抗菌性试验方法
实验十生防细菌的鉴定及抗菌能力测定
01
02
03
细菌形态观察
通过显微镜观察细菌的形 态、大小、排列方式等特 征。
革兰氏染色
利用革兰氏染色法将细菌 分为革兰氏阳性菌和革兰 氏阴性菌两大类。
特殊结构观察
观察细菌的芽孢、鞭毛、 荚膜等特殊结构，以辅助 鉴定。
生理生化鉴定
生长特性测定
测定细菌的生长曲线、最 适生长温度、pH值等指标。
碳源利用试验
谢谢
THANKS
06 结论与展望
CHAPTER
结论
01
生防细菌种类鉴定
通过形态学观察、生理生化特性测定以及16S rRNA基因序列分析，成
功鉴定出实验中的生防细菌属于芽孢杆菌属（Bacillus）。
02 03
抗菌能力测定
采用琼脂扩散法和液体培养法，对生防细菌的抗菌能力进行了测定。结 果显示，该生防细菌对多种植物病原菌具有显著的抑制作用，如大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌、枯萎病菌等。
采用牛津杯法测定生防细菌对病原菌的抑菌能力，结果显示抑菌圈直径大于15mm，表明生防细菌具有较强的抑 菌能力。
最低抑菌浓度（MIC）
通过二倍稀释法测定生防细菌对病原菌的最低抑菌浓度，结果显示MIC值为10^5 CFU/mL，表明生防细菌在较 低浓度下即可抑制病原菌的生长。
结果分析与讨论
• 生防细菌种类与数量分析：本次实验鉴定出的生防细菌属于芽孢杆菌属，该属 细菌在土壤中广泛存在且数量较多。实验结果表明，生防细菌在土壤中的数量 较高，这为其在土壤中的定殖和发挥生防作用提供了有利条件。
安全性评价
通过急性毒性试验和亚慢性毒性试验，评估了生防细菌对哺乳动物的安 全性。结果表明，该生防细菌在推荐使用剂量下对哺乳动物无明显毒性 作用。
纳米无机材料抗菌性能检测方法及评价-最新国标
纳米无机材料抗菌性能检测方法及评价1范围本文件规定了纳米无机材料抗菌性能的术语和定义、试验方法、试验数据处理、检测结果计算、性能评价、检测报告和注意事项等。
本文件适用于纳米抗菌粉末以及以纳米抗菌粉末为抗菌功能组分（结构单元）的材料，如纤维、织物、塑料、涂料和陶瓷等。
其它材料的抗菌性能检测也可以参照本标准执行。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本文件的引用而成为本标准的条款。
凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。
然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T9266建筑涂料涂层耐洗刷性的测定GB/T13221纳米粉末粒度分布的测定X射线小角散射法GB19258紫外线杀菌灯GB/T19619纳米材料术语GB/T20944.2-2007纺织品抗菌性能的评价第2部分：吸收法（ISO20743）GB/T21866-2008抗菌涂料抗菌性测定法和抗菌效果中华人民共和国卫生部《消毒技术规范规范》（2017年版）T/CIAA抗菌专业名词和术语3术语和定义GB/T19619中的术语及下列术语适用于本文件。
3.1抑菌具有抑制或妨碍细菌或真菌生长繁殖及其活性的作用。
3.2杀菌具有杀灭细菌或真菌生长繁殖的作用。
3.3抗菌采用化学或物理等方法杀灭或妨碍包括细菌、真菌在内的微生物生长繁殖及其活性的过程。
3.4纳米无机材料三维空间尺度至少有一维处于纳米量级（1-100nm）的无机材料，可以是粉末形式或分散在溶液中存在。
3.5纳米抗菌材料纳米抗菌粉末以及以纳米抗菌粉末为抗菌活性组分（结构单元）的材料。
4试验方法4.1试验方法4.1.1纳米粉末抗菌性能的试验方法按附录A规定的方法进行。
4.1.2纤维、织物、塑料粉体和微孔滤材等材料抗菌性能的试验方法按附录B规定的方法进行。
4.1.3塑料、陶瓷、漆膜、板材和金属等硬质表面材料抗菌性能的试验方法按附录C规定的方法进行。
抗菌试验
体外抗菌试验必须严格控制试验条件，使 其尽可能标准化 。
抗菌效力的测定 药品卫生质量的检查
药物含量测定
第一节 体外抑菌试验
检查药物的抗菌效能 体内试验 体外试验 广泛应用
一、常用的体外抗菌试验（antimicrobial test in vitro）
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以 也称药敏试验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药 物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 试验大多在玻璃器皿中进行，优点是方法简便、需时短、 用药量少，不需要动物。 但是没有体内复杂的因素参与，故体内和体外抗菌试验结 果有时会不一致。
药物稀释成系列浓度
与琼脂培养基混合（1：9）铺平板 平板上接种多种试验菌（多点接种仪） 培养，观察试验菌的生长与否，判断MIC。
杀菌曲线（KCs） 不同抗菌药物的杀菌速度
（三）联合抗菌试验 检查两种或两种以上药物在联合使用时的相互作用以及抗菌药物 与不同pH或不同离子溶液的相互影响。
4．挖沟法
滤纸片法
打孔法
管碟法
挖沟法
液体~
（二）系列稀释法（serial dilution test）
固体~
微量稀释 法用微孔 稀释板代 替试管。
