补体结合试验
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RBC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
病人血清(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2
血清稀释度
量的变化可为某些变态反应性疾病与补体缺陷 病的诊断与预后提供依据。
实验报告要求
补体结合实验 原理、结果观察、结论
CH50法 原理、材料、方法、结果、讨论
血清总补体活性测定 (CH50法)
掌握50%补体溶血试验的原理、方 法、结果判定及临床意义。熟悉 血清补体含量的计算。
CH50法原理
绵羊红细胞与溶血素，在新鲜血清中补体的 作用下，绵羊红细胞可被溶解，产生溶血现 象。
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。
补体结合试验操作规程
补体结合试验操作规程试剂：稀释液（0.85%生理盐水）、补体、溶血素、抗原（由生物制品厂或所提供）、阴阳性血清、2.5%绵羊红细胞悬液、受检血清。
（共七种）材料准备：1、稀释液（0.85%生理盐水）的配制：8.5g氯化钠加蒸馏水至1000ml。
2、绵羊红细胞悬液的配制：由健康成年公绵羊颈静脉采血，流入灭菌含玻璃珠的玻璃瓶内，混摇15—20分钟，脱除纤维，使其失去凝固性。
将脱纤血移入离心沉淀管中，加2-3倍量的生理盐水混匀，以每分2000转的速度离心沉淀10分钟，使红血球下沉，吸弃上清液，再加生理盐水用玻棒搅匀再离心沉淀，反复三次，直至上清液透明为止，最后吸弃上清液，所剩沉淀即为红细胞。
按每2.5毫升的沉淀红血球加入到97.5毫升生理盐水中的比例制备，便为2.5%绵羊红细胞悬液。
此液配制后在5—100C下，24小时内可应用。
若发现有溶血时，需重新配制。
经常做补体结合试验，就迫切需要能将红血球保存。
方法是：将无菌的脱纤维蛋白的绵羊血与无菌的等量的改良的阿尔塞维尔氏液混合于三角瓶中（用三角瓶有利于扩大血球与空气的接触面积），置冰箱中冷藏可保存达两个月。
需用时将血球离心洗涤后即可应用。
改良的阿尔塞维尔氏液配法：葡萄糖24.60克，氯化钠5.04克，柠檬酸钠（含2分子的结晶水）9.6克，蒸馏水1200毫升，10磅10-15分钟高压消毒后保存。
抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素、补体、由制标单位提供，按说明书使用。
受检血清的收集和处理：以常规方法采血和分离血清，若发现血清混浊或有血细胞混在时，离心沉淀，每分1000转后将上清液分离出来，然后用稀释液将血清作1∶10稀释，按下表规定的水浴灭能。
操作方法：1.将1∶10稀释经灭能的受检血清加入2支三分管内，每管0.5ml。
2.其中一管加工作量抗原0.5ml，另一管加稀释液0.5ml。
3.上述2管均加工作量补体，每管0.5ml，震荡摇匀。
4.置37℃~38℃水浴20分钟，取出放于室温（22℃~25℃）。
补体结合实验报告
补体结合实验报告补体结合实验报告引言：补体是一种重要的免疫系统组分，它在机体的免疫防御中发挥着重要的作用。
补体结合实验是一种常用的实验方法，用于检测补体与其他分子的结合情况。
本实验旨在探究补体结合的机制以及其在免疫反应中的作用。
实验材料与方法：实验材料包括补体、抗原、抗体和底物等。
首先，将待测抗原溶液均匀涂布在玻片上，然后加入相应抗体溶液，使其与抗原结合。
接下来，加入补体溶液，使补体与抗原-抗体复合物发生结合反应。
最后，加入底物溶液，观察是否发生颜色变化，并通过光谱仪测定吸光度。
实验结果与分析：实验结果显示，在补体结合实验中，当抗原与抗体结合后，补体能够与抗原-抗体复合物结合，从而发生颜色变化。
这一结果表明，补体在免疫反应中起到了桥梁的作用，能够增强抗原-抗体复合物的稳定性，促进免疫反应的进行。
进一步分析发现，补体结合的机制主要包括经典途径和替代途径。
经典途径是指补体通过与抗原-抗体复合物中的IgG或IgM结合，从而激活补体级联反应。
