真核表达系统
原核、真核生物基因及表达调控
原核、真核生物基因及表达调控引言现代生物学中“基因”一词甚为流行，细胞学、遗传学、生物化学等，以及各种生物学课本中，都涉及到“基因”一词。
甚至象典型的宏观生物学科——生态学，也把一片森林称为一个“基因库”[1]。
现代生物学已经完全证明，DNA 分子是由称为核普酸的有机分子线性聚合而成。
基因就是核普酸按一定顺序排列而成的DNA分子片段，它携带着遗传信息。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
其实质就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中，生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）[2]。
原核生物和真核生物的基因及表达过程有着差异。
随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。
迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白[3]。
一．原核、真核生物基因结构原核生物基因分为编码区与非编码区，所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，非编码区位于编码区的上游及下游。
[4]在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
真核生物基因结构见图1：图1 真核生物基因结构二．原核、真核生物基因结构的区别最主要的在于真核基因是不连续的,而原核基因是连续的。
所谓真核基因的不连续，即一个基因的编码序列也叫外显子，被一个或多个非编码序列，又叫内含子所间隔。
[5]这些内含子和外显子同属一个转录单位，转录形成前体。
经过转录的加工，即切去内含子，重新连按外显子，从而得到成熟。
而绝大多数的原核基因是连续的，没有内含子的间隔，转录产生成熟。
不仅如此，而且凡在代谢途径上功能有关的多个基因可能紧密相联，与它们的调控基因一起组成一个操纵子，转录到一条链。
第六章抗体的表达
常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因T-24（+）和pET-23（+）
体
翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效
核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合
位点的目的基因
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His·Tag、 T7·Tag、S·Tag、GST·Tag、ompT、CBD S·Tag、 Thioredoxin、DsbA·Tag 、Trx·Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S·Tag、His·Tag、T7·Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。
11
一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也 主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。 理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
第六章抗体的表达
