香菇多糖的结构分析和构效关系研究进展

香菇多糖的结构分析和构效关系研究进展Reviewoflentinanonthestructureanalysisandstructure-activityrelationship安啸陆珏婕杜琪珍ANXiaoLUJue-JieDUQi-Zhen（浙江工商大学食品与生物工程研究所,浙江杭州310035）（InstituteofFoodandBiologicalEngineering，ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou,Zhejiang,310035,China）摘要：香菇多糖作为一种抗癌的生物活性物质，近年来日益受到人们的重视。本文系统地介绍了香菇多糖的化学结构及空间构象的分析方法，综述了香菇多糖的构效关系，以期为香菇多糖的进一步研究开发提供参考。关键词：香菇多糖；结构分析；构效关系Abstract:Lentinanwasworldwidelyrecognizedasabiologicalactivesubstancepossessinganti-tumoractivity.Themethodsofstructureanalysisandstructure-activityrelationshipofLentinanwerereviewedinthepresentpaperwhichmayprovidethereaderstheknowledgeforfurtherstudyofLentinan.Keywords:Lentinan；Structureanalysis；Structure-activityrelationship

香菇（Lentiusedodes）为担子菌纲伞形科真菌，是世界上第二大食用菌[1]。香菇多糖是香菇中最重要的一种生物活性物质，作为一种免疫促进剂，在20世纪60年代已引起人们的广泛兴趣。现代研究表明：香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫力、降血糖、抗氧化等功能[2，3]。与传统中草药相比，香菇多糖通过增强机体免疫力间接杀死肿瘤细胞，因而毒副作用极小[4，5]。在临床上香菇多糖主要用于抑制和防止胃癌、鼻咽癌、直肠癌、乳腺癌和慢性粒细胞病的术后微转移[6～9]。多糖生物活性的发挥与其结构有关,化学基团的引入也常常会增强多糖的活性或使多糖产生新的活性,因而对多糖结构进行适当修饰是多糖领域研究的重点之一[10，11]。有关香菇多糖的研究，特别是结构方面的研究已引起了国内外学者的高度关注，并有望成为多糖领域的研究热点。现将香菇多糖结构分析和构效关系研究进展作一综述。————————————作者简介：安啸（1985-），女，浙江工商大学食品与生物工程学院在读本科生。E-mail:anla7745@hotmail.com收稿日期：2007-09-27１结构分析多糖结构层次可以分为一、二、三、四级，一级结构主要体现在单糖残基的组成、排列序列、连接方式等；二级结构是指多糖的主链间以氢键结合的各种聚合体，关系到多糖分子中主链的构象，但不涉及侧链的空间排布；在二级结构的基础上，糖单位间的非共价键相互作用形成有序而粗大的构象，形成多糖的三、四级结构[12，13]。香菇多糖结构的研究主要通过分子量范围、单糖组成及摩尔比测定、糖苷键构型及构象分析等来实现。1.1分子量测定分子量是多糖质量的重要指标。对于高分子物质的分子量，测定方法主要有高效液相凝胶渗透色谱法、光散射法、粘度法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法、凝胶渗透色谱激光光散射联用技术等。由于多糖的微观不均一性，采用不同的方法测定同一多糖样品的相对分子质量，其结果往往存在一定的差异。高效液相凝胶渗透色谱法测定多糖纯度和分子量及其分布，具有快速、高分辨和重现性好等优点，因此，在近几年里得到广泛的应用。任一平等[14]采用高效液相色谱法测定香菇多糖的分子量,结果测得日本香菇多糖针剂、福建香菇多糖针剂、香菇口服液提取液、香菇多糖提取添加剂得峰尖分子量分别为518，404，1577，2000Kda。