公选-抗菌药物的敏感性试验
17.抗菌药物敏感性试验
操作
待检菌液
无菌棉签 涂布
MH琼脂表面
室温 5min
贴含药纸片 35℃ 观察 16～18h 结果
操作注意事项：
• 菌液应在15分钟内接种完毕 • 注意纸片距离
＞15mm ＞24mm
3．结果解释
• 测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
• 敏感(susceptibile ，S) 推荐剂量的抗菌药物 在体内达到的血药浓度能抑制或杀死待测菌。
•常量肉汤稀释法 •微量肉汤稀释法 •琼脂稀释法
（一）肉汤稀释法
试管肉汤稀释法和微量肉汤稀释法。 1.试管肉汤稀释法
• 方法
– 抗 生 素 的 配 制 （ μ g/ml ） ： 512 、 256 、 128……
– 培养基：MH肉汤 – 待检菌液：107CFU/ml
方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
以扩大病原治疗的覆盖面； ② 治疗多种细菌所引起的混合感染； ③ 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用； ④ 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生； ⑤ 减少治疗指数低的抗菌药物的用量从而减轻其毒副
作用。
• 联合药敏试验的常用方法
– 纸片扩散法 – 棋盘法
• 特点：
– 操作简便同扩散法， – 同稀释法一样可以直接定量出测试药物对测试
M-H肉汤(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
抗生素(ml) 菌液(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1弃 －
去
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
35℃孵育16~18h，观察结果
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
抗菌药物敏感性试验药敏试验
沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告 氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性
肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺 胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可 能有活性但临床耐药，不能报告敏感。
MRS 应 报 告 耐 受 所 有 β- 内 酰 胺 类 药 物 （包括其复合药）
从威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、 会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和 脑脊液中分离的流感嗜血杆菌常规应报 告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉 素的药敏结果。
与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸 为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。
平板接种
用无菌棉拭子蘸取菌液
在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分 用拭子涂布整个M-H培养基表面，反
复几次，每次将平板旋转60° 最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀
制备好的菌液必须在15min内使用 贴纸片前可将培养皿盖半开3-5min以使
来自血琼脂菌落可能带有足够的甲氧苄啶 或磺胺拮抗物，在SXT抑菌圈内细菌可沿敏 感菌株周围产生模糊生长。
检测苯唑西林和万古霉素对葡萄球菌和肠 球菌的抑菌环需要用透射光（平板对着光 源），抑菌环的边缘用放大镜才可发现小菌 落可以忽略。
在纸片周围的抑菌环内有任何可辨的菌落 或生长薄膜（包括针尖样菌落）提示耐药。
注意
纸片一旦贴下就不可再挪动位置，因纸 片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片
孵育
必须用35℃孵箱（苛氧菌药敏平板应置 于5% CO2 环境）
箱内平板最好单独摆放，不超过两个叠在 一起，否则中间的平板因达不到孵箱温度 而产生预扩散的作用。
平板孵育规定时间（一般为18-24h）后读 取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以 检测苯唑西林和万古霉素的耐药性。
四抗菌药物敏感性试验
四、抗菌药物敏感性试验（一）药敏试验的目的测定病原微生物对化学治疗药物敏感性的试验称为化疗药物敏感性试验（Drug sensitivity test ）,简称药敏试验。
药敏试验的主要目的是：①用于测定新的抗菌药物或制剂的抗菌谱；②对病灶分离菌进行流行病学调查，主要应用于测定细菌经过多年后敏感性的变化情况和地区特异性；③在临床治疗感染性疾病时，针对病原菌选择合适的首选药物品种。
（二）药敏试验的原理及种类药敏试验是通过培养基培养的细菌确定细菌对药物的敏感性方法。
将被检菌接种在适当的培养基上，然后加上不同种类或不同浓度的抗菌药物（或制剂），观察细菌生长发育的速度和程度。
