蛋白质、多肽提取分离

蛋白质、多肽提取分离

1、分离方法

采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。

1.1 高效液相色谱（HPLC）

HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）

结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响，并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。

肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得，并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图，便

于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。

1.1.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）

HIC是利用多肽中含有疏水基因，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。利用GIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定，活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了，均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。

1.1.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）

SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如人重组生长激素（hgH）的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体，利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEC具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。

1．1．4离子交换色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC）

IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。

1．1．5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）

CMP+分离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。

1．1．6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性。利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是对β乳球蛋白A和B的良好置换剂，一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。研究表明置换剂的相对分子质量越低，越易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。

1.1.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC）

PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用。

1.2 亲和层析（Affinity Chromatography，AC）

AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基由天然的，也有根据其结构人工合成的。Patel等人利用一系列亲和柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。

固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来发展起来的一种亲和方法。其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。其中胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。

Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，利用反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到。DNA 与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。