第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。 2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。 3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
2
3
要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。
大肠杆菌表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物表达系统酵母表达系统存在一些蛋白不能有效地折叠发酵周期较长容易污染需要考虑表达产物的卫生安全性筛选产物价格昂贵有时表达产物没有生物活性等问题都为临床生产和应用带来了不便也存在产物低表达或不表达的问题产物纯化问题依然存外源基因不能持久稳定地表达而且表达成本很高技术背景复杂存在不正确的糖基化修饰且表达量低原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成本低生产率高和能够大规模快速的生产等优点第二节原核表达系统原核表达是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达
【国家自然科学基金】_真核表达系统_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
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科研热词 真核表达 转染 基因表达 原核表达 克隆 高效表达 融合蛋白 自杀基因 杆状病毒 整合素β 1内化 抗菌肽 成纤维细胞 巴西橡胶树 基因治疗 启动子 t38a k+通道基因 icap1α i138a hbkco1 gitrl ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ齿 黑腹果蝇 高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术 颅盖骨 靶向治疗 靶向 间充质干细胞 长qt综合征2型 链球菌 铁效应元件 配体亲和力 遗传 过氧化物酶体 达卡巴嗪 载体构建nf-κ b 载体构建 转移 转录调控 转录激活作用 转录因子 转录 转导 计算机分析 表达策略 表达与纯化 表达 血管疾病 血管内皮生长因子 蜘蛛丝 蛋白质酪氨酸磷酸酶 药物拯救
蛋白质糖基化 1 蛋白质分泌 1 蛋白表达 1 蛋白相互作用 1 葡萄胎 1 葡萄糖激酶 1 葡萄球菌核酸酶 1 荧光素酶报告基因 1 草地贪夜蛾细胞 1 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 1 腺相关病毒载体 1 脑炎病毒 1 胸苷激酶/遗传学 1 胚胎干细胞 1 胆碱能抗炎通路 1 肿瘤坏死因子 1 肿瘤 1 肥胖 1 肝癌细胞bel-7405 1 聚合酶链反应 1 绿色荧光蛋白 1 细胞黏附 1 细胞系 1 细胞周期 1 细胞 1 红内期 1 系统性rna沉默 1 类泛素修饰分子 1 突变频谱 1 突变频率 1 突变体 1 突变 1 稳定转染 1 稳定细胞系 1 磷酸钙沉淀法 1 真核诱导表达 1 真核细胞筛选系统 1 白细胞介素4 1 白细胞介素-12 1 癌,肝细胞 1 癌 肝细胞 1 病毒非结构蛋白质类 1 生物发光成像 1 生物信息学 1 猪瘟病毒 1 牙釉质蛋白质类 1 点突变 1 炎症 1 激活剂 1 激光解吸附/电离飞行时间质谱技术 1 源水和氯化消毒饮用水有机提取物1 沉默途径 1 水稻条纹病毒 1 毕赤酵母 1
鱼类抗菌肽基因工程表达系统概述
ｂｏ 鉴定 ， ｌ ｔ 发现 目的蛋 白与预期蛋 白的分 子量相 吻合 ， 并能与特异抗 体 ａ ｔ ｉ ｎｈ ｉ ｓ特异性 结合 ， 明大菱 鲆抗 菌 表 肽 ｈｐｉｉ 因在酵母菌 中得到 了成功表达 ｅｃ ｎ基 ｄ ６。蔡 晶