用药后，细菌在培养基上停止生长并且死亡，抑菌圈清晰，说明细菌对药物敏感，药物表现有较强的杀菌作用；用药后，细菌停止生长，但液体培养基经过一定时间后还可能出现浑浊或固体培养基上的抑菌圈不清晰，说明细菌对药物比较敏感，预示药物对被检细菌只是起抑菌作用。
通常判定一种药物对细菌的杀菌或抑菌作用的强度指标是固体培养基中抑菌圈的大小，但这也不是绝对的，因为抑菌圈的大小与药物对培养基的渗透性是密切相关的。
药敏试验方法较多，但在原理上不外乎是稀释法和扩散法两大类。
而扩散法（包括纸片法、管碟法）通常适用于临床治疗选择药物。
（三）常用培养基制作法1．普通肉汤培养基牛肉浸膏 3.0克蛋白胨10.0克氯化钠 5.0克蒸馏水1000毫升放在三角烧瓶中，微温溶解后，调节pH值至7.4~7.6，煮沸10分钟，冷却后的pH 值为7.2 ± 0.2。
15磅压力下灭菌15分钟（115C灭菌30分钟）即得。
本培养基可用作为固体、鉴别、选择等培养基制造的基础原料，大部分细菌都能在其中生长。
1 ．普通肉汤琼脂培养基照上述普通肉汤培养基的配方及制法，加入15~20 克琼脂，加热溶解后，调节pH 值使灭菌后为7.2 ±0.2，分装，115C灭菌30分钟，即得。
3．0 . 5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨10 克氯化钠 5 克葡萄糖 5 克牛肉浸膏3 克蒸馏水1000 毫升微温溶解后，调节pH 值至弱碱性，煮沸后，加葡萄糖溶解，摇匀，滤清，调节pH 值使灭菌后为7.2 ±0.2，分装，115C灭菌30分钟，即得。
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
抗菌药物的敏感性试验及报告解读
明确提出在二级以上医院设立感染科与感染临床药师（第12、
13条），及临床微生物室（第14条）
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概况和制定过程
第一章 总则
第六章 附则 第五章 法律责任
共六章 53条
第二章 组织机 构和职责
• 组织医院管理、临床、药学 、微生物检验、感染等方面 专家起草《抗菌药物临床应 用管理办法》
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培养条件（一）
需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小时 嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时 葡萄球菌：33-35 ℃ ，OXA、MET、NAF、VAN24小时 肠球菌：VAN 24小时 溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时
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操作：
无菌棉签蘸取菌液，在管壁内将多余菌液旋 转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1 周。 室温干燥或35℃干燥5-15分钟 用纸片分配器或无菌镊子将药物纸片紧贴于 琼脂表面 纸片间距 20mm 纸片离平板内缘 15mm
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抗生素药敏试验质控
• 4月11日起征求全国意见
• 制定《抗菌药物临床应用分
第三章 抗菌药物 级管理目录》
临床应用管理
• 4月15日期征求全国意见
第四章 监督管理
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第三章 抗菌药物临床应用管理
• 三级医院 不得超过50种，二级医院 不得超过35种 • 同一通用名称药品的品种，注射剂型和口服剂型各不得超过2种，处方组成
葡萄球菌属 Mueller-Hinton（MH）琼脂
关于抗菌药物敏感性试验(药敏试验)课件
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑 制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。
抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度
抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
关于抗菌药物敏感性 试验(药敏试验)
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择 最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐 药的微生物流行病学资料
根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试细菌的琼脂平板上
纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
按 抑 菌 环 直 径 判 断 细 菌 的 敏 感 性 ， 应 依 据 CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏 感、中介、耐药。
结果判断
在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示
