仪器分析-可见吸光光度法
仪器分析实验一多组分分光光度法
仪器分析实验多组分分光光度法【实验目的】掌握可见吸收分光光度计的工作原理掌握并验证朗伯-比耳定律用可见吸收分光光度法测定样品的吸收曲线和摩尔消光系数。
【实验原理】根据Beer-Lambert定律，溶液对于单色光的吸收，遵守下列关系式:(1)式中A为吸光度；I / I。
为透光率; k为摩尔吸光系数，它是溶液的特性常数；I为被测溶液的厚度；c为溶液浓度。
在分光光度分析中，将每一种单色光，分别、依次地通过某一溶液，测定溶液对每一种光波的吸光度，以吸光度A对波长入作图，就可以得到该物质的分光光度曲线，或吸收光谱曲线，如图1所示。
由图可以看出，对应于某一波长有一个最大的吸收峰，用这一波长的入射光通过该溶液就有着最佳的灵敏度。
从（1）式可以看出，对于固定长度吸收槽，在对应最大吸收峰的波长（入）下测定不同浓度c的吸光度，就可作出线图1分光光度曲线性的A〜C线，这就是光度法的定量分析的基础。
以上讨论是对于单组分溶液的情况，对含有两种以上组分的溶液，情况就要复杂一些。
1）若两种被测定组分的吸收曲线彼此不相重合，这种情况很简单，就等于分别测定两种单组分溶液。
2 ）两种被测定组分的吸收曲线相重合，且遵守Beer-Lambert定律，则可在两波长入1及入2时（入1、入2是两种组分单独存在时吸收曲线最大吸收峰波长）测定其总吸光度，然后换算成被测定物质的浓度。
根据Beer-Lambert定律，假定吸收槽的长度一定，则对于单组分A T A} = 对于单组分艮去=K；C B j设型"，分别代表在A,及A2时混合溶液的总吸光度■则A 严=與 + 碱=K^C A + K?C B(3)此处「、从2、A B x 1、A B x 2分别代表在入1及入2时组分A 和B 的吸光度。
由（3）式可得:—屁—（5）这些不同的K 值均可由纯物质求得， 也就是说，在纯物质的最大吸收峰的波长 入时，测 定吸光度A 和浓度c 的关系。
如果在该波长处符合贝尔一郎比定律，那么 A 〜C 为直线，直线的斜率为K 值，’是混合溶液在 入1、入2时测得的总吸光度，因此根据 （5）、（6）式即可计算混合溶液中组分 A 和组分B 的浓度。
吸光光度法
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅 样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
T－透光率（透射比）（Transmittance）
T=
A 吸光度
It I0
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT
I I-dI I0
朗伯定律(1760)
It
s
b dx
A=lg(I0/It)=k1b
比尔定律(1852)
A=lg(I0/It)=k2c
A=lg(I0/It)=kbc
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及 某些化学反应平衡常数的测定
光吸收曲线
有色溶液对各种波长的光的吸收情 况，常用光吸收曲线来描述。将不 同波长λ的单色光依次通过一定的 有色溶液，分别测出对各种波长光 的吸收程度（即吸光度，用字母A 表示）。以波长λ为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，所得的曲线称为 吸收曲线或吸收光谱曲线。
准确度高
依据化学反应, 使用玻璃仪器
仪器分析：微量组分(<1%), Er 1%～5% 灵敏度高 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器
吸光光度分析法是以物质对光的选择 性吸收为基础的分析方法。根据物质 所吸收光的波长范围不同，吸光光度 分析法又有紫外、可见及红外分光光 度法。本章重点讨论可见光光度法 （又称分光光度法，简称光度法）。
《现代仪器分析教学课件》2.紫外-可见吸收光谱法
C. π→π*：发生在近紫外线区 ~200nm
CH2=CH2：λmax=165 nm 、CH≡CH：λmax=173 nm 但是随着共扼体系的增大或杂原子的取代， λmax向长波移 动;εmax≥104，是强吸收带。
4．E带：由苯环环形共轭系统的π→ π*跃迁产生 ✓ 芳香族化合物的特征吸收带 。 • E1 180nm εmax>104 （常观察不到） • E2 200nm εmax=7000 强吸收 • 苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并
一起红移（长移）
影响吸收带位置的因素：
