循环肿瘤细胞检测分子标志物的研究现状及进展

医学研究杂志２０１２年９月　第４１卷第９期　・特别关注・　循环肿瘤细胞检测分子标志物的研究现状及进展　安娟　刘晓晴　循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）指　自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周　血循环的肿瘤细胞。这些进入循环的肿瘤细胞大部　分在机体免疫识别及杀伤等作用下发生凋亡，极少数　存活下来形成微小癌栓，在一定条件下发展为转移　灶。早在１８６９年，托马斯・阿什沃思（Ｔｈｏｍａｓ　Ａｓｈ—　ｗｏｒｔｈ）在１例转移性癌症患者血液中观察到了循环　肿瘤细胞，此后１００多年ＣＴＣｓ研究领域一直无进展。　直到近年来由于人们广泛认识到ＣＴＣｓ是恶性肿瘤　患者出现术后复发和远处转移的重要原因，即成为众　多学者研究的热点。如今ＣＴＣｓ检测的价值已经在　转移性乳腺癌、转移性结肠癌、转移性前列腺癌中被　证实　。因此也分别于２００４、２００７、２００８年先后通　过ＦＤＡ批准应用于预测有转移性的乳腺癌、结直肠　癌或前列腺癌的无进展生存期（ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ，　ＰＦＳ）和总生存期（ｏｖｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ，ＯＳ）。此外，ＣＴＣｓ亦　在肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、胰腺癌、胃癌　等肿瘤中开展探索研究，且大部分是通过患者外周血　ＣＴＣｓ计数结果来协助病情的临床评估和预后判断。　而利用ＣＴＣｓ进行分子标志物检测方面的研究相对　较少，本文综述了近年来通过外周血循环肿瘤细胞检　测分子标志物的现状和进展。　

一、

检测ＣＴＣｓ分子标志物的意义和必要性　

随着医疗技术的发展，肿瘤个体化治疗已成为主　流，基因检测也已从实验室走进了临床实践，在肺癌　领域，表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅ．　ｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）基因状态指导个体化治疗模式的建立　标志着一个新时代的开始。然而，现实中无论是乳腺　癌的人类表皮生长因子受体２（ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａ１．　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ一２，ＨＥＲ一２）还是肺癌的ＥＧＦＲ　或者消化道各种分子标志物，其基因检测及其应用均　面临诸多困境：①既往绝大多数肿瘤分子学研究都是　

基金项目：北京市科技计划项目（ｚ１２１　１０７００１０１２０７９）　作者单位：１０００７１北京，军事医学科学院附属医院　通讯作者：刘晓晴，电子信箱：Ｌｉｕｘｑ＠ｍｅｄｍａｉｌ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　