接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和 药敏试验
抗菌药物选择出的高频突变耐药株
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物 的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状 爬行生长可以忽略。
治疗对基本药物过敏的患者
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基
非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼
脂
药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl
菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
抗菌药物的敏感性试验
目前，我国抗菌药物的应用现状是临床无指征治疗性、预防性用药严重及选择错误的品种、剂量及疗程。
而不合理用药可导致治疗失败、不良反应增多、细菌耐药性增长迅猛、医药资源大量消耗等不良后果。
而我们应该如何为临床正确选用抗生素呢？正确的答案是，我们应该根据感染菌株的药物敏感性试验合理选用抗生素。
抗菌药物的敏感性试验就是测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力。
目前，我科遵循美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2010版抗微生物药物敏感性试验执行标准进行操作。
由于CLSI标准的公认程度和准确性，许多国家都采用该标准。
该标准根据不同的细菌分类（如肠杆菌科、葡萄球菌属、铜绿假单胞菌等）制定可选用的抗生素及其药敏试验的判读标准，并将它们分成四组：A组：一级试验并常规首选报告的抗微生物药物；B组：一级试验，临床使用的主要抗生素（尤其在院内感染时）有选择报告的药物；C组：补充试验，有选择报告的药物；U组：补充试验，仅用于泌尿道感染细菌的抗微生物药物。
CLSI标准所制定的三级划分制及临床意义如下：高度敏感（S）：用该种药物常用剂量治疗有效；中介（I）：仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物的浓缩部位（如尿液、胆汁等）才被抑制；耐药（R）：药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，均应判定该菌为耐药。
在临床实践中，我们常可以听到一些关于细菌药敏试验与临床药效不符的抱怨。
这一现象的出现，国内外的一些文献认为主要与以下几方面有关。
①与临床是否正确地获得合格的标本至为相关；我们应规范标本的取材、送检及减少送检污染部位的标本（如：痰、咽拭子等）。
②可能出现真菌等二重感染。
③CLSI药敏标准制定中的局限性。
④细菌感染的诊断是否正确。
⑤药敏试验操作不当。
⑥用药剂量不足或出现耐药菌株。
⑦一般医院的微生物实验室做细菌培养仅限于需氧非苛养菌的检测。
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• 接种物的准备和接种
• 孵育
• 结果判读
• 结果报告
二、微量肉汤稀释法
• 微量肉汤稀释法的含药微孔板（条）有多种现 成的商品试剂供应，并常与自动化仪器配套使
用。
三、琼脂稀释法
• 琼脂稀释法是将药物稀释于琼脂培养基中（其基础培 养肉汤同肉汤稀释法），一块平板为一个药物稀释度，
菌液点种于含药琼脂平板上，每点约1μl 菌液，菌液浓
稀释法
• 稀释法药敏试验（dilution method）是在体外定量检
测抗菌药物对细菌之抗菌活性的方法，它测定的是抗
菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory
concentration ,MIC），故稀释法药敏试验常简称为 “MIC测定”。
一、 常量肉汤稀释法
• 试验材料 • 抗菌药物溶液的制备、储存和稀释
抗菌药物 的敏感性试验
第一节 抗菌药物敏感性试验 的目的及试验指征
抗菌药物敏感性试验的定义
• 抗菌药物敏感性试验 （antimicrobial susceptibility test，AST） 简称药敏试验，是在体外测定抗菌药物抑制或 杀灭细菌的能力，亦即是测定细菌对抗菌药物 敏感性（或耐药性）的试验。
第四节 抗菌药物敏感性 试验的方法
纸片扩散法
• 原理 • 材料 ：培养基 、药敏纸片
• 试验菌液的制备
⑴ 直接菌落悬液法（direct colony suspension method）
⑵ 生长法（growth method）
纸片扩散法
• 接种 • 贴药敏纸片 • 孵育 • 结果判读 • 结果报告
度约为5×106 CFU/ml.。点种菌液处未见细菌生长即是 被药物所抑制。同样，抑制生长的最小药物浓度为 MIC。
浓度梯度纸条扩散法
• 浓度梯度纸条扩散法（gradient diffusion method）又称E 试验(E test)
• 优点：融合了纸不仅可用于一般细菌的MIC测定，对 于一些慢生长菌、厌氧菌和真菌的药敏也适用； • 缺点：成本较贵
抗菌药物敏感性试验的目的
• 测定细菌对抗菌药物的敏感性 • 地区性耐药监测 • 评价新药的抗菌药效 • 分析医院感染流行株的药敏谱
抗菌药物敏感性试验的指征
当某些致病菌或条件致病菌的药敏特点不能从其 种属特征上了解时，或其药敏结果易变时，这些菌的
临床分离株必须进行药敏试验。如：肠杆菌科的细菌、
革兰阴性葡萄糖非发酵菌、葡萄球菌属和肠球菌属的 细菌等.
