腹水抗体制备一般流程
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
抗体的制备
第四节、单克隆抗体技术
一、单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)是由 B细胞杂交瘤产生的只识别抗原分子上一种抗 原决定族的抗体分子。 二、杂交瘤技术的原理：利用聚乙二醇(PEG)作 为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞(能分泌某 种抗体的B细胞)与具有在体外不断繁殖能力的 小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT培养基的选 择作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长， 经过反复的单个细胞培养(克隆化)，最终获得 既能产生所需抗体、又能不断繁殖的杂交瘤细 胞纯系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹 腔，在其后产生的腹水中含有高效价的单克隆 抗体。
利用聚乙二醇peg作为细胞融合剂使免疫的小鼠脾细胞能分泌某种抗体的b细胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体在hat培养基的选择作用下只让融合成功的杂交瘤细胞生长经过反复的单个细胞培养克隆化最终获得既能产生所需抗体又能不断繁殖的杂交瘤细胞纯系将这种细胞扩大培养接种于小鼠腹腔在其后产生的腹水中含有高效价的单克隆抗体
特异性抗体的制备
广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇
第一节免疫原的制备
• 一、颗粒性抗原的制备 1.细胞抗原的制备： A 新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细胞并配 制成2~5%,直接进行注射免疫。 B 新鲜血+抗凝剂— 4℃保存4W,免疫前取适量抗 凝绵羊血，按A处理。 C 新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。 2.细菌抗原的制备：取标准菌株，接种， H抗原:取有动力的菌株液,用0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h, Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶液。 3.虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫卵悬液。
2.常用佐剂的种类和制备： A铝乳：5%硫酸铝+5%NaOH，反应后NS 洗涤沉淀2次以上。1:1与抗原混合。 B明矾：硫酸钾铝在一定pH下产生氢氧化 铝胶体。制备方法是：Ag+NS,搅拌下缓 慢滴入10%的硫酸铝钾溶液，以NaOH校 正pH至6.5，离心、NS洗涤。 C福氏佐剂：福氏佐剂分为不完全佐剂(石 蜡油+羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油+羊毛脂 +卡介苗)。1:1与抗原混合研磨均匀即可。 但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉芽 肿和持久溃疡而不用于人体免疫。
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。
5ml ip (腹腔内注射)↓2~3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射)↓取脾融合2。
可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│（一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│（ip剂量不宜超过0。
5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2~3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是一种用来生成特定抗体的实验方法，用于检测、治疗和研究各种疾病。
以下是一种通用的抗体制备流程，包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等步骤。
首先，我们需要选择合适的抗原。
抗原是导致免疫反应的物质，通常是一种蛋白质。
抗体的选择性依赖于抗原的选择性，因此我们需要选择具有高选择性且易于纯化的抗原。
接下来，我们需要选择合适的免疫动物。
常见的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
选择免疫动物时，需要考虑抗原在动物体内的免疫原性、免疫系统的相似性以及免疫动物的体积等因素。
在选择好免疫动物后，我们需要对其进行处理。
通常情况下，我们会注射抗原到免疫动物体内，同时加入适当的免疫增强剂，以提高抗原的免疫原性。
接种后，我们需要在一定时间间隔内反复注射多次，以激发免疫反应。
在反复注射抗原后，我们需要等待一段时间，使得免疫系统产生足够多的抗体。
这个时间因免疫动物的类型和免疫原性而有所不同。
待免疫系统产生足够多的抗体后，我们需要将免疫动物进行牺牲，并从其体内获得免疫血清。
免疫血清是含有大量抗体的血液，在实验中可以用来检测和纯化抗体。
获得免疫血清后，我们需要对其进行抗体的制备和纯化。
首先，我们可以通过离心等方法去除血液中的红细胞等非细胞成分。
接下来，我们可以采用亲和层析和凝胶过滤等方法，将目标抗体从血液中纯化出来。
在纯化抗体后，我们可以对其进行鉴定和评估，以确保其质量和活性。
常用的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blotting等。
最后，我们可以将纯化的抗体用于实验中。
抗体可以用于检测特定抗原的存在，也可以用于治疗疾病，比如单克隆抗体疗法。
总结起来，抗体制备流程包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等多个步骤。
这一流程需要耗费一定的时间和资源，但是通过这一流程我们可以获得高质量和高选择性的抗体，从而用于检测、治疗和研究各种疾病。
(五)单克隆抗体的制备和冻
选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度 越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的 降低，而冻存在-70℃ 降低，而冻存在-70℃冰箱则活性改变较快。细胞 不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜 （DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞 DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞 复苏后的活性多在50%～95%之间。如果低于 复苏后的活性多在50%～95%之间。如果低于 50%，则说明冻存复苏过程有问题。 50%，则说明冻存复苏过程有问题。
（五）单克隆抗体的制备和冻存
筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因 为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染色体丢 失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。 一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在 培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设 备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的 浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选 用BALB/C小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石 BALB/C小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石 蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小 鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产 生，每只小鼠可收集5 10ml的腹水, 生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水,有时甚至超过 40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数 40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数 毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也 较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当， 一般为5 一般为5×105 ／鼠，
