刘小龙 循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略及临床意义
ctdna的检测评价方法
ctdna的检测评价方法标题：ctDNA的检测评价方法解析循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，简称ctDNA）是近年来肿瘤诊断及治疗领域的研究热点。
ctDNA携带了与肿瘤相关的遗传信息，其检测在肿瘤的早期诊断、疗效评估及预后监测等方面具有重要意义。
本文将对ctDNA 的检测评价方法进行详细解析。
一、ctDNA概述ctDNA是指循环血液中来源于肿瘤细胞的DNA片段，其存在于肿瘤患者的血液中，与肿瘤的种类、分期及治疗效果密切相关。
ctDNA检测具有非侵入性、实时性和动态监测等优点，为肿瘤患者的个体化治疗提供了新的思路。
二、ctDNA检测方法1.数字PCR（digital PCR）数字PCR是一种基于单分子计数的技术，通过将待测DNA模板分配到大量微小的反应体系中，实现对目标DNA的绝对定量。
数字PCR具有较高的灵敏度和特异性，适用于ctDNA的检测。
2.实时荧光定量PCR（real-time PCR）实时荧光定量PCR是一种基于荧光信号的累积与DNA扩增同步的检测技术。
通过特异性引物和探针，实现对ctDNA的定量分析。
实时荧光定量PCR 具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。
3.下调式PCR（downstream PCR）下调式PCR是一种基于目标DNA与内参DNA比值的变化来评估肿瘤负荷的方法。
该方法通过设计特异性引物，使目标DNA与内参DNA在PCR反应中竞争扩增，从而实现对ctDNA的检测。
4.高通量测序（next-generation sequencing，简称NGS）高通量测序技术可在短时间内对大量DNA片段进行测序，通过生物信息学分析，识别出肿瘤相关的基因变异。
NGS在ctDNA检测中具有较高的灵敏度和广泛的应用前景。
5.液滴微流控技术（droplet microfluidics）液滴微流控技术将单个细胞或DNA分子包裹在微小的液滴中，实现单分子水平的检测。
该方法具有高通量、低消耗、快速检测等特点，适用于ctDNA 的检测。
ctDNA在肿瘤诊断和预后应用的研究进展
ctDNA在肿瘤诊断和预后应用的研究进展
郑玲杰;刘舒;王春阳;谭志荣
【期刊名称】《中国临床药理学与治疗学》
【年(卷),期】2016(21)5
【摘要】循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体的检测并称为液体活检,这些可以检测和量化肿瘤突变的技术在肿瘤的临床治疗中的作用越来越受到重视。
来源于肿瘤细胞的游离DNA被称为循环肿瘤DNA。
最近,对核酸分析的敏感性和准确性的最新研究进展为在肿瘤中找到体细胞基因变化的游离DNA提供了依据。
本文综述了循环肿瘤DNA检测在临床中的应用及其局限性。
【总页数】6页(P595-600)
【关键词】循环肿瘤DNA;肿瘤标志物;肿瘤诊断;预后
【作者】郑玲杰;刘舒;王春阳;谭志荣
【作者单位】中南大学湘雅医院临床药理研究所;中南大学临床药理研究所遗传药理学湖南省重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R968
【相关文献】
1.血液肿瘤细胞标记物CTC、ctDNA在胃癌早期诊断中的研究进展 [J], 陈鹏;李盖天
2.肿瘤间质比在恶性肿瘤预后评估中的应用研究进展 [J], 蔡浩;刘江伟;黄建钊
3.循环肿瘤DNA在恶性肿瘤早期诊断和预后的研究进展 [J], 蔡一丹;易帆
4.循环肿瘤DNA甲基化用于肿瘤诊断和预后的研究进展 [J], 王欣悦;孙奋勇
5.ctDNA在肿瘤检测、筛查、预后和治疗中的应用进展 [J], 刘勇
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ctDNA检测技术
ctDNA检测技术循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA）来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，是循环游离DNA（circulating cell—free DNA,cfDNA）的一部分［1]。