在通过手术获取肿瘤组织的基础上进行的，对于各种　原因导致不能手术的肿瘤患者来说，足量的组织样本　获取困难，若通过活检获取，有可能获得的组织标本　不足或假阴性，分子学诊断难以进行；②大部分肿瘤　患者初诊时获取的组织标本并不能实时反映现时的　肿瘤生物学状态，因为在药物、环境等外部因素的影　响之下，肿瘤的基因组很可能处在不断变化之中，这　样以某个时间点肿瘤组织的基因突变状态来指导患　者在其他时间点的靶向药物治疗显然是不合适的；③　获取肿瘤组织为有创操作，很难用于常规反复检查；　④通过胸腹腔积液、痰液等体液标本检测肿瘤标志物　或许可行，但并非每个患者均有此类标本，并且由于　标本的生成来源多样，极可能出现假阴性。所以。简　单无创地获得ＣＴＣｓ并服务于个体化诊断及治疗已　受到越来越多的关注。由于脱落人血的ＣＴＣｓ可以　给我们提供潜在的实时肿瘤标本，近年来许多学者积　极尝试和探索外周血ＣＴＣｓ补充或代替组织标本进　行生物标志物特征检测的可行性及临床意义。　二、采用ＣＴＣｓ进行分子标志物检测的可行性　１．技术方法的可行性：从技术方面来说，由于　ＣＴＣｓ数目在外周血中极少，捕获ＣＴＣｓ存在诸多困　难，因此一直成为阻碍ＣＴＣｓ研究的原因，直到近年　来新建立的ＣＴＣｓ检测／收集技术为这一难题的解决　提供了可能。目前进行外周血循环肿瘤细胞分子检　测的主要步骤是：捕获ＣＴＣｓ，提取其ＤＮＡ或ＲＮＡ，再　进行相关基因的检测。由于ＣＴＣｓ在外周血中的含　量较低，在检测之前一般需对其进行富集。富集所依　据的原理主要分为４类：①细胞大小（过滤膜）；②细　胞密度（密度梯度离心）；③细胞表面蛋白［ＥｐＣＡＭ　和（或）ＣＤ４５一］；④侵袭能力（对荧光介质的黏附和　侵袭）。富集到的ＣＴＣｓ可以通过免疫荧光、聚合酶　链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）等手段进　行鉴定。上述富集手段中，应用较多的是通过Ｅｐ．　ＣＡＭ（上皮黏附蛋白）的磁性分选。利用这一原理进　行ＣＴＣｓ富集检测的Ｃｅｌｌ　Ｓｅａｒｃｈ系统是目前唯一可　以实现ＣＴＣｓ半自动化检测的系统，也是目前唯一通　・，７・　・特别关注・　过ＦＤＡ（美国食品及药物管理局）认证的ＣＴＣｓ检测　系统　，同原理的检测系统还有ＣＴＣ—ｃｈｉｐ　。提取　ＤＮＡ方法可以选择浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽　提法、水抽提及其改良法以及与这些方法同原理的试　剂盒提取技术等。提取ＤＮＡ后进行分子标志物的检　测则根据具体标志物的检测技术而定，如通过免疫组　化（ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）、荧光原位杂交（ｆｌｕｏ—　ｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）、显色原位杂交　（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＣＩＳＨ）等方法检测　ＨＥＲ一２，通过ＤＮＡ测序、ＰＣＲ、扩增阻滞突变系统　（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ）等方　法检测ＥＧＦＲ。通过上述技术方法可以进行ＣＴＣｓ的　分子标志物状态检测，目前已开展于乳腺癌、肺癌等　肿瘤领域，并获得一定结果支持这些技术方法的可行　性。　２．ＣＴＣｓ检测分子标志物的临床意义：（１）ＣＴＣｓ　分子特征可反映组织分子特征：在肺癌领域，Ｍａ－　ｈｅｓｗａｒａｎ等　采用蝎形扩增阻滞突变系统（ｓｃｏｒｐｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ＳＡＲＭＳ）检测　２７例接受吉非替尼治疗的转移性非小细胞肺癌（ｎｏｎ　～ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）患者的ＣＴＣｓ、血浆　游离ＤＮＡ及肿瘤原发组织中ＥＧＦＲ的突变状态，并　分析了其与预后的相关性。结果显示：在１２例肿瘤　组织携带ＥＧＦＲ基因突变的ＮＳＣＬＣ患者中，其中１１　例（９２％）患者外周血ＣＴＣｓ也检测到ＥＧＦＲ突变，仅　４例（３３％）患者外周血中游离ＤＮＡ检测到ＥＧＦＲ突　变。