晶等利用 Ｐ Ｒ技术扩增 获得的大小 约 ２０ ｐ的黑鲷抗 Ｃ ５ｂ
有表达 率高、 产物可分泌、 背景蛋白少 、 易于纯 化、 可高 密度发 酵等优点 ， 合外 源蛋 白的表达 。 目前 鱼类 真 适 核表 达 多 采 用 毕 赤 酵母 表 达 系 统。李 伟 将 大 菱 鲆
（ ｃ ｈｈ ｌｕ ｃｉｕ） Ｓｏ ｔａｍ ｓ ｔ ｎｓ 的抗 菌肽 ｈｐ ｉ ｎ基 因成 熟肽 ｐ ｍｘ ｅｃ ｉ ｄ 序列经 过部分 改 造后 采用 Ｐ Ｒ 方法 克 隆到毕 赤 酵母 Ｃ 胞 内表 达载体 ｐ Ａ Ｚ 中， 建 了重 组胞 内表 达 载体 Ｇ ＰＢ 构
菌肽 ｈ ｐｉ ｎ Ａ ｅｃｄ （ Ｓ—ｈｐ２ 与毕赤酵母 （ ｉ ｉ ｐ ｓ ｒ ） ｉ ｅｃ ） Ｐｖ ａ ａｔ ｉ ｈ ｏｓ
是机体炎症反 应 的组 成 部分 ，是 宿主 防御 细菌 、 菌 真 等病原微生物入侵的重要分子屏障 ２。
鱼类抗菌肽在鱼体受 到损伤和感染时能快 速合成
并迅速扩散来保护鱼体抵抗 侵染。随着高密 度的饲养 和抗生素 的大量 使用 ， 致 大量 的抗 、 导 耐药 性 细菌 出
现， 传统抗生素类 物质 的效力 和环境 的代谢 压力增大 。
抗菌肽是一类 内源性的具有广谱抗 菌活性 的天然 生物小分子肽 ， 广泛存 在于生 物界 ， 并成 为非 特异性免
疫进化过程 中的重要组成 … 。抗 菌肽一 般 由 ２ ０到 ６ ０
段， 构建融合表 达 载体 ｐ Ｅ Ｇ Ｘ—ｆｅ ， ｈｐ 转化 至 大肠 杆 菌
几种基因表达的真核载体系统与新型口蹄疫疫苗
与 新 型 口蹄
渠春
生 产 力 下 降 及 贸 易 限 制 会 带 来
极 大 的经 济损 失 。 ＭＤ在 世 界 上 Ｆ 流 行 广 且 持 久 。在 所 有 易 感 动 物 中 使 用 灭 活 病 毒 作 为 免 疫 原 构
成 了控 制 及 消 除 本 病 的基 础 ，然
Ｒ Ａ； 次 ， 的基 因组 具 有 中度 Ｎ 其 它 一 国农 业 科 学 院 兰 州 兽 医 研 中 复 杂 性 ，其 复 制 与 转 录依 赖 ９ｂ ＡＶ一３为基 础 的 复 制 型 病 毒 载
体 可 容 纳 ２ ３ ｂ外 源 Ｄ Ａ，可 包 括 大 多数 结 构 基 因 ．ｋ Ｎ
］
。
（Ｅ Ｓ Ｂ Ｖ ）的优 点 ： １ 较 大 的杆 状 病 毒 的核 衣 壳 和基 （）
１ 口 蹄 疫 及 其 防 治 现 、
状 ：口蹄疫 （Ｍ 是 由Ｅ蹄疫 Ｆ Ｄ） ｌ
病 毒 （ ＭＤ 感 染 引 起 的 偶 蹄 动 Ｆ Ｖ） 物 共 患 的急 性 、热 性 、接 触 性 传 染 病 。其 爆 发 流 行 时 ，由于 动 物
重 组 病 毒 载 体 。 腺病 毒是 研 究 真 核 基 因 表达 的 良好 模 型 ，这 是 因为 腺 病 毒 易 于 培 养 和纯 化 ，在 感 染 过 程 中可 以产 生 大 量 的病 毒
一
进 展 ：基因 表达分为原核表达
和真 核 表 达 两 大 类 。在 两 类 表 达
系统 中 ，真 核 表 达 系统 所 表 达 的
甘 肃
兰
蛋 白 的构 象 形 成 、分 泌 和 加 工 修
饰 类 似 于 天 然 蛋 白质 原 型 ，具 有
州
较 高 的 生 物 学 活 性 ，作 为 抗 原 来
蛋白质表达系统的选择与优化
蛋白质表达系统的选择与优化蛋白质表达系统是目前生物技术领域非常重要的研究领域，蛋白质的表达可以为生命科学领域、医学领域、工业领域和农业领域等带来许多重要应用。
但是，选择一种合适的蛋白质表达系统对于高质量的蛋白质表达和产量的提高非常重要。
在本文中，我们将介绍蛋白质表达系统的选择和优化，并讨论这些系统的优缺点。
一、蛋白质表达系统的分类蛋白质表达系统是一种将外源性DNA转化为蛋白质的机制。
这些系统可以分为原核细胞和真核细胞表达系统。
