实验讲义2011生药
第二章 生药的真实性鉴定
四、各类生药的性状鉴定要点
1. 根类(roots)
注意辨别双子叶植物还是单子叶植物根。
双子叶植物根类:多呈圆柱形或圆锥形，平直或 稍弯曲、扭转、有的分枝，上端常连接短缩的 根茎(习称“芦头”)；表面常较粗糙，多数有 木栓、皮孔及支根痕；横断面呈放射状结构， 形成层环大多明显，中心常无髓，少数 (shǎoshù)生药有异型构造。
干、枝条或根的形成层以外的部分，可分为树皮(干 皮) 、枝皮及根皮。有的皮类生药(shēngyào)已刮去 外皮而以“内皮”(主为韧皮部)入药。
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6.叶类(leaves or leaflets)
• 观察叶类生药时，首先将皱缩的叶片湿润展平，观看叶的 组成判断是单叶或是复叶。再观察叶片的形状、大小、色 泽、叶端、叶基、叶缘、叶脉、上下表面、质地以及叶柄 的有无或长短。
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4. 木类(woods)
• 木类生药(shēngyào)是树木形成层以内的部分，通常 以心材入药。一般将木材锯截成段，或劈成条块或 刨成薄片。观察其形状、色泽、表面纹理与斑块、 质地、气味，以及横切面、纵切面所呈现的年轮、 射线等纹理。
• 5. 皮类(barks) • 皮类生药(shēngyào)是木本双子叶植物或裸子植物树
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• 8. 味(taste)
• 味是用味觉来识别生药，又称尝法。
• 生药的味与其含有的成分有关，每种生药的味 感是比较固定的，生药的味感也是衡量生药品 质的标准之一。
• —如乌梅、木瓜、山楂均以味酸为好；
• —黄连、黄柏以味越苦越好；
• —甘草、党参以味甜为好等。
• 生药的味感与生药所含成分及含量有密切 关系，若生药的味感改变，就要考虑其品种或 质量(zhìliàng)是否有问题。
10药学——生药学试验教学大纲教学内容
10药学一一生药学实验教学大纲实验一显微标本片的制作及生药的水分含量测定一、实验目的1.掌握粉末制片法的步骤。
2.熟悉烘干法测定生药中水分含量。
二、实验材料、仪器及试剂水合氯醛液、甘油、苯酚1、醋酸、3%过氧化氢或次氯酸钠溶液三、实验内容与方法粉末制片法1.蒸馏水装片法专门适用于观察淀粉粒。
挑取粉末适量，置载玻片中央，然后滴加蒸馏水1-2滴。
用牙签或解剖针拌匀，将镊子夹一洁净盖玻片沿液面从左至右轻轻放下，多余试液用滤纸条吸去，保持装片洁净，即得。
2.水合氯醛法挑取适量粉末置载玻片上，滴加水合氯醛液1-2滴，置酒精灯上加热，待液体渗入粉末内部，渐成透明状，试液因加热而渐渐挥干，再滴加水合氯醛液1-2滴，加热，透化，防止沸腾。
然后滴加稀甘油1-2滴，用解剖针将粉末混匀，用镊子夹干净盖玻片沿液面从左至右轻轻放下，液体受压而延展，充满盖玻片下方。
多余的试液用滤纸条吸去，保持装片洁净，即得。
切忌用滤纸条在盖玻片上擦拭，补加液体时应在空隙的相对边缘加入，以防气泡产生。
颜色很深的粉末，可先进行脱色处理。
取待检粉末少许置小烧杯中或载玻片上，加少许3%过氧化氢溶液或次氯酸钠溶液，待颜色变浅后，除去液体。
或取粉末置烧杯中，加入适量水合氯醛在酒精灯上加热，除去液体，滴加稀甘油1-2滴，即得供观察用。
烘干法测定丹参中水分含量1.原理：供试品在100-105 C下连续干燥，挥发尽其中的水分，根据减失的重量，即可计算出供试品中的含水量（％）。
2.方法：取丹参供试品5g,平铺于干燥恒重（W0 ）的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，精密称定重量W1，求出供试品重量Ws,打开瓶盖，置恒温干燥箱中，在100-105C下连续干燥5h,将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度下干燥1h,冷却，称重至连续两次称重的差异不超过5mg为止（W2 ）。
3.计算：水分含量=（W1-W2 ）/Ws4.结果判定将计算结果与药品标准的含水量限度（《13%）比较，若低于或等于限度则符合规定，否则不符合规定。
2011我的生药实验3 ppt课件
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【实验原理】
黄酮类的鉴定
• 金属盐类试剂的络合反应
• 生药乙醇或甲醇提取液常可与镁盐、铝盐、 锆盐和铅盐等试剂反应，生成有色络合物， 可用于定性及定量分析。
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黄芩的理化结果 （示黄酮类成分存在） 1.黄芩的酒精提取液； 2.滴加了10%的醋酸铅； 3.与盐酸镁粉反应。
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索氏提取器的原理
• 从固体物质中萃取化合物的一种方法是，用溶剂将固体
长期浸润而将所需要的物质浸出来，即长期浸出法。此
法花费时间长．溶剂用量大、效率不高。
在实验室多采用脂肪提取器(索氏提取器)来提取、脂肪
提取器就是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续
不断地被纯溶剂萃取。萃取前先将固体物质研碎，以增
