 的影响
由图 ２ 可看出， 随着加水量的增加， 浸出的 ＧＳＨ 含量提高， 加水 ４ 倍体积时， 提取 ＧＳＨ 含量 达 １．８６５％， 随加水量的增加， ＧＳＨ 含量无明显提 高， 考虑到加水量过高会延长上清液浓缩时间， 加 大不必要的工作量， 故加水量选取为 １：４。 ２．２ 乙醇提取
谷胱甘肽的简便测定法
谷胱甘肽的简便测定法药物分析杂志 2000年第1期第20卷研究简报作者：赵旭东魏东芝万群俞俊棠单位：赵旭东魏东芝万群俞俊棠（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237）关键词：谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB 摘要：目的：建立一种快速简便测定谷胱甘肽的新方法。
方法：样品1式2份，pH 8.0条件下分别和甲醛反应2 min和60 min，各取1 mL加入5 mL DTNB溶液，25 ℃反应5 min后分别测定在波长412 nm的吸光度，算出2者的差值ΔA，代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。
结果：谷胱甘肽浓度在0.19～0.95 g·L-1之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，最大误差不超过6%。
结论：方法成本低廉，简单易行，特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析。
A Simple Method for Rapid Determination of ReducedGlutathioneZhao Xudong Wei Dongzhi Wan Qun Yu Juntang （State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Biochemistry,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237）Abstract：Objective：A new simple method for rapid determination of reduced glutathione in the presence of other thiols is developed based on the reactions of formaldehyde with glutathione and interefering substances.Method:After each aliquot of two same samples reacts with formaldehyde for 2 and 60 min respectively, 1 mL of each solution is added to 5 mL DTNB and reacts for 5 min at 25 ℃. The absorbance is measured immediately at wavelength 412 nm. The difference between two absorbance(ΔA=A2 min-A60 min)is calculated, concentration of glutathione can be obtained from standard curve.Result:There is a good linearity between 0.19 to 0.95 g·L-1 glutathione. Regression equation:Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，maximum deviation is less than 6%.Conclusion:The method is cheap, simple, practicable and is applicable to assay of reduced glutathione in the presence of other interefering substances.Key words：glutathione, formaldehyde, cysteine, DTNB▲谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸组成的天然三肽，用途广泛。
谷胱甘肽的应用和酶法生产谷胱甘肽的研究进展
收稿日期:2005-03-04;修订日期:2005-05-17作者简介:段学辉(1958-),男,江西南昌人,1998年华东理工大学生物化工专业博士毕业。
第23卷 第6期2005年12月江 西 科 学J I A NGX I SC I ENCEVol .23No .6Dec .2005 文章编号:1001-3679(2005)06-0750-04谷胱甘肽的应用和酶法生产谷胱甘肽的研究进展段学辉,谢雷波,王 锦(南昌大学生命科学学院教育部食品科学重点实验室,江西南昌 330047)摘要:谷胱甘肽是一种重要的生物活性物质,在医药、食品和化妆品等领域有重要的应用。
简单介绍了酶法生产谷胱甘肽的研究进展和发展前景。
关键词:谷胱甘肽;应用;研究进展中图分类号:Q516;Q81 文献标识码:AAppli ca ti on of Glut a th i one and the Study Progressof Glut a th i one by Enzy ma ti c M ethodDUAN Xue -hui ,X I E Lei -bo,WANG J in(Educati on M instry Key Laborat ory of Food Sicience,School of L ife Science,Nanchang University,J iangxi Nanchang 330047PRC )Abstract:Glutathi one is an i m portant bi ol ogical active substances ,which is significantly app lied in phar macy 、f ood and cos metic etc .The study p r ogress of Glutathi one by enzy matic method and devel 2opment p r os pect of Glutathi one were intr oduced.Key words:Glutathi on,App licati on,Study p r ogress 动植物细胞中都含有一种三肽,称还原型谷胱甘肽(reduced glutathi one ),即γ-谷酰半胱氨酰苷氨酸,因为它含有游离的-SH 基,所以常用GSH 来表示。
谷胱甘肽化学与酶法合成
谷胱甘肽化学法和酶法合成1 化学性质谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）分子式为C10H17N3O6S，分子量为307.32348，熔点为189~193℃，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为5.93。
GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型GSH占绝大多数。
谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。