ctDNA含有与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变，重排,扩增等[2］；其在血液中的半衰期短，可实时反映肿瘤的动态变化［3];作为液体活检的一种，可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面[4]，因此ctDNA的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、肿瘤的疗效评估、复发监测和预后判断等［5]。
由ctDNA的质量和数量变化大，因此需要高特异性和高灵敏度的检测方法。
目前常用的方法有数字PCR （digital PCR, dPCR)、BEAMing （bead, emulsion，amplification and magnetic）、高通量测序(next generation sequencing, NGS）、ARMS等［6］.1。
数字PCR1999年V ogelstein等提出了数字PCR（digtal PCR，dPCR)的概念［7］。
数字PCR 包括两部分，即PCR 扩增和荧光信号分析。
先将是样品稀释后分配到大量微小的反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。
数字PCR 采用直接计数的方法进行定量分析，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，记为1,无荧光信号的则即为0，理论上，在样品中极限稀释的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA 分子的拷贝数。
但是有的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进行计算[8］.不同于传统的qPCR技术,数字PCR 不受扩增曲线的循环阈值（C T）和扩增效率的影响，无需参照,准确性和重复性好，可实现绝对定量分析［9]。
ctdna检测原理
ctdna检测原理ctDNA（循环肿瘤DNA）检测是一种用于癌症诊断和监测的非侵入性分子生物学技术。
本文将介绍ctDNA检测的原理和应用。
一、ctDNA检测的原理ctDNA是指肿瘤细胞释放到血液中的DNA片段。
由于肿瘤细胞在增殖和凋亡过程中，会释放出大量的DNA片段，这些片段可以通过血液循环到达全身各个器官。
ctDNA检测的原理就是通过分离和分析血液中的ctDNA片段，来检测肿瘤的存在和变化。
ctDNA检测的具体步骤如下：1. 血液样本采集：从患者的静脉血中采集一定量的血液样本。
2. DNA提取：利用特定的试剂盒和方法，将血液中的细胞碎片和ctDNA分离出来。
3. DNA文库构建：将提取到的ctDNA片段连接到DNA文库中，形成ctDNA文库。
4. 下一代测序（NGS）：使用高通量测序技术对ctDNA文库进行测序，得到大量的DNA序列数据。
5. 数据分析：对测序得到的数据进行处理和分析，通过比对数据库中的参考序列，鉴定出其中的肿瘤相关突变。
6. 结果解读：根据数据分析的结果，判断患者是否存在肿瘤，以及肿瘤的类型和突变情况。
二、ctDNA检测的应用1. 癌症早期诊断：ctDNA检测可以在癌症早期发现肿瘤的存在，有助于及早采取治疗措施，提高治疗效果和生存率。
2. 癌症治疗监测：通过定期检测ctDNA的变化，可以评估肿瘤对治疗的敏感性和耐药性，以指导治疗方案的调整。
3. 癌症复发监测：在手术切除肿瘤后，通过检测血液中的ctDNA，可以监测是否存在残留肿瘤细胞或复发情况。
4. 癌症进展预测：通过分析ctDNA中的突变情况，可以预测肿瘤的发展趋势和预后，有助于制定个体化的治疗方案。
三、ctDNA检测的优势和局限性1. 优势：(1) 非侵入性：ctDNA检测只需采集血液样本，无需进行组织活检或手术切除，对患者更加安全和舒适。
(2) 敏感性高：ctDNA检测可以检测到极低浓度的肿瘤DNA，具有较高的敏感性和准确性。
循环肿瘤DNA在淋巴瘤微小残留病检测中的应用
