抗菌药物敏感性试验
抗菌药物敏感性试
• 在贴条过程中， 90mm 平皿只能贴 2 条，同时不同的试纸条高浓度 的一段应该向背；若贴 2 条含有酶抑制剂的试条应将含有酶抑制剂的 一端贴在同一侧。 • 贴条注意事项：试条事先恢复室温： 10 分钟左右。 • 试条的数量与角度： 4-6 条、 1-2 条。 • 贴条的时间：平皿多余水分已经消失。 • 试条的方向：高浓度端向外。 • 贴条的动作：平稳、流畅、不拖拉。 • 气泡的处理：尽量向一端赶。 • 3.孵育同 K-B 法 • 注意孵育时间、环境温度及酸碱度。 • 读数原则：杀菌剂读清晰的边缘见图 1 ，抑菌剂读大菌落与小菌落的 交界见图 2 。变形杆菌读最小的 MIC 值，后两张为含酶抑制剂抗生 素的测试结果。
抗菌药物敏感性试验规范化 卫生部北京医院 艾效曼
•
学习目标 1 、了解抗菌药物敏感性试验的意义、我国抗菌药物敏感性试验应遵循的规 则。 2 、掌握纸片扩散法和 E 试验原理，牢记试验的操作步骤及各步骤中的注意 事项，在日常工作中进行规范化的操作。
• • • • • •
抗菌药物敏感性试验的意义是什么？我国抗菌药物敏感性试验应遵循哪些规 则？ 一、基本内容 药敏试验的意义： （一） 药敏试验的意义： 1.查出耐药，减少治疗错误，便于医生选择个体化疗方案、节省费用。 2. 进行 耐药监测 ，为医院感染控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠 依据。 3.利用耐药监测结果控制抗菌药物应用，减少耐药菌株的出现，延长新药使 用寿命。 4. 为新药的研究和评估提供有价值的信息。 ）、药物敏感试验规则 （二）、药物敏感试验规则
• • • •
• • • •
目前世界上通用的规则是德国和欧洲标准，而我国主要以临床试验室标准化 委员会（ CLSI ），即美国国家实验室标准委员会 (NCCLS) 的规则为标准， 这个标准主要包括 CLSI 纸片扩散法（ M2 ）和需氧菌稀释法（ M7 ）。 ）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 （三）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 1.标准的正确使用 M100 – 即新表 M100-S17 ，每年更新 1 次；包括 M2 和 M7 文件， M2 – 即 纸片扩散法 (DD) 文件 M2-A9 ， M7 – 即 MIC 文件 M7-A7 。 M2 、 M7 文 件每 3 年更新一次 ；使用文件时应注意文件是否已更新，避免使用旧文件造 成判断结果失误。 2.获得文件的方法 如果购买厂家的纸片可向厂家索取标准，每年国际化会议也会颁发此文件的 中心内容。 表内容： （四）、 CLSIM-100 表内容： CLSIM-100 表主要包括版本中的更新要点、各版本抗菌药物分组、 M2 纸片 扩散法用的表、 M7 MIC 用的表、 M7 MIC 用的表及词汇表等内容。
4.抗菌药物的敏感性试验
肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异
噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨苄西林
不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、环丙沙 星、米诺环素； 洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺 胺异噁唑 、美罗培南 ；
嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ；
嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢
他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛；
淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、
四环素 ；
肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ； 除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置3~10分钟 后贴上标准抗生素纸片。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素
100μ l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交
四抗菌药物敏感性试验
四、抗菌药物敏感性试验（一）药敏试验的目的测定病原微生物对化学治疗药物敏感性的试验称为化疗药物敏感性试验（Drug sensitivity test），简称药敏试验。
药敏试验的主要目的是：①用于测定新的抗菌药物或制剂的抗菌谱；②对病灶分离菌进行流行病学调查，主要应用于测定细菌经过多年后敏感性的变化情况和地区特异性；③在临床治疗感染性疾病时，针对病原菌选择合适的首选药物品种。
（二）药敏试验的原理及种类药敏试验是通过培养基培养的细菌确定细菌对药物的敏感性方法。
将被检菌接种在适当的培养基上，然后加上不同种类或不同浓度的抗菌药物（或制剂），观察细菌生长发育的速度和程度。
用药后，细菌在培养基上停止生长并且死亡，抑菌圈清晰，说明细菌对药物敏感，药物表现有较强的杀菌作用；用药后，细菌停止生长，但液体培养基经过一定时间后还可能出现浑浊或固体培养基上的抑菌圈不清晰，说明细菌对药物比较敏感，预示药物对被检细菌只是起抑菌作用。
通常判定一种药物对细菌的杀菌或抑菌作用的强度指标是固体培养基中抑菌圈的大小，但这也不是绝对的，因为抑菌圈的大小与药物对培养基的渗透性是密切相关的。
药敏试验方法较多，但在原理上不外乎是稀释法和扩散法两大类。
而扩散法（包括纸片法、管碟法）通常适用于临床治疗选择药物。
（三）常用培养基制作法1．普通肉汤培养基牛肉浸膏 3.0克蛋白胨 10.0克氯化钠 5.0克蒸馏水 1000毫升放在三角烧瓶中，微温溶解后，调节pH值至7.4~7.6，煮沸10分钟，冷却后的pH值为7.2±0.2。
15磅压力下灭菌15分钟（115℃灭菌30分钟）即得。
本培养基可用作为固体、鉴别、选择等培养基制造的基础原料，大部分细菌都能在其中生长。
1．普通肉汤琼脂培养基照上述普通肉汤培养基的配方及制法，加入15~20克琼脂，加热溶解后，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
3．0.5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨 10克氯化钠 5克葡萄糖 5克牛肉浸膏 3克蒸馏水 1000毫升微温溶解后，调节pH值至弱碱性，煮沸后，加葡萄糖溶解，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
抗菌药物敏感试验
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
药敏试验的意义
1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导临床抗菌药物的使用 3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使 用抗菌药物 4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和 控制耐药菌感染的发生和流行
抗菌药物的敏感性试验
常用方法：
抗菌药物敏感性实验及细节耐药检测
