蛋白质、多肽提取分离
宜用离子交换色谱法分离的化学成分
宜用离子交换色谱法分离的化学成分
离子交换色谱法可以用于分离各种具有离子性质的化合物。
以下是常见的可以宜用离子交换色谱法分离的化学成分：
1. 离子：离子交换色谱法主要用于分离离子性物质，如无机离子（如阳离子和阴离子）、有机离子（如氨基酸、多肽、有机酸和有机碱）等。
2. 酸和碱：离子交换色谱法可以用于分离含有酸基团或碱基团的化合物，如有机酸、有机碱和含有羧酸基团或胺基团的化合物。
3. 蛋白质和多肽：离子交换色谱法在生物化学领域中常用于蛋白质和多肽的分离和纯化。
通过调节溶液pH值和离子浓度，
可以实现对不同离子性蛋白质和多肽的选择性吸附和洗脱。
4. 配位化合物：离子交换色谱法也可以用于分离含有配位基团的化合物，如金属离子配合物、配位聚合物等。
5. 药物和天然产物：离子交换色谱法可以用于分离和纯化药物和天然产物，如植物次生代谢产物、天然产物中的草酸和多羟基酸等。
需要注意的是，离子交换色谱法在实际应用中需要根据样品的特性和需求，选择合适的离子交换剂（固定相）和流动相条件，以实现有效的分离和纯化。
多肽的分离纯化方法
多肽的分离纯化方法一、引言多肽是由氨基酸组成的生物大分子，其具有广泛的生物学功能和应用场景。
多肽的研究需要对其进行分离纯化，以获取高纯度的多肽样品。
本文将介绍多肽的分离纯化方法。
二、多肽的提取1. 细胞裂解法：将细胞裂解后，通过离心等方法去除细胞碎片和脂质等杂质，得到含有目标多肽的上清液。
2. 酸性水解法：将含有目标多肽的蛋白质样品加入酸性溶液中，在适当温度下进行水解反应，得到含有目标多肽的水解液。
三、分离方法1. 层析法：利用不同化学性质或大小形状等差异对混合物进行分离。
包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。
2. 电泳法：利用电场作用下不同电荷或大小形状等差异对混合物进行分离。
包括SDS-PAGE、IEF等。
3. 薄层色谱法：将混合物均匀地涂在薄层色谱板上，通过不同的溶剂系统进行分离。
4. 超滤法：利用超滤膜对混合物进行筛选，根据分子量和形状等差异进行分离。
四、纯化方法1. 透析法：将混合物放入透析袋中，在适当条件下通过半透膜进行渗透扩散，去除杂质，得到目标多肽。
2. 再结晶法：通过溶液浓缩、结晶等步骤得到高纯度的多肽样品。
3. 活性剂法：利用表面活性剂或有机溶剂等对混合物进行解聚和去除杂质。
五、检测方法1. 比色法：利用多肽与某些化学试剂发生反应产生显色物质来检测多肽样品。
2. 质谱法：通过质谱仪对多肽样品进行检测，得到其分子量和组成信息。
3. 免疫学方法：利用特异性抗体对多肽样品进行检测。
六、结论多肽的分离纯化方法有很多种，选择合适的方法需要考虑到目标多肽的特性以及实验室条件等因素。
在分离纯化过程中，需要注意对样品的保护和操作的规范性，以获取高质量的多肽样品。
多肽提取实验报告
一、实验目的1. 学习多肽提取的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质酶解技术。
3. 了解多肽分离纯化的基本方法。
二、实验原理多肽是蛋白质的降解产物，由氨基酸通过肽键连接而成。
蛋白质酶解是提取多肽的主要方法，通过特定的酶将蛋白质水解成多肽。
多肽分离纯化通常采用离子交换层析、凝胶过滤层析等方法。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 蛋白质样品：鸡蛋清、大豆蛋白等。
- 酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
- 氨基酸标准品：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等。
- 营养盐溶液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
- 酶抑制剂：PMSF（苯甲基磺酰氟）。
- 其他试剂：三氯乙酸、乙醇、丙酮等。
2. 仪器：- 酶标仪- 离心机- 层析柱- 紫外分光光度计- 显微镜四、实验步骤1. 蛋白质样品的处理- 称取适量蛋白质样品，加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
- 加入适量的酶抑制剂PMSF，防止酶的活性降低。
- 将样品置于4℃冰箱中过夜，使蛋白质充分酶解。
2. 酶解反应- 将酶解后的样品置于37℃水浴中，反应2小时。
- 反应结束后，加入适量的三氯乙酸终止反应。
3. 多肽沉淀- 将终止反应后的样品离心，收集沉淀。
- 将沉淀用丙酮或乙醇洗涤，去除杂质。
4. 多肽溶解- 将洗涤后的多肽沉淀溶解于0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
5. 多肽分离纯化- 采用离子交换层析或凝胶过滤层析方法对多肽进行分离纯化。
- 将多肽溶液上柱，收集不同洗脱峰。
6. 多肽鉴定- 利用氨基酸标准品对分离纯化的多肽进行鉴定。
- 通过比较峰面积、保留时间等数据，确定多肽的种类。
五、实验结果与分析1. 酶解反应：酶解2小时后，蛋白质样品基本降解为多肽，酶标仪检测蛋白质含量明显下降。
2. 多肽沉淀：离心后收集到的沉淀为多肽，通过丙酮或乙醇洗涤去除杂质。
3. 多肽溶解：洗涤后的多肽溶解于0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
4. 多肽分离纯化：采用离子交换层析或凝胶过滤层析方法，将多肽分离纯化。
蛋白质和多肽提取分离
蛋白质与多肽提取分离1 分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。
对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。
这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。
1.1 高效液相色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC 能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。
因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。
如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。
1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。
为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。
同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响，并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。
肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。
蛋白质多肽的生产工艺
蛋白质多肽的生产工艺
蛋白质多肽的生产工艺通常包括以下步骤：
1. 培养产生目标蛋白质的生物工程菌株：通常使用大肠杆菌（E.coli）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等常见的微生物菌株作为生产宿主。
这些菌株经过基因工程改造，使其能够大量表达目标蛋白质。