替代途径是指补体通过与抗原直接结合，不依赖抗体的参与，从而激活补体级联反应。
这两种途径共同作用，使补体能够有效地识别和清除病原体。
补体结合实验的应用广泛，不仅可以用于检测抗原-抗体反应的强度和稳定性，还可以用于疾病的诊断和治疗。
例如，在自身免疫性疾病中，补体结合实验可以帮助医生确定患者体内是否存在异常的抗原-抗体复合物，从而指导治疗方案的选择。
此外，补体结合实验还可以用于药物研发和毒性测试等领域。
然而，补体结合实验也存在一些局限性。
首先，实验结果可能受到实验条件的影响，如温度、pH值等。
其次，补体结合实验只能间接反映补体活性的变化，无法直接测定补体的浓度。
因此，在进行补体结合实验时，需要谨慎设计实验方案，并结合其他实验方法进行综合分析。
结论：补体结合实验是一种重要的实验方法，能够帮助我们了解补体的结合机制以及其在免疫反应中的作用。
通过补体结合实验，我们可以评估抗原-抗体反应的强度和稳定性，为疾病的诊断和治疗提供参考。
补体结合实验
2
0.2ml ****** 0.2ml 0.2ml ******
3
0.2ml ****** ****** 0.2ml 0.2ml
4
****** 0.2ml ****** 0.2ml 0.2ml
5
****** ****** ****** 0.2ml 0.4ml
6
****** ****** ****** ****** 0.6ml
补体结合实验
②各管中加SRBC0.2ml、溶血素0.2ml,37度水浴箱
15-30分钟
③验管 不溶血
2 特异性对照 溶血
3
血清对照 溶血
4
抗原对照 溶血
5
补体对照 溶血
6 溶血素对照 不溶血
补体结合实验(CFT)
新乡医学院免疫学教研室
补体结合实验
一、原理 CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补 体的特性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测 抗原、抗体间有无特异性结合的一类实验。
1、参与本实验的成分包括 ①已知抗原（或抗体） ②待检抗体（或抗原） ③SRBC ④SRBC相应的溶血素 ⑤补体
补体结合实验
二、材料 Ag：1:10稀释的伤寒杆菌
1:10稀释的痢疾杆菌 Ab: 1:10稀释的伤寒诊断血清 补体 2%SRBC 溶血素
补体结合实验
三、操作方法
①加样(如下图),37度水浴箱15分钟 试管号 伤寒血清 伤寒杆菌 痢疾杆菌 补体 NS
1
0.2ml 0.2ml ****** 0.2ml ******
补体结合实验
2、参与本实验的五种成分分为两个系统
①待检系统：已知抗原（或抗体）和待检 抗体（或抗原）
②指示系统： SRBC和SRBC相应溶血素
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高美华医学免疫学-补体结合实验
60×0.2
X＝─────＝75
0.08×2
即将豚鼠血清用pH 7.4巴比妥缓冲液作1:75稀释后，每 0.2ml中含2个实用单位的补体。
3、抗原和抗体的滴定：
一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强 阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价 （或单位）。正式试验时，抗原一般用2~4个 单位，抗体采用4个单位。
反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应 系统，优先结合补体。若反应系统中待测的Ab（或 Ag）与已知Ag（或Ab）相对应，则Ag与Ab形成IC后 可结合补体；再加入指示系统时，因已没有游离的补 体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。若不相对应， 将会有游离的补体参与指示系统的反应，最终会出现 溶血现象，为阴性。
8 1:1600│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │分│微溶