该方法重复性好，峰尖分子量的变异系数为0.115%，含量变异系数为0.932%，大大简化了操作步骤，试验结果准确性高，是目前较为理想的快速检测方法。凝胶渗透色谱激光光散射联用是多糖分子量测定的新型技术，可在没有标准样品的情况下方便地测定多糖的分子量。Unursaikhan等[15]用该法研究4个从香菇子实体中提取可溶性组分，得到它们的重均分子量Mw分别为1479，1576，1519，167Kda。1.2单糖组成及摩尔比测定单糖组成测定是多糖结构分析的基础内容，其测定方法主要有纸层析、薄层层析、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。1.2.1薄层层析法薄层层析法测定多糖的单糖组成具有操作方便，容易掌握、灵活等特点，其缺点是灵敏度不高，对于含量微小的物质不易检出，且无法确定单糖摩尔比。卢成英等[16]通过合适的试验条件（展开剂与显色剂），对比标准单糖的Rf值确定其分离而得的香菇多糖由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖组成。1.2.2气相色谱法和高效液相色谱法气相色谱法和高效液相色谱法是近年来应用较为广泛的单糖及其摩尔比测定方法，其对微量物质的检出体现了高分辨率的特点。此外，高效液相色谱还具有分离速度快、分离效果好、重现性好、不破坏样品等优点。李健等[17]对比高压液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱联用等方法在分析香菇多糖中单糖组成和含量的应用。结果表明：气相色谱和气相-质谱联用方法可以快速地测出香菇多糖的组成及各单糖之间的摩尔比。但这2种方法要求所测样品具有一定的挥发性,而液相色谱中单糖出峰时间比较接近，会影响定性和定量的准确性。1.2.3高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法（HPCE）是一种新型的多糖组成分析方法。它根据含硼砂的缓冲液让单糖在较低的pH条件下带上足够的负电荷，不同的单糖在相同介质条件下与硼砂的络合物具有有效的差异来测定多糖中的组成[18]。汲晨峰等[18]将香菇多糖水解成单糖，通过高效毛细管电泳法确定了香菇多糖由甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，此外还含有微量的鼠李糖、木糖和葡萄糖。虽然相对于纸层析、液相色谱、气相色谱方法，毛细管电泳技术具有用量少、时间短、灵敏度高、分离效果明显的特点，但它主要用于寡糖的分析，多糖的高效毛细管电泳研究目前尚处于探索阶段[19]。1.3糖苷键的构型及构象分析1.3.1化学方法化学方法是用来对一些简单的单糖、二糖和寡糖进行分析的经典方法,应用在香菇多糖的结构解析上，其主要是确定香菇多糖的单糖组成及糖链的连接方式，并且能提供大量的其他结构信息。其主要方法包括高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析等。(1)高碘酸氧化法和Smith降解高碘酸氧化及Smith降解法是用以确定多糖中单糖连接方式的化学方法。前者是利用高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量地进行。每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量，可以判断糖苷键的位置、连接方式、支链状况和聚合度等结构信息。后者是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分水解。由于糖基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物，由降解产物来获取多糖的结构信息[20]。(2)甲基化分析甲基化分析是研究糖类结构的重要手段，它可以确定糖苷键的连接位置。其分析步骤是先将多糖中单糖残基中的游离羟基转变为甲氧基，进而水解成各种甲氧基单糖，然后还原成相应的阿尔迪醇，再乙酰化，得到部分甲基化部分乙酰化的单糖醇，进行GC—MS分析[21]。从GC的保留时间和质谱图谱，与标准品对照，判断糖的组成和连接方式。