外周血循环肿瘤细胞检测ppt课件
外周血细胞形态学检验 ppt课件
3.中性颗粒呈等电点状态与伊红美兰均可结合，染成 紫红色，称为中性物质。
医学课件
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pH对细胞染色的影响
在酸性环境中染色偏红；在碱性 环境中染色偏蓝。因此要求用磷酸盐 缓冲液，使染色环境维持在6.4～6.8 之间，以达到满意的染色效果。
医学课件
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1.用玻璃笔在血膜两端划线。 2.瑞氏染液覆盖血膜，染 0.5～1min。
医学课件 20
制备血涂片
染色
镜检
检查区域：体尾交界处，细胞分布均匀， 红细胞紧密排列但不重叠。 低倍镜： 估计细胞分布和染色情况，浏 览全片是否存在异常细胞。 油镜： 观察红细胞形态。
医学课件 21
正常红细胞形态
双凹圆盘形，淡桔红色，中央1/3为生 理性淡染区，呈正常色素性。红细胞直径 为6.7～7.7μm，平均直径7.2μm左右，厚 约2μm。无核，胞质内无异常结构。除健 康人外，还见于急性失血、再生障碍性贫 血和部分白血病。
血涂片的染色
染色的目的是使细胞膜、细胞浆、胞 浆中颗粒及细胞核等主要结构染上特定的 颜色，以便于显微镜下观察与识别。
医学课件
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一、瑞氏染色法（Wright’s stain）
对胞浆和中性颗粒染色较好，对胞核稍差。
二、吉姆萨染色法（Giemsa’s stain）
对胞浆和中性颗粒染色较差，对胞核和寄 生虫着色较好。
医学课件
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小红细胞( microcyte )
医学课件
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红细胞大小异常
2．大红细胞( macrocyte)：直径>10μm。最 常见于缺乏叶酸和维生素B12所致的巨幼细 胞性贫血（MA）。也可见于溶血性贫血 （HA）、骨髓增生异常综合症（MDS）。 3．巨红细胞(megalocyte)：直径>15μm。 常见于巨幼细胞性贫血（MA）和骨髓增生 异常综合症（MDS）。
循环肿瘤细胞CTC检测 PPT
阴性富集流程图
全亚型、高效率、非依赖
通用于绝大部分实体肿瘤、非血源性循环稀有细胞的富集
我们的选择
imFISH
imFISH技术将基因水平的FISH技术与蛋白水平的 免疫荧光染色技术相结合,是兼具核遗传信息及细 胞形态改变的精准CTC鉴定分析方法。
技术优势： ➢ 核酸水平稳定性、灵敏度高（80％） ➢ 引入CD45染色，提高特异性（97％) ➢ 细胞计数、核型分析、表型分析、分子分型
便捷性
CTC只需采集少量外周静脉血便可进行检测，对人体基 本无创，取样便捷，适于动态连续性监测。
循环肿瘤细胞CTC临床应用方向
CTC临床重点应用：一、辅助诊断
判断病灶良恶性 无创便捷，发现早期隐匿转移
辅助传统TNM参考分期 提供适时诊断信息，实现精准治疗
辅助诊断
CTC检测应用于辅助诊断
诊断难
异常占位，良性? 恶性? 病灶位置不宜活检怎么办? 有创操作，是否有瘤细胞种植？
诊准难
肿瘤异质性的影响? 临床分期与病理分期不一致?如何针对肿瘤时空信 Nhomakorabea变化提供
即时诊断信息?
