台湾分析方法验证指南
现行药品优良制造规范-
分析确效作业指导手册
壹、前言
本资料系参照ICH Q2A及Q2B之内容制订而成，所包括之内容为针对分析方法予以确效时，需加以考量内容确效研究的特性项目或确效指针。当药厂要申请药品查验登记时，此等特性项目应包含在送件资料内。在确效时所收集到的所有相关数据，以及在计算确效指针上所使用的计算公式，都必须列入查验登记申请资料中，并加以适当讨论。
除了在本资料所提示的研究方法外，药厂尚可使用其它适当的研究方法进行分析方法确效。查验登记之申请者有责任选择最适合于其产品的确效方法与确效计划方案。不过，药厂应切知，分析方法之确效，其主要目的就是在于确认该方法确实能适合于其所期望达到之目的。生物制品与生物技术制品因具有错综复杂的特质，其分析方法可以采用异于本手册所述的方法来确效。
在整个确效研究中所使用的对照用物质，必须具有证明其纯度而且品质适当之文件资料；其所需之纯度标准，依拟使用之目的而定。
在实际操作上，通常可利用试验设计来同时探讨若干种确效指针，如专一性、线性、范围、准确度以及精密度等，以对分析方法之能力提供完整而全面的讯息。
贰、执行分析方法确效之类型
本资料内容系以四类最普遍的分析方法为主：
?鉴别试验。
?杂质含量之定量试验。
?杂质之管制限度试验。
?在原料药或成品之检品中，有效(活性)成分或成品中的其它特定成分的定量试验。
除此等之外，还有许多其它的分析方法，例如成品的溶离度试验或药物的粒径分析，其分析方法确效未包括在本资料中。但其确效事宜与已在本文中所列举者同等重要。
下列简要叙述本手册中所包括之试验类型：
?鉴别试验：旨在确保在一检品中之一标的分析物的鉴别。通常将检品与对照标准品之性质(例如，光谱、层析特性、化学反应性等)加以比较而达成之。
?杂质试验：可为一检品中之杂质的定量试验或含量之限度试验。这两类杂质试验之目的是在于准确地反映出检品的纯度。定量试验与限度试验所要求的确效特性是不同的。
?含量测定方法：系供量测一检品中所含有的标的分析物。在本资料的背景下，含量测定为药物中主要成分的定量性量测。对于成品，当对其所含之有效或其它特定的成分作含量测定时，也适用相似的确效特性。同样的确效特性也适用于其它的分析方法(例如：溶离度试验)中的含量测定。
对于有关分析方法的使用目的应予以充分了解，因为该目的与所需要评估的确效特性内容息息相关。通常必须加以考虑的代表性确效特性如下：
?准确度
?精密度
﹡可重复性
﹡中间精密度
﹡再现性
?专一性
?最低检测浓度
?最低定量浓度
?线性
?范围
此等确效特性的定义在本手册的术语与定义项中有详细的说明。下表列举在不同类型之分析方法的确效中，被认为最重要的确效特性。表中所列举者应视为确效分析方法时之代表性内容，偶有例外时得依个案个别处理。另，表中并未将耐变性列出，但是在分析方法开发过程中，应加以适当考量。
在下列情况下，可能有必要执行再确效：
?原料药的合成方法有所改变
?成品组成有所改变
?分析方法有所改变
再确效的执行程度，依其改变的本质而定。其它某些改变也可能需要加以确效。
注意：－表示此特性不是属于常态评估的。
＋表示此特性是属于常态评估的。
(1)如已执行再现性(见术语与定义)试验，则不需要执行中间精密度试验。
(2)分析方法如专一性不足，则应提出其它分析方法以供左证。
(3)必要时须执行。
叁、术语与定义
一、分析方法：
分析方法是指执行分析的方法过程，其中详细叙述执行每一种分析试验所需要的步骤。分析方法至少可包含下列项目：检品、对照标准品与试剂制备液、器具设备的使用、检量线的制作、计算公式的使用等。
二、专一性：
专一性是指当可能存在之成分存在时，能明确的评估标的分析物的能力。通常，这些成分包括杂质、分解物、基质等。
当分析方法欠缺专一性时，可以由其它的分析方法左证。
本定义具下列涵义：
?鉴别：用于确保一标的分析物的鉴定。
?纯度试验：用于确保所执行的所有分析方法能准确的表现标的分析物的杂质含量，如相关物质试验、重金属、溶剂残留量等。
?含量测定(含量或效价)：提供精确的结果，以给予检品中所含之标的分析物准确的陈述。
三、准确度：
分析方法的准确度是用来表现所检测出来的值与一公认之真值或一公认之对照值间之接近程度。准确度有时被称之为真实度。
四、精密度：