取、将萃取出的物质富集在烧瓶
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• 用滤纸制作圆柱状滤纸筒,称取10g黄芩,用研
钵捣成茶叶末,装入滤纸筒中,将开口 端折叠封
住,放入提取筒中.将150 mL圆底烧瓶安装于电
热套上,放入2粒沸石,量取95 %乙醇100mL,从
提取筒中倒入烧瓶,安装好索氏提取装置, 打开
电源,加热 回流2小时. 实验时能够观察到,随着
加固液接触的面积。然后将固体物质放在滤纸套1内，
置于提取器2中，提取器的下端勺盛有溶剂的圆底烧瓶
相连，上面接回流冷凝管。加热园底烧瓶，使溶剂沸腾，
蒸气通过提取器的支管3上升，被冷凝后滴入提取器中，
溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管4的最
生药学实验讲义
生药学实验讲义漯河医学高等专科学校1目录实验室守则3 实验一 生药中常见的化学成分的理化鉴定（一）4 实验二 生药中常见的化学成分的理化鉴定(二) 5 实验三 根类生药6 实验四 根茎类生药7 实验五 皮类生药8 实验六 茎木类生药9 实验七 植物细胞基本结构10 实验八 植物的组织11 实验九 根的组织构造12 实验十 双子叶植物茎的初生构造和次生构造单子叶植物、裸子植物茎的构造13 实验十一 叶的构造14 实验十二 花的组织构造15 实验十三 果实的内部组织构造16 实验十四 种子的内部组织构造17 实验十五 菌类、裸子植物的性状显微鉴定18 实验十六 双子叶植物根及根茎类生药的显微及显微理化鉴定 19 实验十七 单子叶植物根及根茎类生药的显微及显微理化鉴定20 实验十八 皮类生药的显微及显微理化鉴定21 实验十九 花类生药的显微及显微理化鉴定22 实验二十 果实种子类生药的显微及显微理化鉴定23 实验二十一 全草及其他类类生药的显微及显微理化鉴定24 实验二十二 动物类和矿物类生药的性状鉴别 25 实验二十三 户外见习26 实验二十四 附院药房见习27 附录一 常用试剂配置法28 附录二 层离法常用显色剂29 附录三 显微镜测量法30 附录五 显微镜的构造与使用31 附录六 生物绘图322实验室守则一、实验注意事项：1．根据教学进程，温习与本次实验有关的课堂讲授内容。
2．仔细阅读本次实验的内容，要求弄懂实验的原理与方法。
3．准备好各种自备的实验用品，如铅笔、橡皮、直尺、报告纸等。
二、实验过程中的几点要求：1．遵守实验室规则，保持实验室安静。
2．实验认真，观察仔细，观察应当与思考结合起来，应当手、眼、脑三者并用。
3．由于实验时间有限，实验时应当善于安排自己的工作，注意力应当集中在主要问题上，不要用过多时间去钻研细小的次要问题，一时解决不了的次要问题，可留课外时间去解决o4．在实验过程中，应当随时注意观察到的现象，测量或称量的数据，计算结果等写在报告纸上，养成能随时作出准确、清淅、整齐的记录而不需要重抄的良好习惯。
10-生药的化学成分及其生物合成
甜菜、甘蔗 淀粉经酶水解 哺乳动物乳汁 麦角、酵母真菌
果糖，2分子葡糖 龙胆属某些植物 半乳，葡糖、果糖 棉籽 葡糖，2分子半乳 木蜜 糖 乳糖，2分子鼠李 鼠李属某些植物 糖
果糖，葡萄糖，2 水苏属某些植物
（3）多聚糖(polysaccharides, 多糖) 是由10个以上的单糖基通过苷键连接而成。
生药的化学成分及其 生物合成
第一节 生物的初生代谢与次生代 谢产物
代谢：植物为了维持生长、运动、繁殖等 生命活动，必须不断地从周围环境进行 物质交换，在此过程中所发生的物质合 成、转化和分解的化学变化，总称代谢。
代谢过程：获得能量的过程－合成代谢
释放能量的过程－降解代谢
• 初生代谢（primary metabolism）：合成 生命活动必需物质的代谢过程称初生代谢。
聚合度：100以上至几千 性质：与单糖和寡糖不同，无甜味，非还原性 分类：按组成分
由一种单糖组成－－均多糖
(homosaccharide) 由二种以上单糖组成－－杂多糖
(heterosaccharide)
植物多糖：淀粉、菊糖、树胶、纤维素、 葡聚糖
淀粉：由20％的糖淀粉（由300个D 葡萄 糖以α- 1,4连接，遇碘液呈深蓝色）和80 ％的胶淀粉（由1000个以上的葡萄糖聚 合而成，α-1,4和α-1,6连接，热水中膨胀 成粘胶状，遇碘液显红紫色）组成。
麦芽糖(maltose) 乳糖(lactose) 海藻糖(trehalose)
三糖 龙胆三糖
(gentianose)
棉子糖(raffinose) 甘露三糖 (manneotriose) 鼠李三糖 (rhamninose)
四糖 水苏糖(stachyose)
单糖组成
生药学实验
生药学实验目录前言实验一生药的显微鉴定技术实验二生药的水分、灰分和浸出物测定实验三色谱法在生药鉴定中的应用实验四气相色谱法的应用及挥发油含量测定实验五液相色谱法的应用及蒽醌类成分的含量测定实验六光谱法在生药鉴定中的应用实验七滴定法测定生药中生物碱的含量实验八根类生药鉴定实验九根茎类生药鉴定实验十茎木类、皮类、叶类生药鉴定实验十一花、果实、种子类生药鉴定实验十二全草类生药的鉴定实验十三动物类生药的鉴定实验十四矿物类生药的鉴定实验十五中成药的显微鉴定实验十六未知生药粉末鉴定实验十七设计性实验药材质量标准的制定附生药学实验中常用试剂的制备及使用前言一、生药学实验的目的与要求生药学是药学专业教学计划中的一门专业必修课程。