药敏试验中抗菌药物的分组
• 通常将抗菌药的临床应用划分为一、二、三线 ：一线抗菌 药为常用的、价格较便宜的、已有一定使用时间的有效抗 菌药；三线抗菌药常为新开发的抗生素，效果较好，价格 通常亦较贵；一些效果好而副作用较大的抗菌药，通常也 不放在第一线。 • 美国临床和实验室标准化学会（Clinical and Laboratory
中介
• 一些抗菌药物敏感试验结果的表示方法还包括“中介”
（intermesiate，I），它包含几层不同的意思： (1)抗菌药对感染菌的MIC接近该药在血液和组织中的浓度，感
染菌的临床应答率可能低于敏感菌；
(2)结合药代动力学资料分析； (3)若某药在高剂量使用时是安全的（如β -内酰胺类药物），则 中介意味着高剂量给药可能奏效； (4) 中介的数据位置处于敏感与耐药之间，它可作为一个缓冲带
• 其它抗菌药物：①抑制蛋白质合成的抗菌药，
如氯霉素；②作用于细胞膜的脂肽类抗生素，
如多粘菌素B；③抑制RNA合成的药物，如利
福平；④抑制细胞壁合成的药物，如磷霉素。
药敏试验用药的选择依据和方法
• 致病菌的固有耐药特点 • 本地流行株的耐药谱和耐药趋势 • 药物的活性和毒性 • 药物的价格及其供应情况
Standards Institute ,CLSI；过去称作NCCLS）经常更新和发
布临床微生物实验室常规药敏试验的药物选择、分组和报 告指南，可供参考。
第三节 敏感、中介和耐药的概念
敏感
• 所谓敏感 (susceptible ， S) 是指当使用常规推荐 剂量的抗菌药物进行治疗时，该抗菌药在患者
第二节 药敏试验用药 的选择和分组
常用的抗菌药物
• β－内酰胺类 (1) 青霉素类
(2) 头孢烯类
(3) β－内酰胺类和β－内酰胺酶抑制剂的复方制剂
(4) 青霉烯类
(5) 单环类
常用的抗菌药物
• 糖肽类 • 氨基甙类 • 大环内酯类 • 四环素类
常用的抗菌药物
• 喹诺酮类
• 磺胺类和甲氧苄氨嘧啶
感染部位通常所能达到的浓度可抑制该感染菌
的生长。
耐药
• 所谓耐药(resistant，R)是指使用常规推荐剂量的抗菌 药物进行治疗时，该抗菌药在患者感染部位通常所能
达到的浓度不能抑制该感染菌的生长；或者该药对该
感染菌的临床疗效尚未在以往的治疗研究中被证实是 可靠的；或者抑菌圈直径落在特定细菌发挥耐药机制 （如β -内酰胺酶）的合适范围。
抗菌药物的联合药敏试验
• 纸片法联合药敏试验
纸片法联合药敏试验所用的培养基、药敏纸片、菌液 和培养条件等均和纸片法药敏试验相同。将所要试验 的两种药敏纸片邻近贴在涂菌的琼脂平板上，使两纸 片的中心距离恰好等于两药敏纸片单独试验时抑菌圈
的半径之和，按规定条件孵育之后观察抑菌圈的形状
改变，并据此判断两药联合药敏试验的结果