甲基化反应的关键在于甲基化是否完全,通常用红外光谱法检测3500cm-1处有无吸收峰来判断甲基化多糖中是否含有游离的羟基。甲基化的方法有Purdie法、Hamorth法、Menzies法和Hakomori法等，目前最常用的方法是改良Hakomori法[22]。1.3.2物理方法(1)红外光谱红外光谱在多糖的结构分析上的应用主要是确定糖苷键的构型以及常规官能团。多糖化合物在890cm-1处吸收是β-吡喃糖苷键的特征峰，而820cm-1和850cm-1则是α-吡喃糖苷键特征峰。此外从红外光谱1170～700cm-1区域的吸收峰，可以判断糖苷键的构型和糖环，例如吡喃糖苷在1100～1010

cm-1间有3个强吸收峰，而呋喃糖苷在相应区域内只出现2个峰[10]。卢成英等［16］通过红外光谱分析所获香菇多糖糖苷键构型，表征了β-吡喃糖基的存在，从而说明其分离纯化所得香菇多糖为β-吡喃多糖。(2)核磁共振核磁共振光谱(NMR)法,主要用于确定多糖结构中糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。Umberto等[23]将从发酵香菇菌丝体中得到的香菇多糖进行一维及二维NMR分析,确定其中一种是具有β-D-(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链的葡聚糖。颜邦干等[24]对硫酸化的香菇多糖进行13C—NMR分析，确定了硫酸基的取代位置在葡萄糖残基的C一6位置上。(3)质谱早期的质谱主要局限于电子轰击质谱(EI-MS),其不适用于多糖这种极性强、难挥发的物质。近年发展起来多种不需加热气化的软电离技术,例如快原子轰炸质谱（FAB-MS）的出现，使得高极性、难挥发且热不稳定的多糖及其混合物的直接分析成为可能，利用FAB-MS可以获得分子质量为数千的多糖分子离子峰，由此可以判断结构中糖残基的数目，同时，根据其图谱中碎片离子所提供的糖链裂解方式的信息可以判断糖苷键的连接位点和寡糖链的结构顺序[22]。此外，由于经消化、降解的产物可直接采用高效液相色谱－质谱联用法（HPLC—MS）进行分析，故HPLC—MS对多糖的单元结构研究特别有用。(4)X射线衍射法X射线衍射法是研究多糖的结晶构型的有效方法。多糖通常是不能结晶的，但在适宜的条件下，它可以微晶态存在。所以进行衍射分析的样品必须通过外界的诱导使其中有相当部分呈现微晶态[12]。进行衍射的香菇多糖样品一般先制成碱性溶液，而后在水中透析，再进一步处理制备的。孙艳[25]等将从香菇中分离而得的多糖经X-衍射分析，确定其立体结构为右手心三度螺旋，晶格为六角形，晶格常数a=b=1.5nm,c=0.6nm。Zhang等[26]经X一衍射分析表明:天然香菇多糖具β-三股绳状螺旋型立体结构，但加入尿素或二甲亚砜后立体构型改变，转变为单绳螺旋结构。(5)原子力显微镜原子力显微镜(AFM)是在扫描隧道显微镜(STM)基础上发展起来的一种新颖的物质结构分析方法，其用很尖的探针扫描待测样品表面，探针附在一根可活动的微悬臂的底端上，当探针与样品接触时，产生的微小作用力引起微悬臂的偏转，通过光电检测系统对微悬臂的偏转进行检测和放大，信号经过转换可得到样品的三维立体图像[27]。Zhang等[28]运用原子力显微镜(AFM)和激光光散射(LLS)技术研究了香菇多糖在不同浓度NaOH溶液下构型和构象的转变。结果表明:NaOH浓度低于0.05M时呈现三螺旋结构，而NaOH浓度高于0.08M时则为单绳螺旋。多糖的结构复杂、多样，结构的研究难度大，往往需要多种方法结合起来，才能完成多糖结构的测定。目前已明确香菇多糖结构与免疫及抗癌活性关系的只有β-葡聚糖物质[29]。该物质的一级结构具有β-D-(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链，在主链中葡萄糖的C6位上含有支点(每5个D-葡萄糖有2个支点)，其侧链是由β-D-(1→6)和β-D-(1→3)链相连的D-葡萄糖聚合体组成；而其天然物质的空间结构为β-三股绳状螺旋型立体结构[30,31]。2构效关系现代研究证明:香菇多糖具有多种多样的生物功能，而它的化学结构则是其生物活性的基础[32,33]。研究活性多糖的构效关系，确定何种结构的多糖才具有活