1.原核细胞表达系统细菌和真核生物分别是最常用的原核细胞和真核细胞表达系统。
许多细菌都可以被用来表达蛋白质，如大肠杆菌和嗜热菌。
这些细菌具有相对较简单的基因组和代谢网络，其表达蛋白质速度快且较容易操作。
然而，蛋白质的折叠机制、修饰和复合物形成在原核细胞中会受到迫害，因此，一些复杂蛋白质可能是难以表达的。
2. 真核细胞表达系统哺乳动物细胞是最常用于真核细胞表达系统的细胞类型之一。
它们具有许多优点，如复杂和准确的蛋白质折叠和修饰、较高的产量和较小的瘤变率。
然而，哺乳动物细胞培养是昂贵且需要较长的时间来制备蛋白质。
二、蛋白质表达系统的选择在选择蛋白质表达系统时，需要考虑以下几个因素：1. 表达蛋白质的难易程度一些蛋白质难以表达，对于这些蛋白质来说，选择优化的表达系统非常关键。
具有较少修饰的表达系统通常易于操作，但可能不能提供正确的折叠条件。
在这种情况下，需要考虑使用具有更多修饰和折叠机器的系统，如真核细胞表达系统。
2. 蛋白质的规模和产率当需要表达大量蛋白质时，需要选择具有高产量的表达系统。
对于小规模的蛋白质表达，可以使用原核细胞表达系统来最大限度地减少成本和时间。
哺乳动物细胞表达系统可以表达大量蛋白质，但该过程较为复杂，因此不适合小规模表达。
3. 功能性要求对于需要进一步研究或将蛋白质应用于临床医学的情况，需要进行适当的修饰。
在这种情况下，真核细胞表达系统更适合于表达需要糖基化或其他修饰的蛋白质。
酵母外源基因分泌表达系统
服务简介酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达, 不仅方便了表达产物的分离纯化, 同时也和表达产物的翻译后加工有关, 很有意义。
酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，酵母外源基因分泌表达系统（简称酵母外泌表达系统）采用的宿主是巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris），该表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。
服务原理甲醇酵母系统分泌表达载体巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
服务优势1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。
2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。
3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。
4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
酵母外泌表达系统的优势1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；3. 具有大规模发酵生产能力服务内容科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化服务。
酵母外泌表达系统服务项目:1.重组酵母表达质粒构建；2.重组质粒电转化；3.重组表达子筛选；4.小规模蛋白表达和纯化（2L培养基培养产物）；南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。
几种外源基因真核表达体系研究进展
１ １ 巴氏德毕赤 酵母表 达 系统 的构成 ．
ｔ ｎ ｇ ｎ ｃ ｐ ａ ｔｅ ｐ ｅ ｓ ｎ ｓ ｓ ｍ ；Ｄｕ ａ ｉ ｌ ａ ｉａ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｔｍ ｒ ｓ ｅ ｉ ｌ ｎ ｒ ｒ ｓｉ ｙ ｔ ａ ｏ ｅ ｎ ｌ ｌ ｓ ｌ ｘ ｒ ｓｉ ｎ ｓ ｓ ｅａ ｎ ｅ
