循环肿瘤细胞CTC检测
循环肿瘤细胞(CTC)的富集与检测
循环肿瘤细胞(CTC)的富集与检测循环肿瘤细胞(CTC)的富集与检测上海优宁维生物科技有限公司1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观看到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，领先提出了循环肿瘤细胞（CTC）的概念。
多数肿瘤几乎都会通过血液传播到身体的其他器官，癌细胞远端转移是导致肿瘤患者死亡的主要缘由，因此早期发觉血液中的肿瘤细胞，对于患者预后推断、疗效评价和个体化治疗有着重要的指导作用。
随着讨论的深化，讨论人员鉴定出了更多的癌细胞生物标记物，如人类表皮生长因子受体2(HER2+)、表皮生长因子受体（EGFR）、类肝素酶（HPSE）和Notch1等。
之前报道称这四种生物标记物与癌细胞迁移相关，结合这四种标记物就能够特异的标记集中的癌细胞，并确定最终这些癌细胞所转移的位置。
大量试验证明循环肿瘤细胞的消失与乳腺癌患者的临床分期、及预后均亲密相关。
循环肿瘤细胞检测作为一种简洁的血液检测，可随时捕获并评估循环肿瘤细胞以确定转移性乳腺癌患者的预后。
大量讨论已经证明，CTCs检测将有助于乳腺癌复发转移监控、推断患者预后、指导术后帮助治疗等。
与淋巴结、骨髓相比，外周血标本易获得、创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为抱负的标原来源，大大提高了这一方法的应用价值。
而且CTCs不仅是肿瘤预后和猜测指标，也有可能成为药效学的生物标志物。
比如在药物治疗后1-2周，通过CTC的检测，临床医师就可以观看循环细胞数量的转变即可猜测治疗效果，效果不好的以准时调整方案，不必让患者停留在无效治疗中甚至死亡。
目前，美天旎公司为您供应富集和检测CTC的多种产品，如autoMACS Pro全自动磁性细胞分选仪、手动磁珠分选设备及CTC富集磁珠，让您的CTC讨论更便利和高效。
MACS分选用于肿瘤细胞的富集，有两种策略：?阳性分选：CK/CD326、ErbB-2、CD30或其它肿瘤特异性标志优点：特异，受操作和其它非特异性颗粒影响小缺点：不同类型的肿瘤细胞表达不同的标记物，选择某种标志时不是全部肿瘤均表达?去除分选：CD45磁珠去除白细胞，富集肿瘤细胞优点：掩盖面广，可以函概全部肿瘤缺点：阴性成分中含有多种其它细胞和颗粒针对不同类型的肿瘤细胞，我们供应各种肿瘤细胞富集和检测试剂盒：。
循环肿瘤细胞(CTC)全自动扫描与分析检测系统及临床检测方法[发明专利]
![循环肿瘤细胞(CTC)全自动扫描与分析检测系统及临床检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4aa6e4a4f7ec4afe05a1df4e.png)
专利名称：循环肿瘤细胞（CTC）全自动扫描与分析检测系统及临床检测方法
专利类型：发明专利
发明人：陈念永
申请号：CN201610439946.7
申请日：20160617
公开号：CN106153878A
公开日：
20161123
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种全自动化扫描和分析检测外周血循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)的设备，它包括：a、全自动正置荧光显微镜，荧光显微镜上配置有4种荧光滤色镜，4种荧光滤色镜分别是红色、绿色、橙色、蓝色荧光滤色镜；b、显微镜单细胞自动扫描与图像分析系统，所述系统包含扫描装置、相机、计算机以及图像控制及分析软件，所述软件包含红光曝光时间控制模块、绿光曝光时间控制模块、橙光曝光时间控制模块、蓝光曝光时间控制模块和细胞识别模块。
本发明还公开了一种全自动化扫描和分析检测循环肿瘤细胞的方法。
本发明检测设备、检测装置、检测方法可以有效、准确检测CTC，实现了自动化和标准化检测，误差小，成本低廉，临床应用前景非常优良。
申请人：陈念永
地址：610041 四川省成都市武侯区玉华村2号2单元7楼4号
国籍：CN
代理机构：成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)
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循环肿瘤细胞CTC检测 PPT
阴性富集流程图
全亚型、高效率、非依赖
通用于绝大部分实体肿瘤、非血源性循环稀有细胞的富集
我们的选择
imFISH
imFISH技术将基因水平的FISH技术与蛋白水平的 免疫荧光染色技术相结合,是兼具核遗传信息及细 胞形态改变的精准CTC鉴定分析方法。
技术优势： ➢ 核酸水平稳定性、灵敏度高（80％） ➢ 引入CD45染色，提高特异性（97％) ➢ 细胞计数、核型分析、表型分析、分子分型
便捷性
CTC只需采集少量外周静脉血便可进行检测，对人体基 本无创，取样便捷，适于动态连续性监测。
循环肿瘤细胞CTC临床应用方向
CTC临床重点应用：一、辅助诊断
判断病灶良恶性 无创便捷，发现早期隐匿转移
辅助传统TNM参考分期 提供适时诊断信息，实现精准治疗
辅助诊断
CTC检测应用于辅助诊断
诊断难
异常占位，良性? 恶性? 病灶位置不宜活检怎么办? 有创操作，是否有瘤细胞种植？
诊准难
肿瘤异质性的影响? 临床分期与病理分期不一致?如何针对肿瘤时空信 Nhomakorabea变化提供
即时诊断信息?