辅助诊断
CTC功能：
对尚未完善病理诊断的患者，CTC 可联合影像学、血清学作为辅助判断病灶良恶性的指标。 同时,CTC是对原发灶与转移灶信息的全面反映，可弥补现有传统TNM 分期的不足，提示早 期微转移的存在风险，指导临床调整诊疗策略，制定更加合理的个体化诊疗方案（如进一 步筛查转移、拟定新辅助化疗、辅助化疗方案等。
联合影像学更客观评价疗效 监测耐药发生
疗效评估、耐药性监测
胰腺癌
49.00% （单8）
75.49%
72.39% 70.3% 70.92%
（8+17） （8+17） （1+8） （8+3）
人外周血循环肿瘤细胞(CTC)
人外周血循环肿瘤细胞(CTC)检测技术的研发及临床应用开发美国肿瘤协会于2006 年发表的年度报告指出，目前全世界范围内每3 人中就有1 人在其一生中会患有某种肿瘤，而且肿瘤发病率在发展中国家随着污染程度的增加，患病几率还会高于1/3 的比例。
现今全世界用于肿瘤治疗与防治的费用每年以16.5% 的比例递增。
仅用于乳腺癌，结直肠癌及前列腺癌（还不包括发病率最高的肺癌）的投资，目前世界范围内已达每年92 亿美元。
目前全世界用于肿瘤诊断的方法可归为三大类：病理学（活检切片）；影像学（超声，X光，CT, PET 等）和血清学（血清肿瘤相关蛋白，如CA-125, CA-199, CEA 等），但所有这些方法都有不可避免的缺点，例如灵敏性及特异性差，过于依赖医生判断的主观性等。
因此目前临床急需一种能够为医生及病人提供准确，快速的肿瘤检测手段。
经过长时间的大量研究，美国FDA 认证的人外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）检测目前已被公认为最好及最可观的检测手段之一。
目前已有越来越多的国内外医生开始应用此技术作为肿瘤检查的重要辅助手段。
不仅于此，CTC 检测也被公认为是目前国外新近流行的肿瘤治疗方法-即阻断肿瘤细胞入血转移的唯一有效检测指标。
除了上述CTC可作为肿瘤检测手段外，CTC还可成功应用于以下一系列其它方面的用途：(1)个体化治疗的体外肿瘤药物筛选；(2)体内化疗药物药效的快速评估: 相对于每12周一查的CT 诊断，CTC在第1-2周即可显示药效结果，这一点对临床医生和病人尤为重要；(3) 根据CTC数目，判断病人愈后状况及存活时间；（4）肿瘤病人复发的监测与及时诊断；及（5）正常人群体检普查以利于尽可能的肿瘤早期诊断。
除了应用于临床外，CTC 亦可应用于众多药厂和科研机构的基础研究，包括寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物等。
目前美国FDA已于2004年认证了美国上市公司Immunicon/Veridex的CTC检测技术及其临床应用。
外周血细胞形态学检查PPT课件
2）放射线损伤后淋巴细胞形态变化 3）淋巴细胞性白血病时形态学变化 （3）浆细胞：
见于多发性骨髓瘤细胞、反应性浆细胞 增多症、疟疾、黑热病、伤寒等。 莫氏细胞；火焰状浆细胞；拉塞尔小体
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二、外周血中红细胞形态检查 各种病因作用于红细胞生理进程的不同 阶段，引起红细胞相应的病理变化，导 致红细胞产生特殊的形态改变，与血红 蛋白测定、红细胞计数结果相结合可粗 略推断贫血原因，对贫血的诊断和鉴别 诊断有重要的临床价值。
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1、正常红细胞形态：6～9μm 2、异常红细胞形态 （1）红细胞大小不一 1）小红细胞：直径﹤6μm 2）大红细胞：直径﹥10μm 3）巨红细胞：直径﹥15μm 4）红细胞大小不均：同一患者的红细胞之间直
径相差一倍以上。大红细胞直径可达12μm， 小红细胞直径仅2.5μm。见于巨幼红细胞性贫 血，严重的增生性贫血等
min左右。 4、用接近中性的水冲去染液，待自然干燥或用滤纸膜外观为淡紫红色。在显微镜下红细 胞染粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感，白细胞胞浆中的 颗粒能显示各种细胞的特有色彩，细胞核染天青紫红色， 染色质清楚，粗细松紧可辨。
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一、外周血中白细胞形态检查 1、正常白细胞形态
外周血细胞形态学检查
赤峰学院附属医院检验科 张皓
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血细胞分析是临床诊疗工作中常做的检验项 目，血细胞分析仪广泛用于全血细胞计数，随 着自动化血细胞分析仪的普及和仪器性能的提 高，使检验结果更加准确，但是全自动血细胞 分析仪也存在着内在缺陷，由于血细胞形态的 多样化和复杂性，只能提供血细胞多少、大小、 分布及相互间比例，得出正常或异常的提示， 不能直接提供血细胞质量改变的确切信息，如 过度依赖会出现漏诊和误诊。对于发热、贫血 和血细胞异常的标本，在鉴别感染性疾病和非 感染性疾病，病毒性感染和细菌性感染等必须 做外周血的形态学检查。
循环肿瘤细胞(CTC)检测
循环肿瘤细胞（CTC）检测一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。
CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。