目前基 因工程主要有 ４大表达系统 ： 大肠杆菌表达 系统 、 酵母表达 系统 、 杆状病 毒表达系统和哺乳 动物细胞表达系统． 除 此之外 ， 作为大规模生产重组药物的转基因植物和新型生物反应 器杜 氏盐藻也 备受瞩 目． 本文 主要 介绍 了几种 真核表达系统
第２ ４卷第 ９ 期 ２０ 年 ９ 月 ０８
商 丘 师 范 学 院 学 报
Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｈ Ｎ Ｑ Ｕ Ｔ Ａ Ｈ Ｒ Ｏ Ｌ Ｇ Ｏ Ｒ Ａ ＦＳ Ａ Ｇ Ｉ Ｅ Ｃ Ｅ ＳＣ Ｌ Ｅ Ｅ
Ｖ０ ． ４ １ ２ Ｎｏ ９ ．
Ｓ ｐ． ２ ０ ｅ ０８
几 种 外 源 基 因真 核 表 达 体 系研 进 展 究
12影响外源基因表达的因素不同的外源基因在pp珊幻廊中的表达效率差异悬殊达上千至几千倍高表达的如明胶表达量可达148g1人tundratin肿瘤抑素的表达量约25mgl低表达的如马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶的表达量仅为0001gl甚至还有不表达的如h表面糖蛋白
维普资讯
Ｐｒ ｇ ｅｓ ｏ ｔ ｅ ｄ ｖ ｌ ｐｍｅ ｔｏ ｅ ｅ ａ ｕｋａ ｙ ｔｃ ｇ ｎｅ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｙ ｔｍ ｓ ｏ ｒ ｓ ｎ ｈ ｅ ｅｏ ｎ ｆｓ ｖ ｒ ｌｅ ｒ ｏ ｉ ｅ ｘ ｅ ｓｏｎ ｓ ｓｅ
Ｌ ｈｎ ． ｅ ， Ｉ ｎ Ｚ Ａ Ｇ Ｙ Ｚ Ｕ Ｑｎ — ｎ Ｚ Ａ Ｇ Ｈ ｎ — ＩＣ ｅｇｗ ｉ Ｊ Ｍｅｇ一，Ｈ Ｎ ｉ Ａ 一， ＨＯ ｉｇｆ ｇ ， Ｈ Ｎ ｏ ｇＸ ｅ Ｕ
生物化学实验技术
生物化学实验技术生物化学实验技术是现代生物学研究中不可或缺的重要手段之一。
通过利用各种生物化学实验技术，科研人员可以深入探索生物体内的分子机制，揭示生命活动的规律。
本文将介绍几种常见的生物化学实验技术，包括蛋白质表达与纯化、核酸提取与分析、酶活性检测等内容，帮助读者更好地理解和运用这些技术。
一、蛋白质表达与纯化在生物化学研究中，蛋白质是研究的重点之一。
蛋白质表达与纯化技术是研究蛋白质结构和功能的基础。
常用的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
原核表达系统如大肠杆菌表达系统，适用于表达小分子量的蛋白质；而真核表达系统如哺乳动物细胞表达系统，则适用于表达复杂的蛋白质。
在蛋白质表达后，需要进行蛋白质纯化，常用的纯化方法包括亲和层析、离心超滤、离子交换层析等。
二、核酸提取与分析核酸是细胞内的遗传物质，也是生物体内的重要分子之一。
核酸提取与分析技术是研究生物学和遗传学的重要手段。
核酸提取方法有多种，如酚氯仿法、硅胶柱法、磁珠法等。
核酸分析方法包括凝胶电泳、PCR、酶切等。
通过核酸提取与分析技术，科研人员可以研究DNA序列、RNA表达等重要生物学问题。
三、酶活性检测酶是一类在生物体内发挥催化作用的蛋白质，具有重要的生物学功能。
酶活性检测是评价酶的功能和活性的重要方法。
常见的酶活性检测方法包括光谱法、比色法、荧光法等。
通过这些方法，可以准确地测定酶的活性，研究酶的底物特异性、酶促反应动力学等问题。
总结生物化学实验技术在现代生物学研究中起着至关重要的作用。
通过蛋白质表达与纯化、核酸提取与分析、酶活性检测等技术，科研人员可以深入研究生物体内的分子机制，揭示生命活动的规律。
希望本文介绍的几种常见的生物化学实验技术对读者有所帮助，激发读者对生物化学实验技术的兴趣，进一步探索生物学的奥秘。