说明与血浆ＤＮＡ检测ＥＧＦＲ突变相比，ＣＴＣｓ与　组织有更高的吻合率。该研究在一定程度上证实了　外周血ＣＴＣｓ分子标志物状态与肿瘤组织有较高的　一致性，从而说明采用ＣＴＣｓ检测肿瘤分子标志物的　可行性及优点。乳腺癌方面，Ｓｈｅｎｇ等　采用共聚焦　显微镜定量分析来进行单个肿瘤细胞ＨＥＲ一２表达　的评估，以此来研究乳腺癌患者ＣＴＣｓ中ＨＥＲ一２的　表达及临床意义，得出了ＣＴＣｓ中ＨＥＲ一２（３＋）者预　示肿瘤组织中ＨＥＲ一２极有可能高表达的结论，并且　发现通过共聚焦显微镜进行ＨＥＲ一２检测与实时　ＰＣＲ、免疫印迹分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ＷＢＡ）、　ＦＩＳＨ分析结果有高度的一致性。该研究在证明采用　共聚焦显微镜检测ＣＴＣ的ＨＥＲ一２过表达的有效性　的同时，亦预示了ＣＴＣｓ代替肿瘤组织进行分子学检　测的可行性。同样，Ｐｉｎｚａｎｉ等＂　采用基于肿瘤细胞　大小的分离法（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ，ＩＳＥＴ）获取ＣＴＣｓ后，提取其ＤＮＡ研究ＨＥＲ一２　・Ｒ・　的扩增水平，结果选取的７例ＨＥＲ一２阳性患者，其　ＣＴＣｓ和病理组织切片中ＨＥＲ一２的扩增水平均显示　出良好的一致性。该研究虽然样本量小，却较显著地　提示了ＨＥＲ一２阳性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞　ＨＥＲ一２状态与肿瘤组织中ＨＥＲ一２呈正相关，其结　论可以作为ＣＴＣｓ代替肿瘤组织进行分子生物学检　测可行性的又一个参考。笔者认为，采用ＣＴＣ检测　分子标志物的优势在于：①实时、动态，能够随时监测　患者基因组的变化；②ＤＮＡ明确来自于肿瘤细胞，能　够避免假阴性结果；③简便、微创，可以扩大检测适应　征范围，使更多患者临床获益。然而，由于技术的不　成熟及方法的欠缺，采用ＣＴＣｓ进行分子标志物检测　在许多肿瘤领域至今尚未开展或研究甚少。相对而　言，采用循环肿瘤细胞进行分子标志物检测的研究在　乳腺癌中开展最早，也较为成熟。（２）临床预后判　断：ＨＥＲ一２阳性乳腺癌患者属于高风险人群，在疾　病早期便可考虑给予曲妥珠单抗治疗，但对于早期病　灶小或原发灶不明确、无法获取足够肿瘤组织的患　者，其ＨＥＲ一２检测无疑是个难题。那么如果通过　ＣＴＣｓ检测ＨＥＲ一２状态，以此来替代或补充组织学　检测是否具有同样的预后意义呢？Ｇｎａｔｉａｄｉｓ等　为　了评估乳腺癌ＣＴＣｓ的分子检测的预后意义，对１７５　名早期乳腺癌患者进行了３种分子标志物ＣＫ１９、　ＭＧＢ１以及ＨＥＲ一２检测，通过单因素及多变量分　析，结果发现化疗前外周血ＣＫ１９　ｍＲＮＡ（＋）或　ＭＧＢ１　ｍＲＮＡ（＋）者预示了差的无瘤生存期（ｄｉｓｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ，ＤＦＳ）。而ＨＥＲ一２　ｍＲＮＡ（＋）细胞虽然　在多因素分析中未发现其独立预后作用，但在单因素　分析中亦预示了短的ＤＦＳ。之后，Ａｐｏｓｔｏｌａｋｉ等　采　用巢式反转录酶一聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ．　ｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．ＲＴ—ＰＣＲ）法对２１６　名早期乳腺癌患者ＣＴＣｓ的ＨＥＲ一２　ｍＲＮＡ进行了检　测及分析，结果提示ＨＥＲ一２　ｍＲＮＡ阳性者可独立预　后短的ＤＦＳ及ＯＳ。另外，在一项对２１４例早期乳腺　癌患者的研究中，亦发现化疗后的ＣＴＣｓ　ＨＥＲ一２阳　性者有较短的无病间歇期（ｄｉｓｅａｓｅ—ｆｒｅｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌ，　ＤＦＩ）　ｌｏ］。总之，ＣＴＣｓ的分子学状态可作为早期乳　腺癌患者一个有价值的预后指标。这样，早期乳腺癌　患者的预后不仅可以通过获取肿瘤组织检测来进行　判断，亦可以通过非侵袭性的ＣＴＣｓ分子标志物检测　来协助评估。尤其对于因某些原因无法获取肿瘤组　织的患者，通过外周血ＣＴＣｓ及其分子标志物检测，　可以较早判断复发转移风险及制定相关治疗方案。