本实验指导是根据生药学教学大纲要求编写的，实验内容大致包括下面几方面：1、各类生药性状鉴别及其原植物的外形特征观察；2、生药的显微特征与显微化学反应；3、生药化学成分的定性与定量分析。
生药学是一门综合性的应用学科，实验工作在本门课程中占有主要地位。
不通过认真的、全面系统地实验及技术操作训练，就不可能学好本门课程。
通过生药学实验，使学生达到以下要求：1、掌握生药鉴定的各种方法和操作技术；2、熟悉各种生药的形成特征及原植物的特征，能正确地进行鉴定；3、了解生药鉴定用的各种仪器的构造，并学会其使用方法；4、进一步理解和巩固生药学理论知识；5、培养正确的科学态度和工作作风二、实验前的准备工作实验内容的安排是与课堂讲授密切配合的，因此，要求同学在实验前作好准备工作：1、根据实验进度表，复习与本次实验有关的课堂讲授内容或教材上有关章节内容。
2、仔细阅读每次实验内容，要求弄清实验的原理与方法，并对每次实验的思考题试作解答；3、对每次实验的整个内容，做好顺序及时间上的安排，以使实验时不忙乱，不拖拉，按时完成实验；4、准备好铅笔HB橡皮、直尺、报告纸等自备实验用品。
三、实验1、遵守实验室规则，保持实验室安排；2、实验开始前，教师进行讲解和提问时，应当注意听讲，并作必要的记录；3、实验时应根据具体内容有计划地安排时间，有条不紊地进行实验；4、实验要认真，观察要仔细，观察与思考相结合，做到手、眼、脑并用；5、实验过程中，应当随时将观察到的现象，测量或称量数据，计算结果、推论及结论等写在报告纸上。
生药实验指导
实验一生药显微鉴定基本知识实验目的：掌握显微标本的制作方法（粉末制片法）实验内容：一、粉末制片法粉末制片法是用于制备粉末状生药，以生药粉末制备的中成药及原料药材粉末的显微鉴定标本片的方法。
1.粉末制备如样品为非粉末状生药，则先将其制成粉末。
首先选取有代表性样品适量（约3-5g），切成或剪成约2mm的小段，置60摄氏度以下烘箱中干燥，用乳钵或微型粉碎机粉碎，过5-6号药筛，即得。
制备粉末时应注意：(1)如样品为完整生药，而且只有一个，又必须留样，将样品从中心纵剖为二，取一半粉碎，以保证粉末的代表性，另一半留样。
(2)如生药含挥发油，则烘干温度不可超过40摄氏度，含淀粉的生药烘干温度也不宜过高（为什么？）。
(3)较难粉碎的粗粉，不可丢弃，应过筛后再粉碎，并充分混合。
（为什么？）2.临时制片用刮刀挑取粉末适量，置载玻片中偏左处，加封藏剂封藏。
常用封藏剂有以下3种。
（1）斯氏液专门用于观察淀粉粒的最佳封藏剂，可保持淀粉粒原状而不膨胀变形。
（2）水合氯醛试液滴加后不加热，立即观察，用于观察菊糖；滴加后加热，用于观察细胞、草酸钙结晶等后含物。
水合氯醛透化：取生药粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛溶液数滴，用解剖针边搅边在酒精（为什么？）灯上以小火微微加热约2-3min，加热过程中，随时添加水合氯醛溶液。
加热后，待玻片稍冷，再加甘油酒精液一滴，用解剖针调匀，加盖玻片，并擦净盖玻片以外的溶液，供显微镜下观察。
（3）乙醇用于观察陈皮苷结晶或菊糖团块。
装片时应注意:1.如有较大的颗粒不可丢弃，应在湿润加热后用刮刀压碎，再继续透化至合格。
2.粉末封藏好后应是色泽均匀的一片，不可有明显的颗粒或深一块浅一块的现象，否则要重新装片，以免影响观察效果。
3.如粉末中色素太多，颜色太深，可先用过氧化氢浸渍处理，再用沸水及冷水洗涤，离心分离，然后装片。
二、徒手绘图1.组织简图用线条表示各种组织的界限用符号表示某些组织或特征的分布情况，一般不绘出细胞的形状。
生药学教学大纲
生药学教学大纲（六年制药学专业本科用）一、课程概述本大纲根据六年制药学专业培养目标而制定。
它以培养学生了解和掌握现代生药学的基本理论知识和操作技能，具备生药鉴定的初步工作能力和临床应用的初步知识为初级目标；以培养学生在生药学领域的创新意识和科研意识为高级目标。
上生药学课之前需要学习过的前期课程包括《药用植物学》、《天然药物化学》、《分析化学》、《药理学》、《中医学基础》等，要求学生已具备药用植物的外部形态、组织构造及药用植物分类学的基本知识和化学成分分析的基本技能，并对药理知识和中医基本理论有初步了解。
生药学理论课36学时，实验课72学时，共计108学时。
理论课内容分为总论和各论两部分。
总论部分概述生药学的研究对象、起源和发展，生药的化学成分及其生物合成途径，生药的鉴定、产销、加工贮藏、质量控制和利用等。
各论部分介绍生药（植物、动物和矿物三类）的基源、原植物形态、采制、产地、药材性状、显微特征、化学成分、理化鉴定、药理作用和临床功效等内容以及其同名异物生药的情况，以植物类生药为重点。
实验课包括药材或饮片的性状观察，生药的显微鉴定和显微化学反应，以及生药理化鉴定（定性与定量分析）三大部分，其中以生药的显微鉴定和显微化学反应为重点。
参考教材：《生药学》（蔡少青主编，人民卫生出版社，第六版）《药用植物学与生药学》（郑汉臣、蔡少青主编，人民卫生出版社，第四版）《生药学实验讲义（2006年修订本）》（北京大学药学院生药学研究室）《生药学》（郑俊华主编，人民卫生出版社，第三版）《生药学》（徐国钧主编，人民卫生出版社，第一版及第二版）《中草药性状和显微鉴定法》（楼之岑、李胜华主编，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社）二、正文部分（一）理论课内容（含总复习2学时）1. 总论（14学时）（1）生药的定义，生药学的概念、研究对象和任务。
（2）生药学的发展史、生药学与其它学科的关系。
（3）生药的分类方法及生药的记载大纲。