沙眼衣原体pORF5蛋白真核表达系统的构建与鉴定
Ａ ｓ ａｔ ｂ ｔ ｃ：Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｏ ｓｕ ｔ ｕ ａ ｏｉ ｅｐｅｓ ｎｐａｍ ｄｐ Ｓ ｅ ｒ ｊｃ ｖ ｏｃｎｔ ｃ ｅｋｒ ｔ ｘｒｓｉ ｌ ｉ Ｄ Ｒ ｄ—Ｃ ／ Ｏ Ｆ ａｅ ｎｇｎ Ｏ Ｆ ｆ ｉ ｒ ｙ ｃ ｏ ｓ １ ｐ Ｒ ５ｂｓｄｏ ｅｅｐ Ｒ ５ｏ
ｆ ｒ ｐＯ ＲＦ５ Ｇｅ ｆＣｈｌｍ ｙ ａ Ｔｒ ｃ ｍ ａ ｉ ｏ ｎｅ ｏ ａ ｄｉ ａ ｈｏ ｔｓ
Ｌ ｈ ｎ —ｙ 。 ｉ ｏ ， Ｕ Ｎ ｉ ｉ ，ｔ ｌ Ｉ ｏ ｇ ｕ ｗｕ Ｙ —ｍ ｕ Ｈ Ａ Ｇ Ｑｕ—ｌ ｅ Ｚ ｎ ａ
（ ｅａｔ ｅｔｆＭｉ ｏｉｌ ｙａ ｄＩ ｍｕ ｏ ｇ ，Ｕ ｉ ｍｔ Ｓ ｕ ｈｎ ， Ｄ ｐ ｒ ｎ ｍ ｏ ｃ ｂ ｏ ｎ ｒ ｏｇ ｍ ｎ ｌ ｙ ｎｖ ｉ ｏ ｏ ｔ Ｃ ｉａ ｏ ｅ ｙｆ ｈ
基础研究 ・
沙 眼 衣 原 体 ｐ Ｒ ５蛋 白真 核 表 达 系统 的构 建 与 鉴 定 Ｏ Ｆ
李 忠玉 ， 移谋 。 秋林 ， 吴 黄 周 洲
（ 南华 大学 微 生物 学 与免疫 学教研 室 ， 湖南 衡 阳 ４ １０ ） ２ ０ １
摘 要 ： 目的 构建沙眼衣原体（ ｔｐ Ｒ ５基 因重组质粒 ｐ Ｓ ｅ Ｃ）Ｏ Ｆ Ｄ Ｒ ｄ—Ｃ ／ Ｏ Ｆ ， １ｐ Ｒ ５ 建立 ｐ Ｒ ５稳 定转染的表 Ｏ Ｆ Ｐ Ｒ法扩增 ｐ Ｒ ５基 因， Ｃ Ｏ Ｆ 定向插入 ｐ Ｓ ｅ Ｄ Ｒ ｄ—Ｃ １真核 表达载 体构建 ｐ Ｓ ｅ Ｄ Ｒ ｄ—
检 测 ｐ Ｒ ５蛋 白在 细 胞 中 的 表 达 。 结 果 所 克 隆 的 ｐ Ｒ ５ 基 因 片 段 经 测 序 完 全 正 确 ； 染 ｐ Ｓ ｅ Ｏ Ｆ Ｏ Ｆ 转 Ｄ Ｒ ｄ—Ｃ ／ １ ｐ Ｒ ５的 Ｈ Ｌ 一 ２ Ｏ Ｆ ｅ ａ ２ ９细胞 大部 分有 ｐ Ｒ ５蛋 白 的表 达 ， 转 染 空 载 体 ｐ Ｓ ｅ Ｏ Ｆ 而 Ｄ Ｒ ｄ—Ｃ １或 未 转 染 的 Ｈ Ｌ ｅａ一２９细 胞 ， ２ 均 未 见 ｐ Ｒ ５蛋 白表 达 。 结 论 Ｏ Ｆ 成 功 构 建 了稳 定 表 达 外 源 新 基 因 ｐ Ｒ ５的 细胞 系 ， 进 一 步 研 究 该 蛋 白 的 结 Ｏ Ｆ 为 构 功 能 、 明 Ｃ 的 致 病 机 制 、 制 基 因工 程 疫 苗提 供 了有 利 的 条件 。 阐 ｔ 研 关 键 词 ： 沙 眼 衣 原 体 ； ｐ Ｒ ５基 因 ； 真核 表 达 Ｏ Ｆ
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真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。
例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
4.具大量非编码序列：占90%以上的DNA序列。
因真核生物(多细胞)中血液循环为细胞提供了一个较稳固的生长环境，即生长调控较简单，而分化的调控那么极复杂，高度分化的组织细胞中只有10%的基因不同程度地表达，其它被关闭，这一调剂机制极复杂，而原核生物生存的唯一目的即无穷生长，其基因调控即生长调控，其细胞中约有40~50%的基因活化。
5.真核mRNA 5’端具帽子结构，3’端具Poly A尾——真核mRNA半衰期较长，有可能用来制备cDNA。
(1)甲基化帽(methylated cap)——甲基鸟嘌呤核苷酸帽(m7’G)真核生物mRNA 5’端除加一m7Gppp外，其后面的第一个核苷酸的2’-OH也甲基化。
帽的功能：有效封锁RNA 5’结尾以防降解。
提供核糖体识别位点，促使核糖体与mRNA 的结合。