抗菌药物敏感性实验与细节耐药性监测来源：查验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感实验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer实验，是操作最简易、利用最普遍的抗菌药物敏感性实验。
1．实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。
2．培育基和抗菌药物纸片(1)培育基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培育基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培育基，pH值为～，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配制琼脂平板当天利用或置塑料密封袋中4℃保留，利用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方式使每片含量达到规定所示。
含药纸片密封贮存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保留，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过l周。
利用前将贮存容器移至室温平衡l～2h，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方式。
用麦氏比浊标准的菌液浓度。
校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。
接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感实验结果应孵育24h。
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药 检测方法介绍
纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等
抗菌药物敏感性试验
南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心
教学对象： 教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生 实验课时： 实验课时：4学时 课程类型： 课程类型：专业实验课 课程要求： 课程要求：必修 每组人数： 每组人数：2人
实验目的和要求
掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作 方法等、结果判断、意义及质量控制； 熟悉肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、 操作方法、结果判断及意义等； 了解稀释法的质量控制。
纸片含药量 抗菌药物 青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药 10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg 耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10 抑菌圈直径(mm) 抑菌圈直径(mm) 中介 — 11～12 11～ — 13～ 13～14 14～ 14～22 15～ 15～20 11～ 11～15 敏感 ≥29 ≥13 ≥15 ≥15 ≥23 ≥21 ≥16 相应MIC值 (μg/ml) 相应MIC值 MIC 耐药
结果判读：
用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI （Clinical and Laboratory Standards Institute）标准判读结果； 报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐药（resistant，R）； 还是中介（intermediate，I）。
表1 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果
β-内酰胺酶
敏感 ≤0.12 ≤2 ≤4 ≤4 ≤0.5 ≤0.5 ≤2/38
≥4 — ≥8 ≥8 ≥4 ≥8/152
三、肉汤稀释法
原理：
以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素 做不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定 量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度 （MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。
方法：
方法：
菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至 0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到 107CFU/ml； 加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低 到高加于各排试管中，其最终的接种量为 5×105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照 管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照 管加质控菌液。 孵育：35C 24h观察结果。
二、纸片扩散法（K-B法） 纸片扩散法（ 法
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上， 纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周 围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度 范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该 药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。 ，
结果：
测试菌（或质控菌）不出现肉眼可见生长的 最低药物浓度为该药对测试菌（质控菌）的 MIC。
注意事项：
培养基、接种细菌的菌量、抗菌药物纸片的质 量、孵育温度和观察时间、操作是否规范等均 能影响本试验的结果。 为保证结果的可靠性，需同时采用相应标准菌 株同时进行药敏试验作为质量控制的方式。
含药纸片
抑菌圈
方法：
菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于 生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准； 涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多 余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转 平板60，最后沿平板内缘涂抹1周； 贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子 将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于 24mm，纸片距平板内缘应大于15mm； 孵育：35C 16-18h，量取抑菌圈直径。