辅助诊断
CTC功能：
对尚未完善病理诊断的患者，CTC 可联合影像学、血清学作为辅助判断病灶良恶性的指标。 同时,CTC是对原发灶与转移灶信息的全面反映，可弥补现有传统TNM 分期的不足，提示早 期微转移的存在风险，指导临床调整诊疗策略，制定更加合理的个体化诊疗方案（如进一 步筛查转移、拟定新辅助化疗、辅助化疗方案等。
联合影像学更客观评价疗效 监测耐药发生
疗效评估、耐药性监测
胰腺癌
49.00% （单8）
75.49%
72.39% 70.3% 70.92%
（8+17） （8+17） （1+8） （8+3）
CTC检测技术平台总结
CTC检测技术平台总结CTC（循环肿瘤细胞）检测技术平台是一种能够检测患者体内循环肿瘤细胞的技术。
循环肿瘤细胞是指癌症细胞在血液循环中的一种形态，能够通过血液传播到身体的其他部位，导致肿瘤的转移和复发。
CTC检测技术平台的发展为肿瘤诊断和治疗提供了重要的工具，下面将对CTC检测技术平台进行详细的总结。
CTC检测技术平台基本原理是通过从患者的血液中捕获和分离循环肿瘤细胞，然后对这些细胞进行分析和鉴定。
目前，常见的CTC检测技术平台包括免疫分离、生物物理方法、细胞捕获芯片和基因检测等。
这些技术平台各有优缺点，可以根据具体的研究目的和需求选择合适的方法。
免疫分离是一种常用的CTC检测技术平台，基于肿瘤细胞表面特异性抗原的特点，采用免疫磁珠或免疫细胞分选仪等方法，将循环肿瘤细胞从血液中分离出来。
这种方法具有高灵敏度和高纯度，可以快速准确地分离出循环肿瘤细胞，但需要针对不同肿瘤类型选择不同的抗原进行分离，因此有一定的局限性。
生物物理方法是另一种CTC检测技术平台，包括微通道芯片、微流控和光学技术等。
微通道芯片是一种通过微流控芯片捕获和分离细胞的方法，可以实现高通量和高效率的细胞分离。
微流控是一种利用液体流动特性对细胞进行分离的方法，具有高灵敏度和高特异性。
光学技术是基于肿瘤细胞与正常细胞在光学特性上的差异，通过光谱分析或显微成像等方法对循环肿瘤细胞进行检测和鉴定。
细胞捕获芯片是一种新兴的CTC检测技术平台，可以通过表面修饰和微结构设计实现对循环肿瘤细胞的高效捕获。
这种方法可以同时捕获多种细胞类型，并且可以在不同时间点对细胞进行多次分析，具有高效率和高可靠性。
基因检测是一种通过检测循环肿瘤细胞中的特定基因变异或基因表达水平来进行肿瘤诊断和治疗的方法。
这种方法可以通过PCR、NGS等技术对循环肿瘤细胞的基因组、转录组和表观基因组进行全面分析，为个性化治疗提供重要的参考。
总体来说，CTC检测技术平台是一种能够检测患者体内循环肿瘤细胞的重要工具。
循环肿瘤细胞(CTC)检测 (2)
循环肿瘤细胞(CTC)检测引言循环肿瘤细胞（CTC）是指从原发肿瘤中脱落并进入血液循环中的癌细胞。
它们是肿瘤转移和复发的主要起源，能提供重要的生物学信息和预测患者预后的依据。
因此，CTC检测对于肿瘤的早期诊断、治疗监测以及指导个体化治疗具有重要意义。
在过去的几十年中，CTC检测技术得到了快速发展和广泛应用。
通过利用特定的标记物（如抗原、RNA或DNA等），结合高灵敏的检测方法，可以在血液样本中检测到极低浓度的CTC。
本文将介绍CTC检测的原理、常用的检测方法以及其在临床上的应用。
原理CTC检测的原理基于以下几个关键步骤：1.血液样本采集：通过采集患者的外周血样本，包括血浆或全血。
2.CTC富集：为了提高CTC的检测灵敏度，需要将CTC从血液中富集出来。
一种常用的方法是通过利用CTC表面标记物的特异性，使用磁珠、细胞捕获装置或微流体装置等实现。
3.CTC检测：将富集后的CTC进行分离和检测。
目前常用的检测方法包括免疫细胞荧光染色、聚合酶链反应（PCR）、流式细胞术（FACS）等。
这些方法可以通过检测CTC表面标记物的存在与否，或者检测CTC特异基因、蛋白质或RNA等分子标记来确定CTC的存在。
4.CTC鉴定和计数：根据CTC的特征，如核形态、大小、核质比等特征，对CTC进行鉴定和计数。
一些图像处理和自动化技术也可以用来提高鉴定的准确性和效率。
常用的CTC检测方法免疫细胞荧光染色法免疫细胞荧光染色法是目前最常用的CTC检测方法之一。
该方法利用免疫荧光染色技术，通过将CTC与特定的抗原结合，然后使用荧光染料进行标记。
通过在荧光显微镜下观察，可以准确识别CTC的存在与否。
PCR法PCR法通过扩增CTC特异基因的片段，来快速检测和鉴定CTC。
该方法的优点是灵敏度高、检测速度快，然而由于PCR 技术的特点，可能存在假阳性结果的问题。
FACS法FACS法通过流式细胞仪对CTC进行快速分离和检测。
该方法可以同时检测多个标记物，提高检测的准确性和灵敏度。
循环肿瘤细胞(CTC)检测
循环肿瘤细胞（CTC）检测一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。
CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。
大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。
二、肿瘤的发生及检测诊断全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。
然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。
美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。
因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。
我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。
伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。
传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。
晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。
在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。
临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。
如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。
肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。
如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。
信和医疗教您如何进行-循环肿瘤细胞(CTC)检测
信和医疗-循环肿瘤细胞(CTC)检测
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是指由肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环中的肿瘤细胞。
在影像学尚无法检测原发肿瘤灶的时候，就有可能从血液中检测到CTC，从而提示我们肿瘤的发生;另外一方面，肿瘤的转移与CTC关系密切，肿瘤的转移灶就是由CTC细胞转化生长而来的。
相关理论研究证明，肿瘤发展的任何一个阶段肿瘤细胞都存在脱落入血的风险，针对在尚未形成影像学可见的原发灶而存在的瘤细胞早期入血的情况，CTC从理论上为肿瘤的早期预防和治疗提供了一定的参考价值和应用前景。
CTC检测技术作为一种获取并鉴别肿瘤细胞的方法，不仅适用于血液中肿瘤细胞的检测，同样适用于其他体液中肿瘤细胞的检测，如胸水、脑脊液等，临床工作中，可结合实际情况进行使用。
检测项目：血液疑似肿瘤风险细胞计数。
结果判定
1、易感人群定向体检筛查
CTC检测阳性(计数≥2)，请建议患者专科就诊。
2、结合肿瘤标记物、影像学同时筛查
CTC检测阳性(计数≥2)、肿瘤标记物异常升高、影像学发现异常占位，满足至少一项，建议患者专科就诊。
3、临床无明显指向性表征
CTC检测阳性(计数≥2)，临床无明显肿瘤发生倾向无症状者，建议增加定期体检频率，随时监测身体状况，并注意保持合理健康饮食及生活习惯。
ctc检测的临床应用原理
CTC检测的临床应用原理什么是CTC检测CTC（循环肿瘤细胞）是指从主要肿瘤部位脱离，进入血液循环，并具有能够引起远处转移的潜能的肿瘤细胞。
CTC检测可以通过采集患者的血液样本，并对其中的循环肿瘤细胞进行分离和分析，从而评估肿瘤的侵袭性、转移潜力以及预后。
CTC检测的临床应用CTC检测已经被广泛应用于临床实践中，并且在肿瘤的早期诊断、疾病监测、治疗选择以及预后评估等方面发挥着重要的作用。
下面将介绍CTC检测的临床应用原理。
早期诊断CTC检测可以帮助早期诊断肿瘤，其原理是通过检测血液中循环肿瘤细胞的存在和数量来判断肿瘤的存在。
由于早期肿瘤往往没有症状或症状不明显，因此常常很难进行准确的诊断。
CTC检测可以提供一种非侵入性的检测方法，通过简单的血液采集即可进行，对于高风险人群或疑似肿瘤患者进行筛查，有助于尽早发现肿瘤并进行进一步的诊断。
疾病监测对于已经确诊的肿瘤患者，CTC检测可以用于监测疾病的进展和治疗效果。
肿瘤细胞往往具有高度异质性，肿瘤细胞内的基因组和表达谱会随着疾病的进展而发生变化。
通过定期的CTC检测，可以在治疗前后对比循环肿瘤细胞的数量和特征，评估治疗的效果和预测疾病的进展。
治疗选择CTC检测还可以帮助选择合适的治疗方案。
通过分析循环肿瘤细胞的特征和表达谱，可以评估肿瘤对不同治疗药物的敏感性，并指导临床医师选择最适合的治疗方案。