该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。
图1 GSH的结构式2 药理作用GSH可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。
3 谷胱甘肽的生产方法1888年，GSH首先从酵母中分离出来。
日本1983年进行了含量较多的GSH 酵母的生产，其后又研究了GSH提取、分离技术及分析检测方法。
目前国外实现了GSH规模生产。
世界主要的氨基酸制造商Kyowa，Aji-nomoto和Degussa 等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa 1998年氨基酸的研究与开发就耗费达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供应商。
目前GSH的主要生产方法有：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。
3.1萃取法萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从GSH含量比较高的动植物组织中将GSH分离提取的一种方法，GSH的早期生产都是采用萃取法，是生产GSH的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。
其工艺路线如下图：图2 GSH发酵法工艺路线图该方法的不足：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。
3.2酶法在酶催化合成GSH中，几种关键的化合物和条件包括：GS HⅠ和GS HⅡ、氨基酸原料(L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸)、ATP、保持GS HⅠ和GSHⅡ活性所必需的辅因子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。
谷胱甘肽
二、对人体的功能
在机体内的转运与代谢
谷胱甘肽在小肠内可以被 完全吸收，它能维持红细 胞膜的完整性，对需要巯 基的酶有保护和恢复活性 的功能，它是多种酶的辅 酶或辅基，可以参与氨基 酸的吸收及转运，参与高 铁血红蛋白的还原作用及 促进铁的吸收！
G6PDH：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，GPx：谷胱甘肽过氧化物酶，GR： 谷胱甘肽还原酶，GRX：谷氧还蛋白，GSHI：γ -谷氨酰半胱氨酸合成 酶，GSHII：谷氨酰胺合成酶，GTP：谷氨酰转肽酶。
与Vc联用
维生素C也是体内一种重要的抗氧化剂。由于维生素C能可逆地加氢或 脱氢，故维生素C在体内许多氧化还原反应中有重要作用。例如，许多 酶的活性基团是巯基（-SH），维生素C能够维持-SH处于还原状态而 保持酶的活性；维生素C可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽 （GSH），使机体代谢产生的过氧化氢（H2O2）还原；维生素C还可 保护维生素A、E及某些B族维生素免受氧化。因此，运用谷胱甘肽时， 与维生素C并用，能够提高其功效。
药品
1、药理作用：该品可促进糖、脂肪及 蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护 肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。 2、保肝作用：由于谷胱甘肽本身的解 毒和抗氧化能力，使得谷胱甘肽具有 重要的保肝护肝作用。临床上应用还 原型谷胱甘肽作为保肝的重要药物成 分。 3、临床应用：适用于脂肪肝、中毒和 病毒性肝炎等辅助治疗。
4 存在形式 ：谷胱甘肽有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-SG）两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占 绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该 酶的辅酶 为磷酸戊糖旁路代谢提供的NADPH。
用途与作用
1 食品：谷胱甘肽可作为功能性食品的基料，广泛应用在延 。 缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品。具有 。 独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。 4 其他：能帮助保持正常的免疫系统的功能，能参与生物转 化作用，从而把机体内有害物质转化为无害物质， 排泄出体外。具有抗氧化作用。巯基是半胱氨酸上 的活性集团，易与某些药物（如扑热息痛）、毒素 （如自由基等）等结合，从而具有整合解毒作用。
还原型谷胱甘肽课件
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3.还原型谷胱甘肽的应用及市场前景
谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓 衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。
一上的应用
三 食品中的应用
GSH的应用
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四 化妆品中的应用.
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还原型谷胱甘肽在临床药物上的应用
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还原型谷胱甘肽的市场前景
1.国产谷胱甘肽占主导地位
还原型谷胱甘肽（GSH）于1995年由日本协和发酵株式会社与日本山之 内株式会社研制成功并上市。1999年，重庆药友制药的粉针制剂在国内获批生 产，随后，昆明积大制药、山东绿叶制药的还原型谷胱甘肽注射剂先后上市。 至2011年5月，国内已有26张生产批文，全部为制剂，谷胱甘肽进口注册批文 共有12张，。
和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空
气中则易被氧化。
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GSH的生物合成途经及代谢调控
合成途径是在γ— 谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。 L—谷氨酸，L —半胱氨酸在 γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，GSH Ⅰ） 的作用下合成 γ—谷氨酸半胱氨酸(γ-glutamylcysteine，γ一ECG)，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，GSHⅡ)的作用下与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。
萃取法主要是从高含量谷胱甘肽的动植物组织中提 取所采用的一种方法,它是发酵法生产流程中的下游 过程基础。可以从鼠血、鼠肝和鸡血、酵母、麦芽 中提取GSH,但以酵母作原料居多。萃取法生产GSH 所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等。但 由于原料不易获得且GSH 的含量极低，因此该法的 实际应用价值不大。