2. 蛋白质基因的克隆和表达：将目标蛋白质的基因克隆到表达载体中，并将其转入宿主微生物细胞中。
宿主细胞在适当的培养条件下表达目标蛋白质。
3. 发酵培养：将转基因宿主微生物细胞培养在大规模发酵罐中。
提供适当的培养基和维持适宜的温度、pH值和氧气供应条件，以促进细胞生长和目标蛋白质的表达。
4. 细胞破碎：经过发酵培养后，收获的菌体经过细胞破碎处理，使得目标蛋白质从细胞内释放出来。
5. 分离纯化：通过各种物理和化学方法，如离心、超滤、层析、电泳等，对蛋白质进行纯化，去除杂质和其他蛋白质。
6. 结构调整和修饰：根据需要，目标蛋白质可以经过一系列的结构调整和修饰，如折叠、剪切、糖基化等，以使其具有理想的功能和稳定性。
7. 产品质量检测和分析：对生产得到的蛋白质进行质量检测和分析，包括纯度、活性、含量、结构等方面的评估，以确保符合规定的质量标准。
8. 储存和包装：将生产得到的蛋白质制成适合储存和使用的形式，如冻干粉末、液体制剂等，并进行适当的包装和标识。
以上是一般蛋白质多肽的生产工艺流程，具体情况还会根据蛋白质的性质和用途的不同而有所调整。
蛋白质测序流程
蛋白质测序流程如下：
样品处理：通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成，将每条肽链分开，并分离提纯。
酶切：使用蛋白酶对分离纯化后的待测蛋白质样品进行酶切，将蛋白质剪切成一定大小的多肽片段。
分离纯化：使用高效液相色谱对肽段酶切产物进行分离纯化。
质谱分析：被分离的肽段再经由质谱分析前首先经过软电离处理使肽段带上一定量的电荷，接着飞行进入质谱仪，经过一级质谱对肽段离子进行筛选，再进入碰撞室与碰撞气体进行碰撞诱导肽段共价键断裂，产生子离子，再经由二级质谱分析肽段序列。
数据分析：借助特定软件对各个肽段的二级质谱峰进行从头序列分析，再对肽段序列拼接获得蛋白质全长序列。
从淡水鱼中提取活性多肽的方法与流程
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鸡蛋蛋白质和多肽的分离及功能性应用
鸡蛋蛋白质和多肽的分离及功能性应用摘要：本文综述了鸡蛋蛋白的主要成分、物理化学特性以及通过酶水解法从鸡蛋蛋白质中得到的生物活性肽的生物活性，并且对鸡蛋蛋白中分离和纯化制得的具有生命活性的蛋白质/多肽最新研究进展作了概述。
最后，进一步描述和探讨了分离制得特定的蛋白质/多肽技术发展，以及它们创造潜在的新的附加值成分应用于食品、营养食品和生物技术行业。
关键词：鸡蛋蛋白，蛋白质，多肽，分离，生物活性9.1 引言鸟类的蛋被认为是一个资源丰富的营养物质，如蛋白质、脂质、酶和像生长促进因子和防御因素等生物物质。
总的来说,一个鸡蛋由63%的蛋清,27.5%的蛋黄和9.5%的蛋壳组成(表19.1)。
尽管鸡蛋含有大约75%的水，它们富含优质蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质。
鸡蛋蛋白质基本上是分布在蛋清和蛋黄之间，此外，蛋壳中占有一小部分。
脂质在卵蛋白中可以忽略不计，它几乎完全存在于蛋黄中，并且和蛋白质形成脂蛋白有关。
碳水化合物是鸡蛋的次要成分，它们以自由碳水化合物形式和嵌合在蛋白质/脂质的形式存在于鸡蛋中。
大多数的矿物质存在蛋壳和蛋黄中，其中磷和钾以可溶性形式存在。
19.1 鸡蛋蛋白的主要成分及其化学成分19.2 蛋清和蛋黄的主要成分表19.2列出了蛋清和蛋黄的主要蛋白质以及他们的平均浓度。
蛋清中的主要蛋白是卵清蛋白，卵铁传递蛋白，卵类粘蛋白，卵粘蛋白和溶菌酶，这些物质占总蛋白的含量>83%。
蛋黄中的主要蛋白以脂蛋白复合物形式存在，它分为等离子体和颗粒部分，包含卵黄脂磷蛋白，卵黄高磷蛋白，卵黄球蛋白和卵黄高脂磷蛋白。
大量的鸡蛋蛋白和它们的一些肽序列，具有生物活动，并且已得到相关鉴定。
例如，溶菌酶作为鸡蛋蛋白质，因为其可作为抗菌剂应用于食品的潜在价值而倍受关注。
鸡蛋溶菌酶所包含的肽序列，能够强有力地对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌产生抗性。
生物活性蛋白和多肽在食品中较低浓度下即可起作用，所以需要就地对纯化物进行预浓缩以获得一定剂量水平产生有利影响。
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蛋白质、多肽提取分离1、分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。
对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。
这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。
1.1 高效液相色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。
因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。
如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。
1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。
为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。
同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响，并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。
肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。
利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。
同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得，并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。
人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图，便于鉴定分析。
此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。
1.1.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）HIC是利用多肽中含有疏水基因，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。
利用GIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定，活性较稳定。
Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。
通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。
不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了，均具有良好的生物活性。
HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。
而RP-HPLC则不能达到这一要求。