主要是溶剂极性对λmax的影响； n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移 π-π*跃迁：溶剂极性↑ ，λmax↑红移 对吸收光谱精细结构影响 溶剂极性↑，苯环精细结构消失
共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑
C. 羰基化合物： n →π* (R 吸收带)、n→ σ*、 π→π*
醛、酮: n →π* λmax~ 270~300 nm ε max~10-20
羧酸及其衍生物: n →π* 存在助色团：-OH、-OR、-NH2、-Cl
形成 n →π共轭， π轨道能量降低，π* 轨道能量升高 n 轨道能量不受影响，因此 n→π* 蓝移 λmax~210nm
减色
λ
2.3.3 吸收带类型和影响因素
吸收带：相同跃迁类型所产生的吸收峰。
1．K带：由共轭双键的π→ π*跃迁产生 (—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—
• λmax 217~280nm，εmax>104 • 共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑ • K 吸收带是共轭分子的特征吸收带，可用于判断共
仪器分析 10.1紫外可见分光光度法 图文
61-19
二、UV光谱的有关知识和概念
2、物质吸光的程度表达
辐射功率P：单位时间内所传输的能量， 光度法中用光强 I 代替。 透过率 T：透过光与入射光强度的比值 吸光度 A :
I T
I0
A lgT lg IO I
2020年9月13日星期日 上一内容 下一内容
61-20
3、UV吸收光谱——吸收曲线
镧系元素：f-f 跃迁
二、UV光谱的有关知识和概念
1、物质吸光的选择性
M h I0 M * It h
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
分子轨道包括三种： 分子轨道能级的量子化：光吸收具有选择性 电子能级差：约为1～20ev（1250～60nm）
2020年9月13日星期日 上一内容 下一内容
一、分子轨道中的电子跃迁类型 二、UV光谱的常用概念 三、吸收带及其与分子结构的关系 四、影响吸收带的因素 五、物质对光的吸收与吸收曲线 五、朗伯-比尔定律
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61-3
练习：
下面五个电磁辐射区域
A：X射线区
B：红外区
C：无线电波
D：可见光区
E：紫外光区
请指出：
61-22
4、有关概念：
① 吸收带：吸收峰位置 ② 红移或长移 ③ 蓝移或短移 ④ 增色效应
减色效应
⑤ 强带 ε ≥104
弱带 ε ≤102
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61-23
⑥ 生色团（chromophore ）：含π→π* 、 n →π* 等跃迁的基团，即能产生UV吸收的 基团
61-12
5、电荷迁移跃迁
Charge transfer transition
吸光光度法
3. 快速简便。
4. 应用广泛。
一、光的基本性质
光具有波粒二象性，即波动性，粒子性.
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Sichuan Agricultural University
无机及分析化学
描述其波动性的主要参数是： 波长λ，频率 ，光速 c 三者间关系为： λ＝ c /
检测器
吸光度
0.44
光源
17
检测器
Sichuan Agricultural University
无机及分析化学
吸光度
0.00
吸光度与浓度的关系 A = bc
光源
检测器
吸光度
光源
0.22
b
检测器
吸光度
0.42
b
光源
18 上一页 上一页 下一页 下一页 本章目录 主目录 总目录
检测器
Sichuan Agricultural University
无机及分析化学
二、对朗伯-比尔定律的偏离
1. 物理因素 ① 单色光不纯，导致负偏差.
A
Hale Waihona Puke 正误差负误差标准工作曲线图
c
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无机及分析化学
28 上一页 上一页 下一页 下一页 本章目录 主目录 总目录
无机及分析化学
2. 物质对光选择性吸收
当白光通过溶液时，溶液吸收某些波 长的光，其余波长的光则透过。溶液呈现 的颜色正是透过这部分的光。
例：KMnO4吸收黄绿色光，因此KMnO4溶 液呈现紫色。 CuSO4吸收黄色光而其溶液呈蓝色。 各种物质对不同波长的光吸收程度不同.