(2)3’结尾的Poly A(100~200个核苷酸)：使mRNA3’结尾稳固，不受酶破坏，并可促使mRNA转运至细胞质中。
6.含大量重复序列：(1)编码功能重大，需要量多的产物，eg.组蛋白。
(2)参与基因调剂：结尾反向重复序列，形成基环结构(3)与染色体构象、着丝点形成有关。
7.没有操纵子结构：真核向往功能相关基因并非老是排列在一路，而是大多分散在不同CS上，即便空间位置相近，也是别离进行转录。
(二)、表达调控特点：1.多层次、多方面：DNA-组蛋白的高级结构 DNA转录—加工—切除—运输—翻译。
2.形成单顺反子mRNA：即每一条mRNA只能给一种蛋白质编码(图)。
3.转录与翻译在时刻、空间上分开独立进行。
(三)、调控模式：多层次1.转录前水平(基因组水平)：基因结构上的改变、稳固持久、不可逆(1)基因突变：细胞癌基因突变→转化。
Eg.大多数肿瘤中都发觉有ras 基因的突变：12Pro、16Pro突变→p21蛋白功能改变→细胞转化。
(2)基因重排：某些基因片段改变原先的顺序而从头排列。
基因重排不仅单指空间结构上的改变，还常伴有基因片段的丢失和扩增。
Ig产生即是基因重排的代表。
(3)甲基化：真核向往在启动子周围有一CG区，其中C可发生甲基化(5’mCG)而抑制基因表达。
Eg. p16是一种新型抑癌基因，在70%以上的肿瘤细胞中有缺失/突变，现发觉p16的功能异样很多是由于其5’端CG甲基化造成的。
另外基因扩增及染色体结构改变(组蛋白与DNA的解离/聚合，染色体的空间构型)都可致使基因表达的转变。
2.转录水平调控：基因调控的重要一步要紧涉及三种因素(1)RNA聚合酶：真核生物有三种，RNA聚合酶Ⅱ→mRNA,调剂其活性→表达水平。
(2)顺式调控因子(cis-acting factor)：与结构基因串联的特定DNA序列，对基因转录的精准起始和转录活性有重要意义，要紧包括；①启动子(promoter)：5’端与转录起始有关的DNA序列。
近距离起作用(100bp)，有方向性，空间位置恒定，包括：一般启动子元件TATA-box(Hogness box):TATAAAA或TATATAT, 30区。
决定基因转录的精准起始，活体中缺失后虽可转录但无精准起始点。
即TAT box保证精准起始点，并对转录水平有定量效应。
上游启动子元件(ups):协同假定转录的基础效率，包括：CAAT盒：GCT(C)CAATCT：-70~-80bp区域，RNA聚合酶结合部位，RNA聚合酶Ⅱ可识别此保守区；GC盒：CCGCCC，位置不定，多拷贝，位于CAAT双侧，可能与增强转录起始效率有关。
决定基因的特异性表达：组织特异性元件：eg. 肝细胞中的HP1,位于白蛋白，AFP等的调控区。
诱导性启动子元件：cAMP反映元件(CAE)：介导对cAMP生长因子的反映。
②增强子(enhancer):本身不具有启动子活性，但可增进基因转录活性的顺式调控元件，核心顺序：TGGAAG，是真核基因高效转录所必需。
无方向性，可在基因上、下游的任一名置发挥作用，插入方向能够是3’→5’，也能够是5’→3’，均有活性。
远距离作用(几十kb处也可)无基因特异性，故可分离某一基因的增强子人为插入靶基因的周围，达到提高转录效率的目的。
具组织特异性和相位性 enhancer是真核基因工程顶用来提高转录效率从而提高表达效率的重要手腕，eg. SV40的增强子，Ig 基因增强子(位于RF，C之间)③寂静子(silencer)/衰减子(dehancer):抑制基因转录的顺式调控元件④加尾信号及转录终止信号·Poly A加尾信号：AATAA位于Poly A上游10~20bp处·Poly A尾的终止信号是G/T簇·无Poly A尾的基因其转录终止信号是一段能形成发荚结构的反向重复序列。