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实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
（3）求出Pr ：Pr = Ar×θ(式2.10-4)式中：Pr：供试品实际单位数；Ar：供试品标示量或估计单位。
【实验材料和仪器】1.实验材料（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），菌液浓度约为106个/mL。
菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。
如若菌株不纯，也会造成这样的结果。
因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
（2）抗生素标准品和供试品：头孢拉定标准品和供试品。
（3）培养基：效价检定用培养基1号。
（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液。
制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30 min备用。
2. 实验仪器无菌室、培养皿（直径9 cm）、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台等。
【实验步骤】1. 称量称量前，将抗生素标准品和供试品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。
供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前1~2小时更换天平内干燥剂。
标准品称量不可少于20 mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，以免吸水。
称样量的计算：W=V*C/P (式2.10-4)式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg）V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL）C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，μg/mL）P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，μg/mg）2. 稀释从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。
标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 mL，稀释步骤一般不超过3步。
每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。
稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，（预计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。
稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。
标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。
3. 双碟制备在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20 mL），吸取已融化的培养基20 mL注入双碟内，作为培养基的底层，等凝固后更换干燥的陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。
取出试验用菌悬液，按已试验适当的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径18~22 mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培养基内，摇匀作为菌层用。
用灭菌大口5mL吸管，吸取菌层培养基5 mL，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。
4. 放置钢管用钢管放置器，或其他方法将钢管一致、平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置5~10 min，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5. 滴加抗生素溶液每批供试品取5~10个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。
在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SH→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。
（S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。
滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入35~37℃恒温培养室，培养至所需时间。