仪器分析_紫外-可见分光光度和红外光谱法习题及参考答案
第三章紫外可见吸收光谱法一、选择题1、人眼能感觉到的可见光的波长范围是（）。
A、400nm～760nmB、200nm～400nmC、200nm～600nmD、360nm～800nm2、在分光光度法中，透射光强度(I)与入射光强度(I0)之比I/I0称为( )。
A、吸光度B、吸光系数C、透光度D、百分透光度3、符合朗伯-比尔定律的有色溶液在被适当稀释时，其最大吸收峰的波长位置( )。
A、向长波方向移动B、向短波方向移动C、不移动D、移动方向不确定·4、对于符合朗伯-比尔定律的有色溶液，其浓度为c0时的透光度为T0；如果其浓度增大1倍，则此溶液透光度的对数为( )。
A、T0/2B、2T0C、2lgT0D、5、在光度分析中，某有色物质在某浓度下测得其透光度为T；若浓度增大1倍，则透光度为( )。
A、T2B、T/2C、2TD、T1/26、某物质的摩尔吸光系数很大，则表明( )。
A、该物质溶液的浓度很大B、光通过该物质溶液的光程长C、该物质对某波长的光的吸收能力很强D、用紫外-可见光分光光度法测定该物质时其检出下限很低7、在用分光光度法测定某有色物质的浓度时，下列操作中错误的是( )。
A、比色皿外壁有水珠B、待测溶液注到比色皿的2/3高度处)C、光度计没有调零D、将比色皿透光面置于光路中8、下列说法正确的是( )。
A、透光率与浓度成正比B、吸光度与浓度成正比C、摩尔吸光系数随波长而改变D、玻璃棱镜适用于紫外光区9、在分光光度分析中，常出现工作曲线不过原点的情况。
与这一现象无关的情况有( )。
A、试液和参比溶液所用吸收池不匹配B、参比溶液选择不当C、显色反应的灵敏度太低D、被测物质摩尔吸光系数太大10、质量相等的A、B两物质，其摩尔质量M A＞M B。
经相同方式发色后，在某一波长下测得其吸光度相等，则在该波长下它们的摩尔吸光系数的关系是( )。
A、εA＞εBB、εA＜εBC、εA=εBD、2εA＞εB11、影响吸光物质摩尔吸光系数的因素是( )。
紫外可见分光光度法
光子能量与它的频率成正比，与波长成 反比，与光强度无关。光的波长越短
（频率越高），其能量越大。
单色光： 同一波长的光称为单色光； 复合光： 不同波长的光组成的光称为复合光； 可见光： 凡是被肉眼感受到的光称为可见光； 波长范围为400-780nm
复合光
单色光
物质颜色的产生
固体
反射蓝色光 吸收黄色光
互补色
液体
透过紫色光 吸收绿色光
二、 物质对光的选择性吸收
M + h 基态 E0 （△E） M* 激发态 E1
E1
激发态
E2
E = E1 - E0 = h =h c/λ λ=hc/ E
物质对光选择性吸收
E0
基态
E
例题
某分子中两个电子能级之间的能级差为1eV， 若要电子在两个能级之间发生跃迁，需要
是指分子中的一些带有非成键电子对的基团本身在紫外-可 见光区不产生吸收，但是当它与生色团连接后，增强生色团的 生色能力，使生色团的吸收带向长波移动，且吸收强度增大。 助色团为含有未共用电子对的杂原子基团：-OH、-Cl、-Br
C.红移与蓝移
有机化合物的吸收谱带常
常因引入取代基或改变溶剂使
最大吸收波长λmax和吸收强度 发生变化:
π→π*跃迁的λmax为170nm 。
（4）n→π*跃迁：分子中孤对电子和π键同 时存在时发生n→π＊ 跃迁。丙酮n→π＊ 跃迁的λmax为275nm。
（5）电荷迁移跃迁：分子本身具有电子给予
体和电子接受部分，外来辐射照射，电子从
具有给予体特性的部分转移到具有电子接受
体特性的部分所发生的跃迁。其谱带较宽，
思考
1、庚烷、环己烷等烷烃在200-400nm内有无吸收？
仪器分析实验5-紫外可见光谱分析
实验五色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的紫外吸收光谱分析一、实验目的1. 掌握紫外-可见分光光度计的工作原理和基本操作。
2. 掌握紫外-可见吸收光谱的绘制（包括导数光谱）以及定量测定方法。
3. 掌握。
4. 了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱特点。
二、实验原理1. 紫外-可见吸收光谱法测定蛋白质含量的基本原理紫外-可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，也称作紫外和可见吸收广度法，它包括比色分析法和紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。
电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。
当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。
图1 电子跃迁示意图物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度(A),然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。
当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I。
与透过光强度I之比的对数与该物质的浓度c及样品池厚度b成正比。