分析方法的精密度是用来表现从同一均质检品多重取样，在规定条件下所得到的一系列量测值之间之接近程度(分散程度)。精密度可用三个层次表现：可重复性、中间精密度及再现性。
研究精密度时，必须使用均质而实际的检品（Authentic Samples）行之。不过，如果不可能取得均质的检品，可改使用人工制备的检品或检品溶液来进行研究。
分析方法的精密度通常利用一系列之量测值的变异数、标准差或变异系数表示之。
（一）可重复性：
可重复性是表示在短时间的区间内，用同样的操作条件所得到的精密度。可重复性又称为同次含量测定内之精密度。
（二）中间精密度：
中间精密度是表示同一实验室内的变异程度：如不同日、不同分析者、不同的设备等。
（三）再现性：
再现性是表示实验室之间的精密度（实验室间的共同性研究，通常适用于方法的标准化)。
五、最低检测浓度：
分析方法的最低检测浓度是指在使用该方法时，检品中的标的分析物可被检测出来的最低量，但未必能定量出标的分析物之正确值。
六、最低定量浓度：
分析方法的最低定量浓度是指在使用该方法时，检品中的标的分析物可被定量测出的最低量，而且测定结果应具有适当的准确度与精密度。最低定量浓度是对存在于检品基质中的低含量化合物之含量测定的一个参数，特别使用于杂质及/或分解产物的测定。
七、线性：
分析方法的线性是指在标的分析物的一定浓度（或含量）范围内，由该方法分析检品所得之试验结果与标的分析物的浓度（或量）成正比的能力。
八、范围：
分析方法的范围是指在使用该方法分析检品中的标的分析物，以浓度（量）上限与下线之间距时，其分析结果具有适当的准确度、精密度及线性关系。
九、耐变性：
分析方法的耐变性是指该方法不受方法参数故意以小幅度变异所影响之能力的表现，为该方法在正常使用时之可靠性的指针。
肆、各项分析特性的说明及规定
一、专一性：
专一性的研究应该在进行鉴别试验、杂质测定以及含量测定之确效时执行。用来确认专一性所要使用的试验方法，与该分析方法拟使用的目的有关。
确认一种分析方法对某一特定的标的分析物具有专一性(能完全区别之)，并不一定能做到。在这种情况下，可并用两种或两种以上的分析方法，以便能达到所需要的区辨水准。
（一）鉴别
适当的鉴别试验应能够区辨可能存在于检品中之结构密切相关的化合物。要确定一种方法是否具有区辨能力，可将该方法分别施用于含有标的分析物的检品及不含有标的分析物的检品，如果由前者得到阳性结果而由后者得到阴性结果，则该方法之鉴别能力乃得以确证。此外，该鉴别试验应用于与原标的分析物之结构相似或密切有关的物质时，应不会得到阳性反应。选择此等潜在的干扰物质时，必须以深入的科学判断为基础，来考量可能会发生的干扰。
（二）含量测定与杂质试验
对于层析法而言，必须使用代表性的层析图来表现其专一性；图谱中之各层析峰应标记成分名。使用其它分离技术时，也必须作类似的考量。
在应用层析法时，关键性的层析峰应能解析分离达某一适当的程度。对于这种关键性的分离，可利用彼此先后紧靠冲溶出来的两个成分之分辨率来表现该方法之专一性。
在使用非专一性含量测定时，应使用其它分析方法来支持确认该分析方法的整体专一性。例如，采用滴定法做药品原料放行用之含量测定时，可将该含量测定法与适当的杂质试验法联合并用。
含量测定与杂质试验二者．其做法是相似的：
1.当有杂质样品可用时
具专一性的含量测定法应能区辨标的分析物与杂质及/或赋形剂。实务上，可取纯标的分析物(原料药或成品)加入适当量的杂质及/或赋形剂，再确认含量测定结果没有受到这些添加物之影响(可与未加入杂质及/或赋形剂之检品所得之结果比较)。
对于杂质试验，可在原料药或成品中加入适当量的杂质，再确认这些杂质与检品中的其它成分均能一一分离，藉此达到证明区辨能力之目的。
2.在没有杂质样品可用时
如果无法取得杂质或分解产物的标准品时，则可利用下列方式来表现专一性。将含有杂质或分解产物之检品用另一种试验方法来印证，后者为经确认为适当之方法，例如一药典法或是其它经确效过的分析方法(与原方法不同之方法)。必要时，可将检品以苛酷条件如光照、加热、潮湿、酸与碱水解及氧化处理，然后再分析。
?对于含量测定，应比较上列两种试验之结果。
?对于杂质试验，应比较杂质的解析轮廓图。
由层析峰纯度试验(例如利用偶极数组检测器[diode array]、质谱仪等)，可显示标的分析物的层析峰是否由一种以上的成分所导致。
二、线性：
评估分析方法之线性关系时，应涵盖该分析方法的适用浓度范围为度。评估时可以直接将药物依次稀释(以标准品之储备溶液行之)，及/或以成品之组成成分分别称量再混成标的分析物含量不一之检品，再利用拟测试之分析方法分析之，然后观察分析结果是否呈线性。采用后一种方式探讨时，可在分析方法之适用范围或全域之研究中顺便进行。
探讨线性时，应以目测法评估被分析物之浓度或含量与分析所得之讯号之强弱是否可呈线性关系。如果可呈线性关系，则应再将试验结果利用适当的统计学方法来评估，如利用最小平方法之回归线。有时，为了要使含量测定结果与检品浓度间呈现线性关系，得在线性回归之前利用数学转换技术作预处理。从回归线所得到的数据，有助于线性程度的估测。
回归线的相关系数、y轴截距、斜率与残差平方和等应列入报告中；数据的作图也应予以列入。此外，真实值与由回归线所得之值之偏差程度分析，对于线性之评估也很有帮助。
有些分析方法如免疫分析法，经任何转换处理，也不会呈现出线性。在这种情况下，分析所得之响应值必须与检品中标的分析物的浓度之间有适当之函数关系。
要建立一线性关系，建议最少要用到五个浓度。如用其它的方法，则必须证明其适当性。
三、范围：
分析方法的适用浓度"范围"通常是衍自该方法之线性的研究，而且与该方法所拟应用的目的有关。在订定的范围内，该分析方法对于标的分析物的含量测定结果可呈现适当的线性、准确度及精密度。
分析方法应考量之最小适用范围如下：
?原料药或成品的含量测定：通常为正常试验浓度的80-120%。
?含量均一度试验：至少涵盖试验浓度之70-130%；有时得依剂型之特质(例如定量式吸入剂)，选择较为宽广之适当范围。
?溶离度试验：在规定范围的±20%；例如对于一控释剂型，如果其溶离度规格涵盖范围为1小时后的20%到24小时后的90%，则其确效范围为规格值的0-110%。
?杂质测定：从杂质之应报告量（注）至其规格值的l20%。
对已知为异常毒剧的杂质或是会产生毒性或非预期性药理反应的杂质，其最低检测及定量浓度必须与该杂质（注）应管制的量相当。
对于在分析方法开发期间所实施的杂质试验方法的确效，有时可能有必要于某一限度之上下处，探讨检测或最低定量浓度范围。
?如果将含量测定与纯度试验于一个试验中一并执行，并且只使用一100%的标准品，则其线性范围应涵盖杂质之应报告量至含量测定规格值之120%。
四、准确度：
分析方法之准确度必须能适用于该分析方法之适用浓度范围。
（一）含量测定
1.原料药
有若干种方法可用于测定准确度：
(1)将分析方法应用于已知纯度的标的分析物(例如对照品)。
(2)分别以探讨中的分析方法与以另一种已具备或界定有准确度的分析方法分别
作测定，将所得的分析结果予以比较(参阅肆、一、（二）)。
(3)当精密度、线性及专一性都已确立后，据而推论准确度。
2.成品
有若干种方法可用于测定准确度：
(1)将所要分析之已知量药品加到制品的组成物中，制成组合的混合物，再将此分析方法应用于此混合物。
(2)如果不可能取得全部制剂组成成分，可将已知量的标的分析物加至成品之中再分析比较，或用另一种已具备或界定有适当性能的分析方法来分析，然后比较结果。
(3)当精密度、线性及专一性都已确立后，据而推论准确度。
（二）杂质(定量试验)
评估准确度时，应以在一检品(原料/成品)中加入已知量之杂质为准。
在不可能取得某些杂质及/或分解物之样品时，可用其它方法(参阅肆、一、（二）)所得的结果分析比较；原料药的响应因子（response factor）可供使用。
个别杂质或总杂质与主要标的分析物之间的关系，如重量比率或面积百分率等，其决定方法应明确。
（三）数据之提报
研判分析方法之准确度时，应以能涵盖适用浓度范围全域之浓度三个或三个以上，须至少有九个测定值(如3个浓度各重复3次)。
作准确度报告时，应以加入于检品中之已知量之标的分析物之回收百分率值为准；也可用测定值之平均值与真值间之差值，再伴以一信赖区间值。
五、精密度：
含量测定法及杂质含量测定时之确效事宜，尚包括精密度之研究。
（一）可重复性
可重复性之决定，应以下列之一条件加以评估：
1.应以能涵盖适用浓度范围全域之浓度三个或三个以上，须至少有九个测定值(如3个浓度各重复3次)。
2.在正常操作浓度之100%处，至少作6个测定值。
（二）中间精密度
分析方法之中间精密度之标准，依该方法所拟使用的目的而定。研究中间精密度时，应建立随机条件对分析方法之精密度的影响。常用的随机变因有分析日期、分析人员、分析设备等。研究时，不须对这些变因个别一一的研究，宜利用试验设计方法来进行之。
（三）再现性
分析方法之再现性是以不同实验室执行该方法，所得之结果来评估的。当要将分析方法予以标准化时，例如将分析方法纳入药典时，应考量该方法之再现性。有关再现性之数据并不是批准一药品上市所必要的文件。
（四）数据之提报
对于所研究之各种类型的精密度，应提报其标准差、相对标准差（变异系数）与信赖区间值。
六、最低检测浓度：
要决定分析方法之最低检测浓度，可以用几种不同的方法来处理。依其分析方法是仪器性或非仪器性而定。除了下列方法以外，也可以采用其它的做法。
（一）以目视评估法为基础
目视评估法可以用在非仪器分析法上，但也可以使用于仪器分析法中。
决定最低检测浓度时，取已知标的分析物浓度的检品分析，建立标的分析物能被可靠的检测出时之最低浓度。
（二）以讯号噪声比为基础
这种做法只能适用于显现有基线噪声的分析方法上。
讯号噪声比之决定系分别测定空白检品与若干含有已知量标的分析物之低浓度检品，再以标的分析物能被可靠的检测出来的浓度作为最低检测浓度。通常以讯号噪声比为3:1或2:1时之浓度，作为最低检测浓度值之估计值。
（三）以响应值的标准差与斜率为基础
最低检测浓度(DL)可以用下式表示：
DL = σ/S (式1)
式中σ为响应值的标准差，S为检量线之斜率。
斜率S可以从标的分析物的检量线求得。σ的值可由下列几种方法求得。
1.以空白试验的响应值标准差为基础
分析时，量测适当数目的空白检品之背景响应，再计算此等响应的标准差。
2.以检量线为准
用于此种研究之检量线，应利用标的分析物浓度在DL范围内之已知浓度检品溶液行之。线性回归所得之直线之残余标准差或回归线在y-轴之截距的标准差，可当作式1中之标准差值。
（四）数据之提报
最低检测浓度与用来测定最低检测浓度所使用的方法，应列入报告之中。如果DL系依据目视法或讯号噪声比法求得，则附相关层析图作为合理解释应可考虑被接受。
当最低检测浓度的估计值是由计算法或外插法求得时，可随后再配制若干接近最低检测浓度或在最低检测浓度处之已知浓度检品并分析之，以此确效DL值之合理性。
七、最低定量浓度：
要决定分析方法之最低定量浓度，可以用几种不同的方法来处理。依其分析方法是仪器性或非仪器性而定。除了下列方法以外，也可以采用其它的做法。
（一）以目视评估法为基础
目视评估法可以用在非仪器分析法上，但也可以使用于仪器分析法中。
决定最低定量浓度时，取已知标的分析物浓度的检品分析，建立对标的分析物作定量分析时，能有适当准确度与精密度之最低浓度。
（二）以讯号噪声比为基础
这种做法只能适用于显现有基线噪声的分析方法上。
要决定讯号噪声比时，分别测定空白检品与若干含有已知量标的分析物之低浓度检品，再以标的分析物能被可靠的检测出来的浓度作为最低定量浓度。通常以讯号噪声比为10:1时之浓度作为最低定量浓度值之估计值。
（三）以响应值的标准差与斜率为基础
最低定量浓度(QL)可以用下式表示：
QL = 10σ/S (式2)
式中σ为响应值的标准差，S为检量线之斜率。
斜率S可以从标的分析物的检量线求得。σ的值可由下列几种方法求得。
1. 利用空白试验之响应值之标准差
分析时，量测适当数目的空白检品之背景响应值，再计算此等响应值的标准差。
2. 以检量线为准
用于此种研究之检量线，应利用标的分析物浓度在QL范围内之已知浓度检品溶液行之。线性回归所得之直线之残差标准差或回归线在y-轴之截距的标准差，可当作式2中之标准差值。
（四）数据之提报
最低定量浓度与用来测定最低定量浓度所使用的方法，应列入报告之中。
得到最低定量浓度的估计值后，应随后配制若干接近最低定量浓度或在最低定量浓度处之已知浓度检品并分析之，以此确效QL值之合理性。
八、耐变性：
在分析方法之开发阶段中，应考虑是否要评估该方法之耐变性，评估内容则与方法本身的类型有关。分析方法之耐变性必须能显示出方法参数有变异时，分析结果仍具可靠性。
如果分析条件有变异而量测结果容易受到影响时，则分析条件必须加以适当的控制，或者将注意事项列入分析方法的陈述中。对于分析方法之耐变性评估，所造成的必然结果乃是建立一系列有关该方法的系统适用性参数(如：分辨率试验)，以确保在每次使用该方法时，都能维持其有效性。
有关变异的常见实例有：
?分析用溶液的安定性。
?抽取所用的时间。
在液相层析法上，有关变异的常见实例有：
?在移动相中pH变化所造成的影响。
?在移动相组成的变异所造成的影响。
?不同的管柱(不同批号及/或供应者)。
?温度。
?流速。
在气相层析法上，有关变异的常见实例有：
?不同的管柱(不同批号及/或供应者)
?温度
?流速
九、系统适用性：
系统适用性试验是许多分析方法的一个不可或缺的部份。此等试验之观念基础为分析用之设备、电子工学事宜、分析操作以及供分析的检品等，共同构成分析系统之整体。评估时，以此作整体评估。对于一个特定的方法，所须之系统适用性试验之参数，与所要确效之方法的类型有关。进一步的资料请参见有关之药典。
中英名词对照
中间精密度 Intermediate precision
可重复性 Repeatability
再现性 Reproducibility
响应 Response
成品 Drug product
含量均一度试验 Content uniformity
含量测定 Assay
系统适用性 System suitability
最低定量浓度 Quantitation limit
耐变性 Robustness
原料药 Drug substance
讯号噪声比 Signal to noise ratio
参数 Parameter
专一性 Specificity
最低定量浓度 Limit of quantitation, minimum level of quantitation
溶离度试验 Dissolution
准确度 Accuracy
分辨率试验 Resolution test
线性 Linearity
精密度 Precision
标的分析物 Analyte
标准化 Standardization
范围 Range
线性回归 Linear regression
最低检测浓度 Detection limit
检量线 Calibration curve
杂质 Impurity
杂质定量分析 Impurity quantitation
杂质测定 Determination of impurity
鉴别 Identification
英中名词对照
Accuracy 准确度
Analyte 标的分析物
Assay 含量测定
Calibration curve 检量线
Content uniformity 含量均一度试验
Detection limit 最低检测浓度
Determination of impurity 杂质测定
Dissolution 溶离度试验
Drug product 成品
Drug substance 原料药
Identification 鉴别
Impurity 杂质
Impurity quantitation 杂质定量分析
Intermediate precision 中间精密度
Limit of quanitation, minimum level of quantitation 最低定量浓度Linear regression 线性回归
Linearity 线性
Parameter 参数
Precision 精密度
Quantitation limit 最低定量浓度
Range 范围
Repeatability 可重复性
Reproducibility 再现性
Resolution test 分辨率试验
Response 响应
Robustness 耐变性
Signal to noise ratio 讯号噪声比
Specificity 专一性
Standardization 标准化
System suitability 系统适用性
注：参阅"Impurities in New Drug Substances" 及"Impurities in New Drug Products"等ICH-Guidelines中之"Reporting Impurity Content of Batches"项。
注：参阅"Impurities in New Drug Substances" 及"Impurities in New Drug Products"等ICH-Guidelines中之"Reporting Impurity Content of Batches"项