6. 抑菌圈测量用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm。
【结果与计算】根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。
【注意事项】1. 玻璃仪器和其他器具需用专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150～160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
2. 实验中样品的称量、稀释、培养基倒平板等操作要严格的无菌操作。
3. 制备平板时，放置培养皿的超净台的台面必须水平。
可以将培养皿放在台面上，下垫一张白纸，皿内加水2～3 浅蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
4. 为保证双碟放置区域的平整，可在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。
接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。
这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。
5. 在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。
因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。
滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。
在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。
此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。
换滴管重新滴加。
6. 在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。
所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。
7. 滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。
在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。
8. 双碟在37℃下培养约16h。
时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。
9. 在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。
所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。
培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。
应经常注意温度，防止意外过冷过热。
10. 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。
不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。
不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。
【思考题】1. 为什么要用两步稀释，而不直接从1000U/mL稀释到10、20U/mL？2. 生物效价测定实验室被抗生素粉尘污染会导致什么后果？实验二超滤膜分离技术【实验目的】1.了解超滤膜分离的原理及方法2.掌握超滤膜分离的基本操作方法3.掌握采用超滤膜分离技术在蛋白、酶类分离纯化中的应用【实验原理】超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。
当液体混合物在一定压力下流经膜表面时，小分子溶质透过膜（称为超滤液），而大分子物质则被截留，使原液中大分子浓度逐渐提高（称为浓缩液），从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。
超滤膜分离技术作为现代分离技术，因其具有设备简单、能在低温下操作、能耗小、生物活性物质不易失活、效率高等特点，近年来被广泛应用于生物活性物质的分离、浓缩和纯化。
本实验以超滤膜分离浓缩α-淀粉酶。
【实验材料】1. 试剂(1)α-淀粉酶液(2)可溶性淀粉溶液(3)磷酸缓冲液（pH＝6.0）(4)碘液：碘11 g，碘化钾22 g，少量水溶解后，定容500 mL，作原液贮存棕色瓶。
实验时，取2.0 mL，加碘化钾20 g，溶解定容至500 mL，贮于棕色瓶中。
(5)考马斯亮兰试剂：100mg考马斯亮兰G-250，溶于50 mL 95％乙醇，加100 mL 85％（W/V）磷酸，加水稀释到1000 mL，过滤贮存棕色瓶中(6)标准蛋白溶液BSA（0.1 mg/mL）2. 仪器超滤器：截留分子量1万，膜面积50cm2；分光光度计，烧杯，试管，移液管等。
【实验操作】1.膜的清洗：在容器中加入200 mL去离子水，启动蠕动泵，直至去离子水全部滤过；将进液管、回流管和滤过管放入同一个盛有去离子水的容器中。