其数学表达式为:此式为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中A为吸光度。
由于不同物质具有不同的分子结构，对不同波长的光会产生选择性吸收，具有不同的吸收光谱，因而，我们可以利用紫外-可见吸收光谱法对物质结构进行鉴定和进行定量分析、根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围(150~800nm)单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。
氨基酸(amino acid)：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是蛋白质的基本组成单位。
氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。
20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区均有光吸收，而在近紫外区(220nm-300nm)只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是色氨酸(Try)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)因为它们的结构均含有芳香共轭π键系统。
仪器分析 (第三版 魏培海)第一章 紫外可见分光光度法
讨 论 T: 0.00％～100.0％。T=0.00%表示光全 部被吸收；T=100.0%表示光全部透过。 A: 0.00 ～ ∞ 。 A=0.00 表示光全部通过； A→∞表示光全部被吸收。
2. 朗伯-比尔吸收定律
当一束平行单色光垂直通过溶液时， 溶液对光的吸收程度与溶液浓度和液层 厚度的乘积成正比。
T = 0.398 摩尔吸光系数： A 0.400 3 1.33 10 L / mol cm 3 cb 0.15 10 2.00 1.33 103 5.30 L / g cm 质量吸光系数： a M 251
4. 朗伯-比尔定律的偏离现象
原 因 朗伯-比尔定律的局限性: 浓度不高的溶液； 非单色入射光引起的偏离: 仪器因素； 溶液本身发生化学变化引起的偏离 。
第一章
紫外可见分光光度法
利用物质对紫外可见光的吸收特征和 吸收强度，对物质进行定性和定量分析的 一种仪器分析方法。在化工、医药、冶金、 环境监测等领域广泛应用。
“十二五”职业教育国家规划教材
仪器分析
（第三版）
魏培海 曹国庆 主编
第一章 紫外可见分光光度法
“十二五”职业教育国家规划教材
知识目标
• • • • • 了解紫外可见吸收光谱的产生 理解化合物电子能级跃迁的类型和特点 熟悉紫外可见分光光度计的工作原理 掌握光吸收定律的应用及测量条件的选择 掌握紫外可见分光光度法在定量分析中的 应用
1. 光强度、透光率和吸光度
术语 光强度 透光率 定义 单位时间(s)、单位面积(1cm2）上辐射 光的能量，与光子的数目有关。 透射光强度与入射光强度的比值（It/I0） 符号 I0:入射 It:透射 T
吸光度
透光率的负对数 -lg(It/I0）
吸光光度法
显示装置
6.2
光度分析法的设计
1 显色反应（color reaction）
待测物质本身有较深的颜色，直接测 定；待测物质是无色或很浅的颜色，需 要选适当的试剂与被测离子反应生成有 色化合物再进行测定，此反应称为显色 反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。
6.2
光度分析法的设计
苯 (254nm) A 甲苯 (262nm)
230
250
270
苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱
6.1 概述
在可见光，KMnO4溶液 对波长525 nm附近绿色光 的吸收最强，而对紫色和 红色的吸收很弱。λmax= 525 nm。浓度不同时， 光吸收曲线形状相同， λmax不变，吸光度不同。
光吸收程度最大处的波 长，称为最大吸收波长， 常用λ最大或λmax表示， 任何可见光区内、溶液 的颜色主要是由这个数值决定的。
6.1 概述
溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm
吸收光
颜色
400-450 450-480
480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
紫 蓝
绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
黄绿 黄
橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
6.1 概述
其实，任何一种溶液．对不同波长的光的吸收
程度是不相等的。如果将某种波长的单色光依 次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各 种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸 光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光 谱曲线或光吸收曲线。它清楚地描述了溶液对 不同波长的光的吸收情况。