MIC
MBC
液体培养基稀释法
固体培养基稀释法
（1）平板法：同时测定多个试验菌的MIC （2）斜面法：适用于需长时间培养的试验菌或避免 孢子飞扬污染环境的霉菌。 平板法步骤：
抗菌测定国标标准
抗菌测定国标标准一、光催化抗菌材料及制品抗菌性能术语和定义微生物：细菌、病毒、真菌等微生物。
抗菌性能：光催化抗菌材料及制品对微生物的生长和繁殖的抑制能力。
防霉性能：塑料材料及其制品对霉菌生长和繁殖的抑制能力。
二、抗菌性能的评定抗菌率：在一定时间内，样品对微生物生长和繁殖的抑制率。
以百分比表示。
微生物死亡率：在一定时间内，样品对微生物的致死率。
以百分比表示。
抑菌环：在培养皿中，样品对微生物生长和繁殖的抑制圈。
以毫米表示。
最小抑菌浓度（MIC）：样品抑制微生物生长和繁殖的最小浓度。
以百分比表示。
最大耐受浓度（MCC）：样品对微生物的最大耐受浓度。
以百分比表示。
三、试验方法和试验报告试验样品：选取具有代表性的样品，切割成规定尺寸和形状，表面清洁干净。
试验菌种：选取具有代表性的微生物菌种，如细菌、病毒、真菌等。
试验方法：采用规定的试验方法，如抑菌环试验、最小抑菌浓度试验等。
试验条件：根据不同试验方法的要求，设置适当的试验条件，如温度、湿度、光照等。
试验报告：记录试验数据和分析结果，编写试验报告。
四、塑料材料及其制品的防霉性能测试样品准备：选取具有代表性的塑料材料或制品，切割成规定尺寸和形状，表面清洁干净。
试验菌种：选取具有代表性的霉菌菌种，如黑曲霉、黄曲霉等。
试验方法：采用规定的防霉性能测试方法，如砂浆盘法、三角瓶法等。
试验条件：根据不同试验方法的要求，设置适当的试验条件，如温度、湿度、光照等。
防霉等级评定：根据试验结果，评定塑料材料或制品的防霉等级。
抗菌陶瓷产品抗菌性能检测方法的研究综述
综述与评述Summary&Review具有抗菌作用的抗菌产品，在疫情时期和后疫情时期均受到广大消费者的特别关注，这类产品的主要特点是产品表面具有抑制或杀灭接触到表面的细菌微生物的作用，即具备抗菌功能。
而抗菌陶瓷作为一类新型功能建材产品，其抗菌功能的实现从技术角度主要有两种途径，一是在陶瓷釉层表面再施涂一层抗菌材料并通过低温烧成等方法使抗菌层固定，二是抗菌成分直接与陶瓷釉料结合，制成抗菌釉然后施涂于陶瓷坯体上一次烧成得到。
第一种方法施涂的抗菌材料主要有两类，一类是光催化氧化钛系列的抗菌材料，另一类是金属银浆直接喷涂在陶瓷釉层表面，这一技术解决了直接在釉层中掺金属银用量大、成本高等问题，产品表面不易脱落、抗菌性好。
第二种方法是直接制备抗菌功能釉，国内多数厂家以这种抗菌陶瓷技术为主。
这种方法的问题是金属成分掺量多、成本高、高温烧成易散失或不能完全到表层，抗菌性易减弱[1]。
抗菌产品的主要特点就是能够对表面的细菌有抑制或杀灭作用。
然而，细菌是一类用肉眼根本看不到、摸不着的微生物，所谓的抗菌作用不能直接观测，而是需要通过微生物实验室进行一系列专业的检测，最终反应其抗菌作用的大小。
美国、日本、国际标准化组织以及我国均制定了抗菌产品的检测标准，对抗菌产品抗菌作用大小的检测方法和流程均有严格规定，这类标准不仅针对抗菌陶瓷，也包含了适用于抗菌塑料、抗菌涂料等建材产品。
本文综述了建材产品的国内外抗菌性能检测方法，重点以陶瓷产品的抗菌性能为研究对象，研究分析了不同国家陶瓷产品抗菌性能的检测标准，并对其差异性进行了比较分析，对我国抗菌陶瓷产品的质量评价具有指导意义，可以提升我国抗菌陶瓷产品质量安全水平。
无论是国内还是国外，不乏以陶瓷、塑料、涂料、马桶等建材产品为测试主体的抗菌性能检测标准，详见表1、表2。
纵观国内外建材产品的抗菌性能检测标准，可以发现抗菌性能检测方法主要有四种：扩散法、贴膜法、振荡法和吸收法。
扩散法，属于定性方法，其试验原理为利用抗菌剂不断溶解，经琼脂扩散形成不同浓度梯度，试样放在两层培养基上，培养一定时间后，根据培养基和试验接触处细菌繁殖的程度，定性评定试样的抗菌性能。
欧洲抗菌面料产品检测标准及方法
欧洲抗菌面料产品检测标准及方法欧洲抗菌面料产品的检测标准及方法主要依据国际标准ISO 22196:2011《抗菌产品的测量和评估》进行。
此标准为测量和评估抗菌表面处理产品的抗菌性能提供了准确且一致的测试方法。
根据ISO 22196:2011标准，以下是欧洲抗菌面料产品的常见检测标准及方法：1.抗菌性能测试方法：使用菌落计数法（CFU/g）测定面料杀菌效果。
(1)准备样品：将抗菌面料切割成特定尺寸，并准备配套的对照组。
(2)制备细菌悬液：选择具有代表性的细菌株，如常见的大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，培养并制备适度浓度的细菌悬液。
(3)处理样品：将抗菌面料样品和对照组分别置于培养皿中，并分别加入细菌悬液。
放置一定的时间，通常为24小时。
(4)菌落计数：取出处理后的样品和对照组，将其置于培养基中培养，然后通过菌落计数法统计生长的菌落个数。
(5)计算杀菌率：根据处理后和对照组的细菌数量，计算出抗菌面料的杀菌率。
2.近场微生物活性测定方法：使用荧光显微镜观察细菌在抗菌面料上的附着和生长活性。
(1)准备样品：将抗菌面料切割成适当尺寸，并准备配套的对照组。
(2)制备细菌悬液：选择适当的细菌株，如金黄色葡萄球菌，制备适宜浓度的细菌悬液。
(3)处理样品：将抗菌面料样品和对照组分别置于培养皿中，并加入细菌悬液。
放置一定的时间，通常为24小时。
(4)荧光显微镜观察：用荧光染色物在荧光显微镜下观察细菌在样品上的附着和生长情况。
通过比较抗菌面料和对照组的细菌数量和附着程度，评估抗菌性能。
3.持久抗菌性能测试方法：使用接触抗菌试验和洗涤抗菌试验评估抗菌面料的持久抗菌性能。
(1)接触抗菌试验：将抗菌面料与细菌接触，然后通过菌落计数法测定细菌的存活率。
(2)洗涤抗菌试验：模拟日常使用中的洗涤流程，将抗菌面料进行多次洗涤后，再进行接触抗菌试验，评估其持久抗菌性能。
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
抗菌抗病毒常用实验研究方法
抗菌抗病毒常用实验研究方法细菌、病毒性疾病是目前国内外流行的主要传染病,尤其是近两年来,由冠状病毒引起的SARS及由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害,是人所共知的"由于各种疫苗的不断出现,虽然一些细菌、病毒病已得到了有效的控制,但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、抗病毒制剂已成为巫待解决的问题。
1、常用的抗菌方法1、1稀释法1、1、1试管稀释法培养基内抗生素的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，经孵育后，观察能引起抑菌作用最低抗生素浓度，称最低抑菌浓度(MIC)为该菌对药物的敏感度。
稀释法所获得的结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。
如以下黄贝贝等的青钱柳抗菌作用的实验研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实验方法:1、应用试管稀释法,测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果,检验不同浓度下青钱柳提取物对细菌、霉菌的抗菌作用。
结果:青钱柳提取物在体外对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用;而对大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显;对黄曲霉、烟曲霉等霉菌的抗菌作用不明显[1]。
2、采用试管稀释法,分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚部分、醇提乙酸乙酯部分、醇提正丁醇部分、醇提水溶部分等7种提取物对大肠杆菌C83882、大肠杆菌C83903、大肠杆菌C83914、沙门氏菌C79-20、金黄色葡萄球菌Newbould S-305、金黄色葡萄球菌临床分离株等6株病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
试验结果表明,火绒草醇提物及其石油醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,其MIC为0114 mg/ml生药浓度,MBC为0127 mg/ml生药浓度,而其它部分对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱。
火绒草醇提正丁醇部分和水溶部分对3株大肠杆菌和1株沙门氏菌具有较强的抑制作用,其MIC为2170 mg/ml生药浓度,MBC为2170 mg/ml 生药浓度,显示了较强的抗菌活性[2]。
药物的抗菌试验
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药物的抗菌试验
FIC指数 0 ． 5为协同作用；0．5－1为相加 作用； 1～2为无关作用；＞2为拮抗 作用。
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药物的抗菌试验
•[棋盘法的设计] •棋盘法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度 都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能
精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的 相互作用。
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药物的抗菌试验
•三、影响抗菌试验的因素
•1. 菌种 • 在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国 家卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提 供的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临 床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌 株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是对 数期生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛， 这对于我试验测定的结果也会准确些。
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药物的抗菌试验
•二、药物的体内抗菌试验
• 药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保 护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受 体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、 脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组 织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物， 代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细 胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中 药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此 在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内 的抗菌试验。
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药物的抗菌试验
•1. 活菌计数法 •将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作 用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生 物数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药物 的杀菌能力。 •活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合 液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板 上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而 来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液 中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与 试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养 后数菌落数。
实验六抗菌药物的体外药效试验
实验六抗菌药物的体外药效试验文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
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抗菌性试验方法
一、试验菌
细菌：金黄色葡萄球菌（ATCC6538），酵母菌：白色念珠菌（ATCC10231）
二、菌液制备
0.03mol/L的磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）配制：无钙镁离子磷酸缓冲盐水（PBS）
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Na2HPO4 2.30g
KH2PO4 0.4g
将上述试剂依次溶于1 000ml去离子水中，完全溶解后，115℃高压灭菌10min-15min，
存在4℃冰箱中备用。
取试验菌株3-14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（24h），用5ml0.03mol/L的磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至合适浓度.
三、操作步骤
取被试样液和对照样液(不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4管(每管5ml)，分别加入100UL 上述菌悬液，均匀混合，并开始计时，在2，5，10，20min分别取样液0.5 ml放入含5mLPBS 的试管内，充分混匀，并做适当稀释，取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5mL于两个平皿，用凉至40-45摄氏度的营养琼脂（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35±2摄氏度培养48小时（细菌）或72小时（酵母），作活菌菌落计数。
四、抗菌率计算：
抗菌率=（A-B）/A×100%
五、评价标准：
抗菌率≥50%，产品有抗菌活性。
抗菌率≥90%，产品有较强抗菌活性。
抗菌率＜50%，产品无抗菌活性。