制作抗体的步骤
制作抗体的步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲制作抗体这神奇的事儿。
你想想，抗体就像是我们身体里的小战士，专门对付那些坏家伙呢！要制作抗体呀，首先得有个合适的“战场”，也就是培养环境。
这就好比给小战士们准备一个舒适的营地，让他们能好好成长和战斗。
这个环境可得精心打造，温度、湿度啥的都得恰到好处，不然小战士们可不乐意好好干活儿哟！然后呢，得有原料呀！这原料就像是给小战士们准备的武器和粮草。
细胞啦、营养物质啦，一个都不能少。
就像我们做饭得有食材一样，没有这些东西，怎么能做出厉害的抗体呢？接下来，就是让这些原料在合适的条件下慢慢“发酵”啦！这过程就像是酿酒，得等时间慢慢过去，才能有美味的酒出来。
在这个过程中，细胞们会慢慢发生变化，逐渐成长为能制造抗体的“大部队”。
等啊等，盼啊盼，终于到了收获的时候啦！就像农民伯伯收获庄稼一样，我们要把这些辛苦培养出来的抗体收集起来。
这可不是一件容易的事儿呢，得小心翼翼的，可不能把这些宝贝给弄坏了。
你说这制作抗体的过程是不是很神奇呀？就像变魔术一样，从一些普普通通的原料里变出了能保护我们身体的抗体。
这当中需要多少的耐心和细心呀！想象一下，如果没有这些抗体，我们的身体该多容易受到那些病菌的侵害呀！所以呀，那些研究制作抗体的科学家们可真是太了不起啦！他们就像是超级英雄，默默地守护着我们的健康。
咱平时可能觉得抗体离我们很远，但其实它们就在我们身体里，为我们的健康努力战斗着呢！我们可得好好爱护自己的身体，让这些小战士们能更好地发挥作用呀！这就是制作抗体的过程啦，虽然我说得简单，可实际操作起来那可是相当复杂和精细的呢！但就是因为有了这么多厉害的人在努力，我们才能享受到健康的生活呀！是不是很厉害呢！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
抗体制剂工艺流程
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抗体的制备
单抗：过程：单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
(1)抗原制备。
(2) 免疫动物的选择。
(3)免疫程序的确定。
（免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。
最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。
在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。
）2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
抗体制备方案
抗体制备方案
抗体制备方案是研究生物学、医学等领域中非常重要的一项技术。
下
面详细介绍抗体制备方案。
1.选择抗原
抗原选择是制备抗体的第一步。
抗原即引起免疫反应的物质，通常为
蛋白质，如细胞膜分子、酶、激素等。
抗原的选择要考虑不同物质的
特点、来源、纯度及获得的难易程度等。
2.制备抗原
所选抗原需要制备出较高的纯度、稳定性和适宜质量的形式。
主要包
括重组蛋白、天然蛋白的纯化等。
3.免疫动物的选择
免疫动物是指对抗原产生免疫反应后，能产生抗体的动物。
通常选择
小鼠、兔子、山羊等作为免疫动物。
4.制备免疫血清
将抗原与佐剂混合后注射到免疫动物体内，使其产生针对抗原的抗体。
经过数次免疫注射后，采集动物的血清就能得到含有高水平抗体的免
疫血清。
5.纯化抗体
从免疫血清中纯化丰度高的抗体非常重要，用于检验、诊断和治疗。
该步骤可通过离体培养细胞、亲和层析、电泳、ELISA等多种方法进行。
总之，抗体制备方案具备严谨性和实践性，制备出高效高纯的抗体对
广大生命科学领域有着重要意义。
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腹水抗体制备(实验室级别)
2012-8-27
一、实验原理：
将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水
瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。
二、实验材料：
药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水
仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机
三、制备步骤：
1.打石蜡
在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以
促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；
2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养
(1) 12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。
(2) 按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min左右，快速
融化冷冻的杂交瘤细胞。
(3) 将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后平衡EP管，
800rpm，8min，进行离心。
(4) 将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞液吸出，
按1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景
是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。
3.杂交瘤细胞收集与注射
(1) 待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁细胞脱落，
然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心，
(2) 吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条件再次离
心，弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/
只，注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命
状态，防止小鼠死亡。
4.腹水收集
(1) 取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹部上皮，
撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，
再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为
腹水抗体。
(2) 正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。抗体浓度0.5-5mg/ml。按1ml/管，用1.5mlEP
管分装后放-80℃冻存。
5.抗体纯化
(1) ProteinG亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积以洗掉乙
醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。
(2) 上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。
(3) 洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显色反应为止。
(4) 洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰(1-6管)，洗脱液立即用
中和缓冲液中和到中性。
(5) 平衡层析柱：立即用5-10个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。
(6) 再生：再生缓冲液流洗2-3个柱床体积。
(7) 保存：先后用平衡缓冲液、20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积。层析柱内保留适当体积
的20%乙醇，置于4~8℃保存。