这种个体化的治疗策略可以提高治疗的效果，减少无效治疗的发生，从而改善患者的生存质量。
预后评估CTC检测在预后评估中也扮演着重要的角色。
研究表明，血液中循环肿瘤细胞的存在和数量与肿瘤的侵袭性、转移能力以及患者的预后密切相关。
通过定期的CTC检测，可以监测循环肿瘤细胞的动态变化，并以此评估肿瘤的进展风险和预测患者的生存期。
CTC检测的原理与方法CTC检测的原理是通过脱落细胞和循环肿瘤细胞的特征来进行区分和鉴定。
目前常用的CTC检测方法主要包括免疫细胞化学染色法、荧光原位杂交法、脱落细胞分选法以及微流控芯片技术等。
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Isolation by Size of
CTC纯度低，混入较多白
Epithelial Tumor cells
细胞
8μm孔径过滤膜，漏检体
肿瘤细胞会迁移至血浆层，
积较小的肿瘤细胞
而聚集后容易下沉
敏感性低
聚蔗糖-泛影葡胺(FicollHypaque)对细胞有毒性
免疫磁珠法
• 肿瘤细胞表面抗原 EpCAM与包绕着磁珠的 特异性单抗相结合
64
2010年7月-12月给予依西美坦治疗 治疗1个月，CTC提前预示治疗无效 治疗3个月后，临床指征进展
2010年12月- 2011年5月给予多西他
20
赛解救化疗
PET-CT
4周期后， 影像检查提示部分骨转移
CellSearch在基 线时检测的CTC
CellSearch在每个 疗程前检测的CTC
27
结合CTC检测比单独的影像学检查预后更准确
乳腺癌中：
28
结合CTC检测比单独的PSA检测预后更准确
前列腺癌中
29
病人案例1 - CellSearch CTC预测骨转移早期进展
患者女性，53岁，乳癌术后2年，骨转移
每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环 肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有 1亿个，红细胞有500亿个。
从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞
将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常
上皮细胞、造血干细胞等区分开来
4
三种技术
梯度密度法
过滤法
肿瘤细胞和单核细胞密度 ISET:
小于1.077g/ml
循环肿瘤细胞CTC研究进展
杭州北角生物医药科技有限公司
循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
1869年 Aust Med J， Ashworth最早在转移性 癌症患者血液中观察到。
2005年 N Engl J Med，
Cristofanilli证实治疗前 CTC数目是转移性乳腺 癌患者无进展生存期和 总生存期的独立预测因 子。
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0
<5 CTCs n=90 (51%)
Logrank p < 0.0001
10.9 Months
>5 CTCs n=87 (49%)
21.9 Months
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
CTC质控试剂盒
磁力 捕获
2004年FDA批准
CellTracks Analyzer II
磁巢Magnest
9
CellSearch技术的可重复性和高敏感度
CellSearch系统是CTC检测目前唯一的自动化、标准化平台 减少方法学及人工操作引起的结果差异 实验结果的可重复性 实验室间结果的可比性 系统线性系数：R=0.990，线性范围 0-1238 系统最低检测限度：7.5ml外周血中的1个肿瘤细胞
2
原发肿瘤血 管生成浸润
上皮－间 质转化 （EMT）
侵润
转移
侵入血管内 凋亡的CTC
循环肿瘤细 胞（CTC）
循环肿瘤 微栓
（CTM）
肿瘤细胞 扩增
血管生成
间质－上 皮转化 （MET）
侵入血管外 (CTC)
转移到 骨髓和 其他器
官
血管内增 殖
(CTM)
转移
播散肿瘤细胞 （DTC）微转
移休眠灶
3
获取CTC需要解决的技术问题
IF: 6.452
无骨转移
只有骨转移
1. CTC计数≥21，96%有骨转移，且全部为多处骨转移 2. CTC计数越高，越与多处骨转移或多器官转移相关 3. 在多处累及患者中，CTC计数仍是预后的独立判断因子
17
有多处器官转移
Br J Cancer. 2010 May 11;102(10):1495-502. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast cancer.