大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。
二、肿瘤的发生及检测诊断全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。
然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。
美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。
因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。
我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。
伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。
传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。
晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。
在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。
临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。
如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。
肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。
如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。
外周血肿瘤细胞筛检
科学家、临床医学家与病人共同协作在癌症研究上取得的重大突破SCIENTISTS, CLINICIANS, AND PATIENTS WORKING TOGETHER TO MAKEA DIFFERENCE IN CANCER RESEARCH无创性外周血循环肿瘤细胞实时活检健康人预警、癌症病人早期诊断和个体化治疗Circulating Tumor Cells as a Real Time Fluid Biopsy for Detection, Prognosis, and Individualized Therapy Management for Cancer Patients.一、什么是循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞(CTCs)是从实体瘤病灶脱落并进入外周血液循环中的肿瘤细胞（见图1）。
从模型系统来看，估计每克肿瘤组织中大约有1x106个肿瘤细胞进入血液循环中。
图1 血液循环中的肿瘤细胞二、外周血肿瘤细胞筛检的意义循环肿瘤细胞的实时活体检测，可以为癌症提供早期预警，能使癌症患者的早期检测、预后效果判断、个体化治疗成为可能。
1、“健康”人群早期预警2、肿瘤高危人群的早期筛查3、指导肿瘤治疗4、监测癌细胞转移5、判断病人预后三、攻克肿瘤的首要问题是早期预警和早期诊断因为肿瘤的发生、发展到死亡有一定的时间过程。
用特别的方法发现肿瘤细胞或肿瘤组织（肿瘤组织在5-10mm或0.5cm以下（见图2）），早期预警和早期诊断，及时干预和治疗，才能拯救病人生命，避免重大的经济损失取得重大的社会效益。
图2 CTC和PET理论检测值的比较CTC检测技术无创伤、特异性强、其检测灵敏度高，理论上在肿瘤组织仅为0.5mm即可检测，实际可检测到0.5cm以下的肿瘤（PET理论上可检测到5mm 以上的肿瘤，目前仅可检测到0.5cm以上的肿瘤），8ml血液只要有一个肿瘤细胞即可检出，而且根据病情需要可进行随时检测（实时检测），因而称该技术为无创性外周血肿瘤细胞实时活检（“real time biopsy”）；特别适用于健康或高危人群的早期预警或早前诊断，对于肿瘤病人尤其适合用于指导治疗、监测转移和判断预后，已成为临床研究和应用的热点。
肺癌外周血液体活检：如何选择ctcs与ctDNA课件
●: 阳性微滴（ : 靶标分 1） ○: 阴性微滴（ 0） : 子
有限稀释
一个 待分析的PCR反应体系 成千上万个 独立的PCR反应体系
ctcs检测技术
♠目前常见免疫捕获技术（一代技术）
免疫捕获法 依靠抗体与细胞表面特定抗原结合进行分离 只能分离具有特定表面抗原（如EpCAM）的 CTC
滤膜法 依据细胞大小进行分离 全面分离各类型CTC 其他 依据其他特征（如核质比、细胞密度等）进行 分离
ctcs检测技术
CanPatrolTM—技术原理
肺癌外周血液体活检： 如何选择ctcs与ctDNA
肺癌外周血液体活检
“液体活检” 无创肿瘤筛查 方法。 其来源主要分为： 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs） 循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）
ctcs与ctDNA检测意义
♠
ctDNA检测技术
已知突变位点检测
未知突变位点检测
（突变率> 2%）
（突变率< 2%）
l数字PCR lBEAMing技术 l标记扩增深度测序 （TAM-Seq） l癌症个体化深度测 序 (CAPP-Seq)
敏感度
l全基因组测序 l全外显子测序
lRNA末端平行分析