9 1:2000│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │钟│微溶
1. 10 1:2400│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
2. 11 1:3200│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
4、补体结合正式试验 按照讲义的表操作
应作抗原或血清对照管，SRBC、溶血素 对照管。
四、结果观察
1、管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内 液体透明呈红色为溶血。
2、第2、3、4管为对照管均应溶血，第5 管为绵羊红细胞对照不应溶血。凡第1管 红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性， 而不溶血者为阳性。
3. 12 1:4000│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
4. 13 1:4800│ 0.25 │ 0.15 │ 0.85 │ 0.25 │ │不溶
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补体结合试验补体是一组正常血清蛋白成分，可被免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。
如果该过程发生在红细胞表面上则导致红细胞裂解而出现溶血。
利用这种反应来检测血清中的抗体或(抗原)，称作补体结合试验(Complement Fixation Test，CFT)。
CFT准确性高，容易判定，对抗原纯化要求不严格，因而普遍用于传染病的诊断。
该试验的不足之处是操作繁锁，尤其是对所用试剂的准备和量化要求较严。
(一) 原理CFT包括两个系统，第一为反应系统，又称溶菌系统，即已知抗原(或抗体)，被检血清 (或抗原)和补体。
第二系统为指示系统(亦称溶血系统)，即溶血素＋绵羊红细胞，溶血素即抗绵羊红细胞抗体。
补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。
补体只能与抗原－抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。
因此，如果试验系中的抗原和抗体是对应的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于缺乏游离补体，就不产生溶血，即为阳性反应。
反之试验系中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物，补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素＋绵羊红细胞免疫复合物激活，而发生溶血，即阴性反应。
为了测定阳性血清中抗体的效价，可将血清作系列稀释，其结果是由完全不溶血逐步达到完全溶血，发生50%溶血的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。
在进行CFT主试验之前，抗原、补体、绵羊红细胞和溶血素必须经仔细测定。
所加补体的量必须准确，补体少导致不完全溶血，出现假阳性结果；反之，超量的补体不能被反应系统的免疫复合物完全结合从而出现假阴性结果。
超量的抗原影响补体的结合，抗原不足不能完全结合补体。
在CFT操作中，经常遇到的一个问题是被检血清存在“抗补体作用”。
即被检血清在无抗原存在的情况下结合补体。
这有多种可能的原因，主要原因是血清取自感染动物，在血清中存在免疫复合物；或者血清被细菌污染，通过其它途径激活了补体。
(二) 分类补体结合试验分直接法、间接法和固相法。
1.直接法如图2-9所示，该法为最常用的操作方法，在试管中加抗原、被检血清和补体，在一定温度下感作一定时间后，加溶血素和红细胞，再感作一定时间后判定结果。
直接法又根据试剂量的差异分为常量法和微量法。
常量法试剂总量一般为0.5ml。
微量法一般为0.125ml。
前者在试管内进行，后者在U形底的96孔微量反应板内进行。
图2-9 直接补体结合试验图示2.间接法如图2-10所示，该法用于禽类血清抗体的测定(如鸭、火鸡、鸡等)。
因其血清抗体与相应的抗原形成复合物后不能结合豚鼠补体，需再加一种抗该抗原的兔抗体，后者形成复合物后可结合豚鼠补体，然后再加补体和溶血系统成分。
与直接法相比间接法多加一种特异性免疫抗体，多进行一次感作。
其结果判定正好与直接法相反。
发生溶血时表示抗原已和血清中的抗体结合，阻止了兔抗体与抗原的结合，补体仍然游离存在，然后与溶血系结合，发生溶血，即为间接CFT阳性；反之，若血清中无相应的抗体存在，抗原则与兔抗体结合形成免疫复合物结合补体，不发生溶血，即为间接CFT阴性。
图2-10 间直接补体结合试验图示3.固相法固相法的原理与直接法相同,其不同点是所有的反应是在琼脂糖凝胶反应皿中进行。
其操作程序为先将溶血素致敏的红细胞液加入融化后冷至55℃的1％琼脂糖凝胶中，混匀，倾注入特制的塑料反应皿内。
(反应皿规格为90(25mm，凝胶量为25ml)。
待其凝固后打孔，孔径为6mm，孔距不得小于8mm。
然后将在37℃温箱中感作一定时间的抗原＋被检血清＋补体混合物取25ul加入孔中，37℃感作一定时间，观察溶血环的直径以确定结果的阴阳性。
(三) 操作方法以牛边虫病直接CFT的常量法加以详细介绍。
对补体效价的测定，以前国内均采用100％溶血测定法，而目前国际流行50％溶血测定法。
当溶血现象近于零或趋近完全时补体量的明显变化只能引起轻度的溶血现象，而在趋近50％溶血时极小量的补体变化可引起程度显著不同的溶血现象。
因此50％溶血测定法显然要比100％测定法敏感度高,对补体的测定更精确。
本节只介绍50％补体溶血测定法。
1.制备绵羊红细胞悬浮液(1) 采血绵羊(最好母绵羊)颈静脉无菌采血。
将40ml的血与60ml阿氏液混匀,冷藏备用。
供血羊一次采血量最多不要超过200ml，采血间隔不少于6周。
(2) 洗红细胞将10ml阿氏液保存的绵羊血通过纱布过滤倒入40ml刻度离心管内，另加30ml巴比妥缓冲液(VBS),混匀。
在水平转子离心机上离心10分钟(500×g)。
吸弃上清液，加VBS至原来的量，再次离心，如此离心洗涤三次。
吸弃上清液。
每管约加10ml VBS，混匀。
将悬液倒入15ml容量的刻度离心管中，离心 10分钟(500×g)。
储存于4－8℃冰箱备用。
红细胞可保存5－6天。
(3) 制备5％绵羊红细胞悬浮液①选择一管洗过的红细胞。
如果红细胞与液面间出现溶血应再离心洗涤，直至清亮。
若多次洗涤仍有溶血，则表示红细胞太脆或缓冲液有问题，应弃去不用。
②记录红细胞的毫升数，吸弃上清液，用VBS稀释红细胞，使成为5％的红细胞悬液(1ml红细胞＋19ml VBS)。
③为了精确配制悬液可用分光光度计检测红细胞的浓度(波长550nm)取1ml约5％的细胞悬液，加19ml的蒸馏水混匀。
用分光光度计检测其透光度，在表上查出红细胞的浓度(见附录3)。
如果红细胞的浓度不等于5％，可加VBS或离心去除VBS校正浓度。
计算如下：需加(或去除)VBS的量＝实测红细胞浓度(细胞悬液总量/5－细胞悬液总量。
注意：一般在最初配制悬液时稍浓于所需浓度，校正时只加一定量的VBS即可。
(4) 致敏红细胞将5％的红细胞悬液与等量适当稀释的溶血素混和，置室温15分钟.混和时总是将溶血素加到细胞液中。
2.配制标准比色管(1) 准备血红素液取10ml 5％的红细胞悬液，加到15ml的刻度离心管中，离心5分钟(500×g)。
吸弃上清液，加蒸馏水至9.5ml,混匀，这时红细胞完全溶解，液体应是清亮的。
加进0.5ml 17％的氯化钠液，混匀，使其保持等渗。
(2) 配制比色管按表2-12配制标准比色管,试管规格为12x75mm.因所用抗原、血清、补体和溶血素均为无色液体，所以用VBS代替。
血红素为5％红细胞溶血液。
3.补体效价的测定(1) 试验当天打开一瓶补体，解冻。
若是冻干的补体需加定量蒸馏水复原。
(2) 取0.2ml补体加9.8mlVBS(低温)作1/50稀释。
按表2测定补体效价。
补体原液置3－4℃保存。
将试管置37℃水浴锅内，感作30分钟，每5分振钟荡一次。
与标准管比较，记录血度此量。
(3) 以溶血度为横坐标，补体的用量为纵作标绘制曲线。
找出50％溶血的补体所用量，为一个单位补体。
(4) 补体效价计算基础计算：用于CFT的补体用量为3个单位补体。
Ｘ＝滴定前补体稀释倍数/(30(1个单位补体量)Ｘ：配制3个单位补体所需补体原液的稀释倍数。
校正计算：在试验中发现补体在感作中损失一部分活性，根据经验需使用基础计算补体用量的1.5倍，即直接配4.5个单位的补体。
但习惯上仍称为3个单位。
其计算公式为: Ｘ＝滴定前补体稀释倍数/(45(1个单位补体量)4.溶血素的效价测定(1) 稀释溶血素按表3稀释溶血素。
* 如果溶血素用等量甘油保存，所需量加倍。
(2) 配制100ml 5％的绵羊红细胞悬液并致敏。
取17个试管,每管加1.5ml 5％的红细胞悬液，然后分别加不同稀释倍数的溶血素1.5ml，混匀。
室温静置15分钟。
(3) 配制1/50稀释的补体。
(4) 用不同稀释倍数的溶血素致敏的红细胞分别做补体效价测定。
结果参考表2-15。
表内“－”表示100%溶血；“0”表示不溶血(5) 查出50％溶血时1/50稀释的补体用量，并换算为未经稀释的补体用量(方法：50％溶血时1/50稀释的补体用量除以50)。
(6) 一个单位的未经稀释的补体用量作为纵坐标，溶血素的稀释倍数作为横坐标，绘制50％溶血曲线。
取保持50％溶血时补体用量最低而溶血素稀释倍数最高的溶血素的稀释度做为溶血素试验用效价。
本例所测溶血素的效价为1:2 000，试验用稀释度为1:1 800。
5.抗原效价的测定(1) 将抗原和阳性血清分别做两倍系列稀释。
(2) 方阵试验补体、溶血素按前试验的结果稀释。
试管排列参考表2-16。
试验程序:0.1ml抗原＋0.1ml血清＋0.1ml补体→4－9℃18小时→＋0.2ml致敏红细胞→37℃水浴30分钟→判定结果。
同时建立下列对照管：一个单位补体对照：0.1ml一单位补体＋0.2ml VBS＋0.2ml致敏红细胞。
二和三单位补体对照：同上。
只是分别采用二和三个单位补体(一个单位补体＝2份VBS ＋1份三单位补体；二个单位补体＝1份VBS＋2份三单位补体)。
(3) 测定结果，见表2-16。
一个单位补体对照：50%溶血；二个单位补体对照和三个单位补体对照：100%血；红细胞对照：不溶血。
已知阳性血清效价为1/80-1/160。
试验结果表明：1/5和1/10稀释的抗原有抗体补体作用；1/80或1/40稀释的抗原所测阳性血清的效价为满意。
所以选择1/40稀释的抗原做为边虫补体结合反应的工作单位。
6.正式试验溶血素：1:1 800稀释抗原：1:40稀释补体：3个工作单位首先，对被检血清和阴、阳性对照血清做1/5稀释，60℃水浴灭活30分钟，然后做进一步稀释。
试验方法见表2-17。
一般阳性血清应多做几个稀释度。
表2-17内C1、C2和C3代表一、二和三单位补体。
阳、阴性血清对照和被检血清同时做。
检验结果举例见表2-18。
一个单位补体对照：50%溶血。
二和三个单位补体对照：100%溶血。
抗原对照：100%溶血。
红细胞对照：不溶血。
附1 阿氏液(Alsever’s)的制备成分：A.氯化钠 4.18ｇ无水柠檬酸钠8.0ｇ加水到900mlB.右旋葡萄糖18.66ｇ加水到100ml方法：1.溶解盐到蒸馏水中。
2.溶解葡萄糖到蒸馏水中。
将A和B液分装。
120℃(15磅)灭菌15分钟。
将Ａ和Ｂ液混合无菌分装到三角瓶中，密封。
一般按每瓶60ml分装，以备采血。
用法：采血时，1.2份阿氏液加1份血，即：60ml阿氏液加50ml血。
附2 巴比妥钠缓冲液(VBS)的制备成份：3－5二乙基巴比妥酸 5.75ｇ5－5二乙基巴比妥钠 3.75ｇ氯化钠85.0ｇ6水氯化镁 1.68ｇ氯化钙0.28ｇ蒸馏水2000ml方法：首先将巴比妥酸溶解到500ml热的蒸馏水中，加入巴比妥钠和氯化钠，然后加水至2 000ml，混匀。
加氯化镁和氯化钙，15磅灭菌20分钟。
pH值应为7.2。
将其按每瓶100ml分装储存于4－9℃。
用法：用前将所配液体用蒸馏水作1：5稀释。