CTC Assessment at 4.5 weeks
CTC Assessment at 8 weeks (within 4 weeks of imaging)
15
CTC Assessment at 10-12 weeks (within two weeks of imaging)
J Clin Oncol. 2009 Jul 10;27(20):3303-11. Circulating tumor cells and [18F] fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography for outcome prediction in metastatic breast cancer.
2009 J Clin Oncol CTC检测达到5个 或更多对于MBC的 治疗监控优于 FDG-PET/CT检查
回顾CellSearch的研究
21
利用CellSearch技术研究预后的文献回顾
22
利用CellSearch技术比较CTC与影像学预后的文献回顾
23
FDA批准的临床应用
24
切点的意义——评估预后
14
Clin Cancer Res. 2006 Nov 1;12(21):6403-9.
Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic
breast cancer.
IF: 7.338
Radiologic Assessment at 12 weeks
一线化疗前， 即基线
一线化疗一个 疗程后，即 3～4周后
CTC在治疗前后都是强烈而独立的预后因子。在基线位置检测CTC对于PFS和OS有较高预测意 义。
CTCs before and after the initiation of therapy were strong, independent prognostic factors. Detection of CTCs before initiation of first-line therapy in patients with MBC is highly predictive of PFS and OS.
根据肿瘤类型的不同，CellSearch对CTC的 计数结果参考的切点(CUTOFF)也不同
高于等于切点，预后不良 低于切点，预后良好
25
CTC数量变化是预后改变的重要预测
26
任何时段，高于切点预后不良 任何时段，低于切点预后良好
CellSearch在基 线时检测的CTC
CellSearch在每个 疗程前检测的CTC
2008 Ann Oncol 治疗中CTC的变 化提示疾病对于 治疗的反应
2010 Ann Oncol CTC计数越高，越 与多处骨转移或多 器官转移相关
2005 J Clin Oncol CTC在治疗前后 都是预后的强烈 而独立预测因子
20
2006 Clin Cancer Res CTC计数对于乳腺癌 病情状态判断要比当 前的影像学方法更早 且更具有可重复性
EpCAM CK
Nucleus DAPI
CD45
Anti-CD45
变藻蓝蛋白 (APC)
CTC
Anti-CK-PE
藻红蛋白 (PE)
8
白细胞
CellSearch: 自动化的CTC分离、富集和计数
CellSave 储存管
96小时稳定
CellSearch CTC检测试剂盒
CellTracks AutoPrep系统
其转移灶 为HER2+
HER2+：使用FISH方法，HER2/CEP17≥2.0
9/10转移灶 为HER2-
19
CTC在乳腺癌中的研究结果回顾
2004 N Engl J Med CTC升高，PFS 和OS均降低， CTC是预后的独 立预测因子
2006 Clin Cancer Res CTC在治疗的任何 时段升高都预示乳 腺癌病情进展，预 后不良
13
Clin Cancer Res. 2006 Jul 15;12(14 Pt 1):4218-24. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastaticIF: 7.338 breast cancer patients predict progression-free and overall survival.
FISH分析
IF: 4.831
(A) 白细胞有两份CEP7（绿色），EGFR（红色）和MET (蓝色) (B) CTC中， EGFR （红色）和MET (蓝色)基因扩增
18
在原发肿瘤和CTC中，HER2基因扩增
原发灶 肿瘤
患者 总数
CTC中HER2的
患者数量
CTC中HER2&乳腺癌中CTC的研究进展
11
N Engl J Med. 2004 Aug 19;351(8):781-91. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer