抗菌药物敏感性试验(药敏试验)

上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸
为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。
平板接种
用无菌棉拭子蘸取菌液
在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分
用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复
几次，每次将平板旋转60°
最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀
感性解释标准。
对于“不敏感”菌株，鉴定和药敏结果需再次
确认。
解释性报告
某些菌种或菌群对抗菌药物的选择和报告有特 殊要求
大肠埃希菌和克雷伯菌属中产 ESBLs 菌株应
报告对所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南 耐药。
对沙门菌属和志贺菌属的分离株
只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺异
恶唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告
过低、过高会使某些药物失去效力（如氨基
糖甙类和大环内酯类）或活性可能增强（如 青霉素类）。
湿度
若使用前琼脂表面过分潮湿，应放35℃
孵箱或在室温下敞开盖子倒臵，直至多 余水分蒸发。
琼脂表面应保持湿润 在接种后琼脂表面或平板的盖子表面不
应有可见的潮湿水珠
胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶影响
过量胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶可逆转磺胺
报告方式
常规报告
敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位
达到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组
织中通常可达到的浓度而治疗反应率可
能低于敏感株。意味着可通过提高剂量
或在药物被生理浓集的部位发挥临床效
力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在
组织或血液内达到的浓度所抑制
（包括其复合药）
从威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、
会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和 脑脊液中分离的流感嗜血杆菌常规应报
告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉 素的药敏结果。
“警 告”
下列抗生素/微生物组合，在体外可出现活性 但在临床上无效 ，不应报告敏感
细菌
产ESBL肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯 菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌
米数 测量时应将尺子臵于倒臵的平板上，臵平 板在黑色无反射光背景上方几厘米处并用反 射光照明。 含血的药敏琼脂 应移去平板盖后用反射 光照明平板，于表面上方测量抑菌环。
测量抑菌环直径时
抑菌环边缘以见不到 细菌明显生长为限，测量的是完全抑制的区 域直径（包括纸片直径）
按抑菌环直径判断细菌的敏感性，应依据
C组药物
某些医院潜在局部或广泛流行的耐药菌株
对数种手选药物（特别是同类的如β-内酰胺 类或氨基糖甙类）耐药
治疗对基本药物过敏的患者
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基
非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼脂
生长法

挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的菌 落，用接种环接触每个菌落顶部

转移至4~5mL 适宜的液体培养基中（如
胰酶消化大豆胨肉汤）
臵35℃孵育2-6 h
用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法
生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基
稀释法
定量测定抗菌药物活性
抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌 浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度 相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
红霉素 克林霉素
青霉素G
葡萄球菌属 淋病奈瑟菌
苯氧甲基青霉素、苯氧乙 基青霉素、氨苄西林、阿 莫西林、巴氨 西林、氨 环己西林、海他西林、 羧苄西林、美洛西林、阿 洛西林、替卡西林、哌拉 西林
头孢噻吩
肠杆菌科
头孢匹林、头孢拉啶、头 孢氨苄、头 孢克罗、头 孢羟氨苄
氨苄西林
所有菌属
阿莫西林、巴氨西林、氨 环己西林、海他西林
不作为敏感报告的抗微生物药
青霉素类、头孢菌素类 和氨曲南
沙门菌属、志贺菌属
Ⅰ、Ⅱ代头孢菌素、头霉素和氨基 糖苷类 所有青霉素类，头孢菌素类、β内酰胺/ β-内酰胺抑制剂、碳青 霉烯类 氨基糖苷类(除外高浓度)、头孢菌 素类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺 甲噁唑
苯唑西林耐药葡萄球菌属
肠球菌属
苛养菌药敏试验
制备好的菌液必须在15min内使用
贴纸片前可将培养皿盖半开3-5min 以使表
面过多水分被吸收但不超过15min
加贴纸片
将接种好的平板敞开盖子倒臵在室温下
干燥3-5min 使平板上的水分被琼脂完全 吸收。
用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，
轻压使其与琼脂完全接触。纸片中心间 距≥24mm,纸片中心距平皿边缘≥15mm。 直径90mm的平板最好贴6张。
可自由选择抗菌药物，可重复，易于由 人判断，故必须标准化。
纸片法药敏试验必须标准化
影响因素
M-H 培养基
批间重复性较好
含有磺胺、甲氧苄啶和四环素的抑制物很少
绝大多数非苛养菌生长良好
已积累大量的数据和经验
培养基配制
按商用脱水培养基说明制备 高压灭菌后水浴冷却至45-50℃
水平台面上倾注平皿，厚度均匀一致
第一、二代头孢菌素和氨基糖甙类药物体外
可能有活性但临床无效故不应报告敏感
沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告
氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性
肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺
胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可
能有活性但临床耐药，不能报告敏感。
MRS 应 报 告 耐 受 所 有 β- 内 酰 胺 类 药 物
圈。
对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物使细菌轻微
生长故抑菌圈直径应忽略细微生长的菌落。
来自血琼脂菌落可能带有足够的甲氧苄啶
或磺胺拮抗物，在 SXT 抑菌圈内细菌可沿敏 感菌株周围产生模糊生长。
检测苯唑西林和万古霉素对葡萄球菌和肠
球菌的抑菌环需要用透射光（平板对着光 源），抑菌环的边缘用放大镜才可发现小菌 落可以忽略。 在纸片周围的抑菌环内有任何可辨的菌落 或生长薄膜（包括针尖样菌落）提示耐药。
NAD母液
NAD50mg 溶解于 10ml 蒸馏水，过滤除菌。
HTM
30ml氯化血红素母液加至 1L含 5g酵母粉的
M-H琼脂中
高压灭菌
冷却后用无菌手续加入3ml的NAD母液
淋病奈瑟菌
培养基 GC琼脂+1%的特定生长添加剂
不推荐用高营养的巧克力琼脂作药敏
若10μg青霉素纸片抑菌圈≤19mm ，表示产
散试验是不可靠的，无菌部位分离的草链应 测其青霉素的MIC。
纸片法特点
适用于肠杆菌科细菌等快速生长的致病菌
无论哪种接种方式，只要质控菌种的抑菌环
在预期范围内，均可按同一解释标准报告药 敏结果 为WHO推荐药敏方法 专性厌氧菌及酵母样菌等某些特殊菌种药敏 试验不能用
技术简单，试剂量低，不需要特殊设备，
药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl
菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
菌液浓度为1.5×108/ml
质控菌株
金黄色葡萄球菌 ATCC 25923
大肠埃希菌 ATCC 25922
铜绿假单胞菌 ATCC 27853
操作方法
菌液制备
挑取已纯化的4~5个菌落制备菌悬液
解释结果几乎完全相同，交叉耐药性和交叉 敏感性也完全相同，通常只选择一种药进行 试验。
药敏试验中常用试验药及其代表的药物
试验药物 苯唑西林 四环素
菌种
葡萄球菌属 除葡萄球菌和 不动杆菌以外 的所有菌属 革兰阳性球菌 所有菌属
代表药物
所有β-内酰胺类包括酶抑制 剂复合药和碳青霉烯类 多西环素、米诺环素、金霉 素、地美环素、土霉素、美 他环素 罗红霉素、克拉霉素、阿齐 霉素、地红霉素 林可霉素
CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏感、 中介、耐药。
结果判断
在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示
接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和
药敏试验
抗菌药物选择出的高频突变耐药株
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物
的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状
爬行生长可以忽略。
链球菌应检测其生长抑制圈而非溶血抑制
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测
试细菌的琼脂平板上 纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑
制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。 抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度 抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类 所有喹诺酮类敏感
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 唑啉（敏感）
万古霉素 氨苄西林
肠杆菌科
所有头孢菌素敏感
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告
报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
平板孵育规定时间（一般为 18-24h ）后读
取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育 24h以
检测苯唑西林和万古霉素的耐药性。
孵育16-18h 后检查每一块平板
如果划线满意，接种物准确无误，抑菌圈应
为正圆形，菌落应融合生长 出现明显单个菌落表示接种量太少
重复
试验
抑菌环直径测量
可用直尺或游标卡尺，读取最接近的整毫
15min内将平板倒臵放温箱孵育。
注意
纸片一旦贴下就不可再挪动位臵，因纸 片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片
孵育
必须用35℃孵箱（苛氧菌药敏平板应臵于
5% CO2 环境） 箱内平板最好单独摆放，不超过两个叠在 一起，否则中间的平板因达不到孵箱温度 而产生预扩散的作用。
内 容
简介
K-B 法 操作方法 报告方式 影响因素 稀释法 E test 联合药敏试验
药物选择及报告
2010年CLSI更新内容简介
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择
最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐
药的微生物流行病学资料 根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
生β-内酰胺酶。
β- 内酰胺酶试验更为迅速，为确认质粒介
导耐药性的好方法。
肺炎链球菌和其他链球菌
培养基 含5%脱纤维羊血的M-H琼脂
肺炎链球菌用苯唑西林测定对青霉素的敏
感性，抑菌环直径≤19mm应测其MIC而不 是直接报告对青霉素中介或耐药
肺链以外的链球菌不推荐用苯唑西林试验
对于草链，青霉素（或苯唑西林）纸片扩
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嗜血杆菌
培养基为HTM（嗜血杆菌试验培养基）
常规试验并不推荐用M-H巧克力琼脂 过高的接种浓度对某些β- 内酰胺类抗生素
可造成假耐药的结果
相当于0.5号麦氏管含菌1~4×108CFU/mL
HTM
氯化血红素母液
氯化血红素 50mg 溶于 100ml 0.01mmol/L
的NaOH，加热搅拌至完全溶解。
其 MIC 落在某些范围内提示该菌可能存
在特定的耐药机制（如 β- 内酰胺酶）而 且治疗研究表明其临床疗效不可靠。
不敏感（NS）
M100-S20定义
当药物对菌株的 MIC 高于或抑菌圈直径低
于敏感折点时报告为非敏感。
非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。 由于耐药菌株缺失或稀少因而仅确立了敏
类和甲氧苄啶的抑菌效应而使抑菌环变小、 模糊甚至消失而导致假耐药的报告，应使用 胸腺嘧啶核苷含量尽可能低的M-H琼脂。
评价新的 M-H琼脂可用甲氧苄啶 /SMZ 纸片对
粪肠球菌ATCC29212或粪肠球菌ATCC33186进 行试验
不合格培养基
没有抑菌圈
约 4mm ， 150mm 平 皿 倒 60-70mL ， 100mm平皿倒 25-30mL
冷却至室温，若当天不使用应贮存于
2-8℃冰箱
制备后7天内使用完毕 每批平板均应进行抽样进行无菌试验，
30-35℃孵育24h或更长时间。
pH
检查每批 M-H 琼脂的 pH ，胶化后室温下为
7.2-7.4
A组
B组 C组
常规和首选药物，其结果应常规报告
首选试验选择性报告。包含一些临床 上重要的、特别针对医院感染的药物 替代性和补充性药物
U组
补充性试验，仅用于治疗泌尿道感染 的抗菌药物。
药物选择
表中小框内是一组类似药物，其结果解释
和临床效力相似，不必个个试验。
“或”字表示一群相关药物，其抗菌谱和