法 l全基因组甲基化测序
数字PCR
泊松分布 阴性微滴比例推算 起始靶分子的绝对量
优点：可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%； 缺点：只能检测已知的突变位点，通量低；
循环肿瘤细胞检测在胃肠道肿瘤诊疗中的应用ppt课件
随着生物技术和精准医学的发展，CTC检测逐渐成为肿瘤研 究领域的热点，其对于肿瘤的诊断、预后判断和疗效监测具 有重要意义。
胃肠道肿瘤诊疗现状
流行病学特征
胃肠道肿瘤是世界上最常见的恶性肿瘤之一，包括胃癌、结直肠癌等。其发病 率和死亡率均居高不下，严重威胁人类健康。
诊疗方法
目前胃肠道肿瘤的诊疗方法主要包括手术切除、放疗、化疗以及免疫治疗等。 然而，现有诊疗方法仍面临许多挑战，如肿瘤复发、转移和耐药性等。
CTC检测在胃肠道肿瘤诊疗中的意义
早期诊断
通过CTC检测，可以在肿瘤早期 发现外周血中的肿瘤细胞，从而 实现胃肠道肿瘤的早期诊断，提
高治愈率。
预后判断
CTC的数量与患者的预后密切相关 ，通过监测CTC的动态变化，可以 评估患者的预后情况，为个体化治 疗方案提供依据。
疗效监测
在胃肠道肿瘤患者治疗过程中， CTC检测可以实时监测治疗效果， 帮助医生及时调整治疗方案，提高 治疗效果。
早期诊断
进一步探索CTC检测在胃肠道肿瘤早期诊断中的应用 价值，通过发现早期循环肿瘤细胞，实现肿瘤的早发 现和早治疗。
个性化治疗
结合CTC检测结果，为胃肠道肿瘤患者提供个性化治 疗方案，根据患者的循环肿瘤细胞特征，制定针对性 的治疗措施。
推动CTC检测技术在临床的广泛应用与标准化
临床普及
积极开展CTC检测技术的临床推广和普及工作，让更多 的医生和患者了解并应用CTC检测技术。
5. 数据分析
对鉴定为CTC的细胞进行数量统计、表型分析、基因突 变检测等，以获取与肿瘤相关的信息。
6. 结果解读
结合患者的临床资料和其他检查结果，对CTC检测结果 进行解读，为胃肠道肿瘤的诊疗提供依据。
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精准分子 检测中心
认证的标准的
基因扩增实验
室
临床基因扩增
检验实验室技
术人员上岗证
ABI 7500 PCR 仪
国家医疗器械 注册证
基因测序
CTC
表达谱检测
基因突变检测
收费：
250309019-化学药物用药指导基因检测 （390元/个）
试剂盒识别以下9种不同亚型编码蛋白： FRa，CD45(V1，V2，V3，V4)，CD14(V1，
外周血循环肿瘤细胞检测
概念：
循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离 出来并进入外周血液循环的肿瘤细 胞。
原发肿瘤血管生成 侵润
上皮－间质转化 （EMT）
侵润
转移
侵入血管内
循环肿瘤细胞（ CTC）
循环肿瘤 微栓 （CTM）
凋亡的CTC
肿瘤细胞 扩增 血管生成
间质－上皮转化 （MET）
侵入血管外 (CTC)
转移到骨髓 和其他器官
ISET（滤膜) 荧光标记
70%
30% 全自动 10mL
晚期癌肿
025%（22/87) 6h/8样本
61%-88% 48h/1样本
30% 48h/1样本
40% 3天
否
是
是
是
是
FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCCAg对NSCLC和早期NSCLC患者的诊断效率
检测方法
特异度（%）
约登指数 I期NSCLC灵敏度（%）
AUC（95%CI）
CTC
84.1
0.573
67.2
0.823 (0.773-0.874)
NSE
95.9
0.055
4.6
0.585 (0.495-0.675)
CEA
94.9
0.25
18.5
0.76 (0.69-0.83)
CA125
97.6
0.175
V2，V3，V4) 390*9=3510
THANKS
肺癌 卵巢癌 结直肠癌
CTC检测技术对比
核心技术
特异性 灵敏度 自动化 血样体积
适应症
早期（I期） 敏感性
中晚期敏感 性
报告时间
可视化
CytoploRare®
（格诺） 免疫磁珠负向富集 靶向配体PCR技术
半自动
早、中和晚期肺癌
89% 6h/12样本
CellSearch®
CyttelTM （北京莱尔）
血管内增殖 (CTM)
转移
播散肿瘤细胞（ DTC）微转移休眠 灶
肿瘤疾病近期疗效的判断方法
CTCS
取样简单、创伤小 基因检测准确性高 可评估肿瘤的侵袭性
放 化 疗 患 者
手 术 患 者
无
法
门
穿
诊
刺
患
患
者
者
Genosaber Biotech Co. Ltd.
4
技术路线：
灵敏度最高的检测技术 600万个VS1个
4.6
0.505 (0.417-0.592)
Cyfra21-1
90
0.352
32.3
0.716 (0.615-0.816)
SCC-Ag
93.8
0.15
12.3
0.624 (0.535-0.713)
天津市肿瘤医院 成都大学附属医院 重庆市肿瘤医院 苏州大学第一附属医院 西安交大一附院 陕西省人民医院 西京医院 长安医院等
CanpatrolTM （益善）
流式正向富集技术荧 免疫磁珠负向富集、
ISET（滤膜）
光标记
Fish技术
原位杂交RNA分析
80%
83%
75%
30%
腺癌：46%
全自动
半自动
7.5mL
4mL
晚期乳腺癌、结直肠癌、晚期肺癌、胰腺癌、乳
前列腺癌
腺癌
30% 半自动
5mL 晚期癌肿
CTC-BiopsyⓇ （武汉友之友)