色谱分析在多肽分离中的应用

色谱技术在多肽分离中的应用

1.多肽概况

肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。

多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽！只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用。

多肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低于10000Da（Dalton道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽类药物是我国药物研究中的一个活跃的领域，多肽类物质广泛存在于自然界中的，如何从天然动物、植物、微生物中分离活性多肽物质，随着分子生物学的发展、基因工程技术、多肽合成技术的兴起,并出现一些新的方法[1]。

2. 多肽分离方法

多肽物质本质上属于低分子蛋白，它的分离方法与蛋白质的分离方法相似，常用的提取分离方法，包括化学萃取法(如醇提、丙酮法)、水泡法、冻融法、酶解法、沉淀法、超滤法、离心法、逆流分溶法、层析法、电泳法等。但根据不同的实验材料不同采用不同的方法，实际应用中常常是几种方法的组合使用。

2.1液相色谱分离法

2.1.1高效液相色谱分离多肽

高效液相色谱分离多肽是近年来常用的方法之一，其具有分离效果好，速度快，回收率高的特点。根据分离过程中的物理、化学原理不同分为反向高效液相色谱，离子交换色谱、凝胶过滤色谱等。

冀峰[2]等使用岛津氨基酸柱后衍生系统锂型分析柱建立了24种氨基酸的高效液相色谱柱后衍生分析方法，成功测定了某两种市售样品牛奶中的皮革水解蛋白含量。

2.1.2 反向高效液相色谱

反向高效液相色谱是根据溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水性差别进行分离的洗脱色谱法。主要用于分子量低于5000的小分子多肽。Wilce等人[3]对2106种肽保留性质与结构进行分析, 得出不同氨基酸组成与保留系数的影响关系。王欣[4]等人使用反响高效液相色谱对奥曲肽等三种小肽进行了分离纯化，结果经检测后奥曲肽的纯度为97.8%。

2.1.3 影响液相色谱分离的因素

2.1.

3.1液相色谱分离模式和固定相的研制

液相色谱分离模式的研究和新固相的研制一直都非常活跃,最近几年相继出现了膜分离色谱,分子烙印手性固定相,棒状液相色谱柱,不同功能团球型聚合物固定相,具有生物功能膜色谱,纤维素亲和膜色谱以及硅胶填料改性的各种液相色谱固定相,为进一步深层次开拓应用范围奠定了基础[5]。

2.1.

3.2样品预处理新技术

样品预处理是样品分析中至关重要的一环。减少杂质对待测物的干扰和样品

中预富集是液相色谱分析取得成功的关键。尤其是在生物化学,临床医学,生物医学和环境监测等分析领域更为重要。20世纪70年代大孔网状聚合物和硅胶键合相的研究,出现了固相萃取(SPE)。由于该技术减少了分析样的污染,节约了溶剂的消耗,缩短样品预处理时间,很快得到了具体的应用,取得了明显的效果。固相微萃取技术(SPME) ,众多分析工作者对其进行了研究,使该技术得到进一步发展和广泛的应用。它是一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(称为萃取头) ,再将萃取头直接进入样品溶液(即直接浸没-固相微萃取方法) 或采用顶空-固相微萃取方法采样。由于聚合物涂层的种类很多,因而可对样品组分进行选择性的富集和采集。然后将吸附组分热脱附或淋洗脱附对样品进行气相色谱,液相色谱及毛细电泳等分离分析。固相微萃取技术与液相色谱分离分析方法连用则开辟了更加广阔的应用前景。尤其在生物化学分析,临床医学和生物医学方面呈出了它独特的优势,为许多常规的分析系统提供了选择和补充。

2.1.

3.3固相萃取柱的选择

为避免样品在上液相色谱、气相色谱、LC-MS-MS、GC-MS 时可能造成色谱柱或源的污染，固相萃取成为去除杂质的必要手段，但经常会遇到柱子的选择、溶剂的选择、操作上的问题[6]。

主要影响有

柱压力的选择：柱压力可分为: 减压、加压、常压。减压柱能够减少固定相硅胶的使用量，缺点有: 第一，大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发( 有时在固相萃取柱外面有水汽凝结) ; 第二，可能会造成易分解物质的损失; 第三，抽气泵的使用，会延长过柱萃取时间，增加噪音。固相萃取柱加压是一种较好的使用方式，特别适用于易分解样品的分离。加压可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集时间，缺点是:减低柱子的塔板数; 压力过大，溶剂流速过快减低分离效果，所以柱加压在普通的有机化合物的分离中较适用。其他条件相同时，常压柱效率最高，但耗时，比如天然化合物的分离。

固相萃取柱的尺寸选择：理想的固相萃取柱类型应该是内径和长度均较大。

柱长加大，相应的塔板数则高，柱内径较大，进样后样品的原点则小( 反映在柱子上就是样品层较薄) ，分离度变大。缺点是采用内径较大的萃取柱需

较多的硅胶和溶剂，增加实验成本。现在常用萃取柱直径与长度比一般在1∶5～1∶10，固定相硅胶量是样品量的30～40倍。

2.2凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱,根据物质尺寸大小的不同分离。如果分子的尺寸大于树脂的最大孔径，这种分子就不能进入树脂颗粒内部，它所经过的有效体积最小，最先从洗脱液中流出。而小分子能够进入树脂的孔道中，经过的有效体积比较大，从洗脱液中流出较晚，分子量越小，流出越晚。倪莉采用凝胶过滤色谱Sephadex G-15分离纯化出丝素肽。

凝胶过滤色谱因其操作方法简单、重复性强等特点在生物大分子的分离纯化中被广泛使用，特别在基因工程蛋白质类药物的精细纯化中起着难以替代的作用。但由于蛋白质凝胶过滤色谱要求样品上样体积较小及洗脱流速较小时才能获得理想的分辨率，这使得凝胶过滤色谱经常成为蛋白质大规模纯化工艺中的限速步骤。

在蛋白质的凝胶过滤色谱中，样品上样量和洗脱流速是影响分辨率的重要因素，一般而言，为了获得好的分辨率，必须减少样品上样量和使用慢的洗脱速度，故凝胶过滤成为蛋白质纯化中最为耗时的一个阶段。虽然采用大直径的色谱柱和耐受较高流速的凝胶填料可以初步解决上述问题，但是成本极高。因此，左等根据AKTAexplorer色谱系统管道自动切换功能进行了上样方法的改进。在常规分离中，记录下开始出峰的体积V1和全部色谱峰出完的体积V2，记V3=V2-V1，则在每次上样洗脱V3后再进行下一次上样。不会产生峰混杂[7]。

2.3 离子交换色谱

离子交换色谱是以离子交换树脂作固定相，在流动相带着试样通过离子交换树脂时，由于不同的离子与固定相具有不同的亲合力而获得分离的色谱法。细胞毒素———F(CTX-F)采用阳离子交换色谱法被许云禄等成功地分离纯化了。在离子交换色谱中, 除纯粹的离子交换过程外, 溶质和固定相之间还存在非离子交换范畴的相互作用,其中包括作为填料基质的有机聚合物中带有的芳香环骨架对