液相色谱法分析
液相色谱方法学验证
液相色谱方法学验证
液相色谱方法学验证（Liquid chromatography method validation）是指通过一系列实验和数据分析，对液相色谱方法进行验证，以保证该方法能够获得可靠和准确的结果。
液相色谱方法学验证是药物分析、环境监测等领域中常用的分析方法验证方法。
液相色谱方法学验证通常包括以下方面：
1. 精密度（Precision）：通过重复测定相同样品，计算测定结
果的变动程度，评估测定方法的精密度。
2. 准确度（Accuracy）：通过添加已知浓度的标准品进行测定，与标准品浓度进行比较，评估测定方法的准确性。
3. 线性范围（Linearity）：通过分析不同浓度的标准品，绘制
出样品浓度与峰面积或峰高的线性关系曲线，评估测定方法的线性范围。
4. 选定的特异性（Selectivity）：检查方法中其他组分对分析
目标的干扰程度，评估测定方法的特异性。
5. 检测限（Detection limit）：测定方法中能够可靠检测到目
标分析物的最低浓度。
6. 定量限（Quantitation limit）：测定方法中能够定量测定目
标物质的最低浓度。
7. 精确度（Accuracy）：通过测定不同样品的回收率，评估测定方法的精确度。
8. 系统适用性（System suitability）：通过检查色谱柱效率、峰对称性、峰分离度等参数，评估测定方法的适用性。
液相色谱方法学验证是保证分析方法可靠性的重要步骤，验证结果需要符合相关的验证指南和标准要求。
液相色谱简介（反相）
高效液相色谱法（反相液相色谱）一、液相色谱法方法的分类和选择1、方法的分类：根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。
两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。
正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。
实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。
反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。
通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。
流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。
在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。
它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。
在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。
在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。
正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。
2、方法的选择：HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。
一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。
相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。
如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。
高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
（2）定量分析（ESTD法）： 用高效液相色谱法测定未知样品中的苯甲酸含量，将 已配置浓度不同的苯甲酸标准溶液也进入色谱系统，绘制 浓度——峰面积的标准曲线。如流速和泵的压力在整个实 验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间 （ T0或保留距离）和峰面积A后，可直接用 T0 定性，用峰 面积作为定量测定的参数，注入未知样品后，得知未知样 品的峰面积，查标准曲线，求出未知样中的苯甲酸的含量 。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
液相色谱检测方法
液相色谱检测方法液相色谱检测方法是一种采用液相色谱原理来快速准确地分析或检测物体物质成分的方法，它可以彻底检测出细微物质，为分析物质提供详细的分子结构等重要信息，在医药、环境保护、生物科学、石油化工等领域有广泛的应用，为科学家们提供了一种快速准确的分析技术。
液相色谱技术的基本原理是利用液相或混合液相的单体或多体（混合物）的分子组成，将混合液相物质中的混合物分离、检测。
当某种化学物质从液态中发射，接收装置就可以获得这些物质的信息，从而得到它们的成分分布情况。
液相色谱检测方法根据分子结构及其所含成分的不同，将检测结果表示为不同的“香调”，并用相应颜色显示出来，这种多种颜色混合在一起构成了检测中特有的色谱图。
液相色谱检测方法通常可以分为三个步骤：样品预处理、样品测试和结果分析。
第一步是对样品进行预处理，一般是将样品分离成不同部分，使其便于进行分析，常用的预处理方法有离心分离、过滤和萃取等。
第二步是将预处理好的样品放置在液相色谱仪中，启动液相色谱仪，进行检测。
第三步是对检测结果进行分析，根据检测结果，对样品进行更为细致的分析，得出样品的组成成份及具体含量等结果。
液相色谱检测方法在实际应用中的限制主要是由于它的高成本及复杂的检测过程，需要经过大量的准备工作才能完成，并且需要花费大量的时间才能获得满意的结果。
此外，液相色谱检测的灵敏度受到检测温度、检测压力等因素的限制，一般在常温常压条件下，它的灵敏度有限。
总之，液相色谱检测方法是一种采用液相色谱原理来快速准确地分析或检测物体物质成分的一种技术，它有助于我们更全面地了解物质的组成，但是，由于它检测的复杂性、耗时长和结果受外部条件影响大等原因，要想更好地运用这一技术，尚需要努力和改进。
中国药典版--高效液相色谱法
现象3：基线漂移
判断————————————------------------排除方法 （1）溶剂贮槽污染---------------（1） 清洗贮槽装入新的流动相冲洗柱子 （2）前次分离样品中的强吸附组分 从柱上洗脱-------（2）在分离之前用强 流动相从柱中洗脱所有的组分：使用溶 剂梯度清洗柱子 （3）由微粒造成柱入口、进样阀、 柱入口的部分堵塞--（3）清洗进样系统 和柱入口过滤片
色谱条件与系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用 性试验，即用规定的对照品对仪器进 行试验和调整，应达到规定的要求； 或规定分析状态下色谱柱的最小理论 板数、分离度、重复性和拖尾因子。
（1） 色谱柱的理论板数
色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入 供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液， 记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰 的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应 取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按 n=5.54(tR／Wh/2)<2>计算色谱柱的理论板数， 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长， 载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板 数达到要求。
6最低检测限的意义 最低检测限虽然是个绝对值，但其真正 意义确是相对值，即相对于供試品溶液 的中样品浓度的多少而言，，设定杂质 总量不得过1.0％。最低检出限通常许达 到对照溶液浓度的十分之一到五十分之 一。 7使用对照品外标一点法测定时的关键是 什么 使用对照品外标一点法测定时的关键是 尽量保持样品溶液和对照品溶液的浓度 一致。
（4）泵中有气泡，泵压不稳-----------（4） 赶除聚集于泵头内的气泡 （5）溶剂纯度不高，背景吸收强，透 光差------ -------- -------- （5）提纯溶剂或 选纯度比较高、透光性好的溶剂作为流动 相 （6）检测池污染-------------（6）清洗检 测池 （7）示差折光检测器液槽漏 --------（7）检修或更换液槽
液相色谱法知识点详解
2.纸色谱法（paper chromatography）
纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体， 把试样点在滤纸上， 然后用溶剂展开，各 组分在滤纸的不同位 置以斑点形式显现， 根据滤纸上斑点位置 及大小进行定性和定 量分析。
1.吸附色谱法 ( adsorption chromatography )
利用吸附剂表面对不同组分物理吸附 性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附 色谱法。
2.分配色谱法 ( partition chromatography )
利用固定液对不同组分分配性能的差别 而使之分离的色谱法称为分配色谱法。
§2 气相色谱的基本理论
容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质
，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相
及固定相的体积有关。 分配系数比(α):
k K Vs Vm
K2 k2 t'R2
K1 k1 t'R1
t’R2≠t’R1是混合物分离的首要条件
小结：
（1）色谱条件一定时，K或k值越大 ，则组分的保留值也越大。
（2） 两个组分的K或 k值相等，
基线宽度Wb=4
色谱流出曲线的意义
由色谱流出曲线可以实现以下目的：
（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中 所含组分的最少个数。
（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。 （3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分
析。
（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色 谱柱的分离效能。
7、分配系数和容量因子
1. 分配系数（distribution coefficient）
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析方法，它基于样品在液相中的分配
行为以及在固定相上的吸附和解吸行为。
它能够对样品中的物质进行分离、定量和定性分析。
高效液相色谱的原理如下：
1. 选择性分离：高效液相色谱中，样品混合物被注入装有固定相（柱填充物）的色谱柱中。
不同物质在柱填充物上的吸附和解吸速度不同，因此可以通过调整流动相的组成、温度和流速等参数来实现对样品中物质的选择性分离。
2. 吸附-解吸过程：在高效液相色谱中，样品溶解于流动相中，与固定相表面发生相互作用。
这个过程涉及吸附和解吸，吸附过程发生在固定相表面，解吸过程发生在固定相表面和流动相中物质的分配行为。
通过控制流动相的性质和柱填充物的特性，可以实现对不同物质的选择性吸附和解吸。
3. 柱填充物：高效液相色谱柱的填充物通常是多孔性固体颗粒，如硅胶或石英。
填充物的选择与样品的性质和分离的目的有关。
柱填充物的粒径、孔径和表面性质将影响色谱分离的效果。
4. 检测器：高效液相色谱的结果通过检测器进行检测和记录。
常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等，根据待分析物的性质和浓度选择适当的检测器。
总之，高效液相色谱是利用样品在液相中的分配和在固定相上的吸附解吸过程进行分离和定量分析的方法。
通过调整柱填充物、流动相和检测器等参数，可以实现对样品中不同物质的选择性分离和定量测定。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱法定性定量分析
高效液相色谱法测定萘乙酸的含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定萘乙酸的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理将已配制的浓度不同的萘乙酸标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R和峰高A后，可直接用t R定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定未知浓度萘乙酸的含量。
三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。
2、色谱柱：Zorbax C8，5µm，250×4.6mm，20μL定样环。
3、流动相：H2O和CH3OH4、萘乙酸标准溶液：精密称取萘乙酸标准品制成浓度(mg/L)分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2、5、8、10、15、20 mg/L的对照品溶液，放入冰箱备用。
5、未知物萘乙酸6、平头微量注射器。
四、实验步骤1、开机(1) 检查流动相、废液瓶和色谱柱；(2) 打开打印机和计算机的电源；(3) 自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符）；(4) 打开工作站。
2、编辑方法(1) 选择“Method”菜单，然后“EDIT METHOD”依屏幕提示进入以下设定：(a）泵对话框：设定泵的流速：1.0mL/min；H2O和CH3OH线性梯度洗脱：H2O 0 min：10%；1 min：20%；3 min：30%；4 min：30%；(b）检测器对话框：设定波长337 nm。
(2) 单击“Method”菜单，选中“Save Method As…”，输入方法名，单击OK。
(3) 从“Run Control”菜单中选择“Sample Info…”选项，输入操作者名称，在“Data file”中选择“Manual”或“Prefix”。
(4) 单击Ok，等仪器Ready，基线平稳。