(3)反式作用因子(trans-acting factor):由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的彼此作用而调剂基因转录活性。
①顺式作用元件是反式作用因子的结合位点，并通过反式作用因子的作用实现顺式调控元件调控基因转录的作用。
②结构上包括DNA结合的结构域—与特定DNA顺序结合DNA活化的结构域—调剂基因表达故反式作用因子言可称为DNA结合蛋白。
③依照作用方式可分为三种：一般转录因子，多数细胞中普遍存在，可与TAA盒，GC 盒等一般启动元件结合。
组织特异性转录因子：仅在某种细胞中表达，并特异性识别组织特异性启动元件，发挥作用，是基因表达组织特异性的决定因素，eg. OCT-2仅在淋巴细胞中表达，并识别Ig基因启动子和增强子，OCT-2是Ig特异性表达的决定因素。
诱导性反式作用因子：其活性可被特异的诱导因子诱导，eg cAMP结合转录因子可被cAMP诱导。
3.转录后修饰(1)戴帽加尾(增加稳固性)(2)剪切去除内含子：剪切方式多样，并非是所有外显子都选择，通过选择剪切能够调剂基因表达；①通过对内含子的去舍决定基因转录的开关，或对5’3’非编码顺序的选择剪接，决定转录效率。
②通过对外显子的选择，产生不同功能的蛋白质；③通过对3’结尾特殊序列的选择，产生不同定位的蛋白质：B细胞在转录形成IgM时，假设选择3’端的一段编码疏水性膜结合片段的外显子，那么可产生分泌型IgM。
4.翻译水平的调控：涉及参与翻译进程中的各因素，如mRNA稳固性，tRNA的多少、功能，可溶性蛋白因子的修饰(肽链起始因子延伸因子等)，反义RNA是参与翻译水平调控的重要因素：(1)反义RNA(anti-sense RNA):一段含有与被调控基因产生的mRNA互补的碱基序列的小分子RNA。
(2)反义RNA可与mRNA结合，形成双链结构，从而阻碍mRNA的翻译，最初发觉于原核(1981年美国NIH发觉中的无心义链转录形成一段小片段，即)反义RNA，1984年提出反义RNA 的概念)。
①反义RNA可与mRNA5’帽结合，阻碍mRNA与核糖体的结合，缩短mRNA寿命②反义RNA与外显子、内含子连接部位结合，阻碍剪切。
③反义RNA与Poly A结合，阻碍转运。
反义RNA结合部位：m7G…5’非编码序列…↑核糖体结合部位AUG…外显子…内含子…3’非编码区…Poly A↑↑(3)反义技术：人工合成一段反义RNA/DNA，对基因表达进行调控①人工合成一段反义RNA/DNA，也可分离无心义链转录形成②构建反义RNA/DNA载体，导入受体细胞，或仅将反义RNA注入受体③应用：对病毒、癌基因的翻译进行阻断，有可能成为一种只损伤病毒，而不阻碍其他细胞的有效方式，eg. HBx基因可能是HBV致癌的重要缘故。
反义分子种类：反义DNA、反义RNA核酶(中心序列＋侧翼序列)↑↑剪切功能结合功能多靶位核酶反义技术三步曲：①人工合成(修饰/不修饰②基因导入③核酶反义技术之应用：①抗病毒②抗肿瘤③人工免疫：导入目的基因的反义RNA5.翻译后水平调控切除信号肽，进行磷酸化，乙酰化、糖基化等化学修饰，最终形成具有天然空间构型的有功能蛋白。
三、真核生物的基因克隆(一)目的基因的取得：1.鸟枪法：提取细胞总DNA—非特异性切割(机械剪切，eg超声；Ⅱ型酶酶切)—成立基因库—挑选(以目的基因为探针进行杂交)优势：与天然状态相似缺点：操作复杂，机率低，含内含子和它非编码序列。
2.化学合成法：小分子肽，可直接合成并可同时进行改造，3.反转录合成cDNA:最经常使用，选取目的mRNA丰度高的细胞抽提总RNA→挑选mRNA(细dT寡核苷酸探针杂交或过柱纯化)→反转录合成CDNA→建库→以目的基因为探针挑选。
4.PCR扩增特定片段：以PCR方式直接从DNA上扩增目的片段或抽提mRNA,进行RT-PCR：先反转录出cDNA,再PCR相应片段，省略了复杂的建库工作。