1.1.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如人重组生长激素（hgH）的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体，利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEC具有半衰期长、作用强的特点。
一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。
1．1．4离子交换色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC）IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。
其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。
在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。
Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。
1．1．5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）CMP+分离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。
羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。
利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
1．1．6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。
它具有分离组分含量较少成分的特性。
利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。
在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是对β乳球蛋白A和B的良好置换剂，一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。
研究表明置换剂的相对分子质量越低，越易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。
1.1.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC）PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。
试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。
目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用。
1.2 亲和层析（Affinity Chromatography，AC）AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。
自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。
对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基由天然的，也有根据其结构人工合成的。
Patel等人利用一系列亲和柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。
固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来发展起来的一种亲和方法。
其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。
其中胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。
Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，利用反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到。
DNA 与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。
将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。
1.3 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--分离分析方法CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。
此技术从80年代以来发展迅速，是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。
CE根据应用原理不同可分为以下几种；毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和胶束电动毛细管层析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定，比传统凝胶电泳更准确。
目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间，针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如调节电池泳液的PH值，使与硅醇反应的极性基团减少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不同采取不同的CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件，即在低PH条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子如Zn2+等，此时分离速度快而且准确。
1．3．2细管等电聚电泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）由于不同的蛋白、多肽的等电点（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的电泳槽中，其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分离开来。
CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离，如对rHG不同异构体分离。
由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。
1．3. 3毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。
目前，又有一种非交联欢、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定。
1．3．4胶束电动毛细管层析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS，使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。
特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。