㊃综述㊃基金项目:国家自然科学基金资助项目黏膜相关恒定T 细胞调控造血干细胞移植后肠道移植物抗宿主病发生的机制研究(81870137);国家自然科学基金资助项目针对新靶点m i c r o R N A -153治疗急性移植物抗宿主病的分子机制研究(81670175)通信作者:赵晓甦,E m a i l :Z h a o .x i a o s u @o u t l o o k .c o m循环肿瘤D N A 在淋巴瘤微小残留病检测中的应用高梦鸽,常英军,赵晓甦(北京大学人民医院北京大学血液病研究所,造血干细胞移植治疗血液病北京市重点实验室,北京100044) 摘 要:淋巴瘤的传统诊断和监测工具主要依赖于病理组织活检和影像学检查,但其灵敏度,特异度有限,且不能反映肿瘤的异质性和对患者病情形成有效的动态监测等㊂循环肿瘤D N A (c i r c u l a t i n g t u m o rD N A ,c t D N A )作为肿瘤的新标记物,具有灵敏度及特异度高,创伤小等优点,且其临床相关性也已被部分验证㊂利用c t D N A 监测微小残留病(m i n i m a l r e s i d u a l d i s e a s e ,M R D )可更及时地发现复发,因此c t D N A 有望成为对淋巴瘤诊断,预后评估和M R D 监测的新型分子标记物㊂关键词:淋巴瘤;循环肿瘤D N A ;微小残留病中图分类号:R 733 文献标志码:A 文章编号:1004-583X (2019)05-0467-05d o i :10.3969/j.i s s n .1004-583X.2019.05.018 淋巴瘤是起源于淋巴结和淋巴组织的免疫系统的恶性肿瘤㊂淋巴瘤的传统诊断检测,治疗指导及预后评估主要依赖于病理活组织检查㊁影像学㊁临床特征及国际预后评分指标(i n t e r n a t i o n a l p r o gn o s t i c i n d e x ,I P I )㊂病理活组织检查可以确定肿瘤的分子特征,但容易产生取样偏差且因有创而不易作为监测手段[1-2]㊂目前,正电子发射断层扫描(po s i t r o n e m i s s i o nt o m o g r a p h y ,P E T )和计算机断层扫描(c o m p u t e d t o m o g r a p h y,C T )是评估淋巴瘤缓解状态,指导治疗决策和识别复发的主要工具[1-3]㊂然而,它们对预测治疗失败或即将复发的敏感性不足,其不可忽视的辐射暴露也增加了继发性恶性肿瘤的风险㊂可以检测和量化微小残留病(m i n i m a lr e s i d u a l d i s e a s e ,M R D )的分子技术有望改善淋巴瘤的治疗,其比影像更敏感,且可在无辐射暴露的情况下监测㊂循环肿瘤D N A (c i r c u l a t i n g tu m o rD N A ,c t D N A )作为一种新的肿瘤标记分子,是由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放到外周血液循环中的㊂因此c t D N A 可以反映整体克隆异质性的平均值并且无创地评估分子随时间的变化,以及免于单一部位的取样偏差,能及时有效监测MR D ㊂随着新一代测序(n e x t g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g ,N G S )检测技术的出现,c t D N A 有望应用于临床淋巴瘤的诊断,治疗指导及M R D 的监测(表1)㊂表1 c t D N A 在临床淋巴瘤中的潜在应用项目机制潜在应用早期诊断 基因序列的改变,特异性肿瘤标记物的出现淋巴瘤的早期诊断指导治疗方案 可识别特异基因的改变监测肿瘤负荷和疗效,指导选择治疗方式监测M R Dc t D N A 的灵敏度和特异度均较高监测疗效,评估复发风险1 c t D N A 作为淋巴瘤标记物的机制循环游离D N A (c e l l -f r e eD N A ,c f D N A )指血浆或血清中由健康㊁炎性和肿瘤组织细胞凋亡或坏死后释放产生的游离D N A 的总和,多以约200b p 的双链D N A 碎片的形式存在㊂c t D N A 指来源于肿瘤细胞的c f D N A ,仅占c f D N A 的很小一部分㊂目前认为c t D N A 的来源有3种可能:①凋亡或坏死的肿瘤细胞;②活肿瘤细胞;③循环肿瘤细胞㊂c f D N A 或c t D N A 在血浆㊁尿液及其他体液中以多种形式存在,如游离D N A 片段㊁核小体㊁外泌体㊁病毒体等[4]㊂液体活检是通过检测肿瘤原发或转移部位释放到血液中的循环肿瘤细胞(c i r c u l a t i n g tu m o rc e l l s ,C T C )㊁c t D N A 或其他标记物(如外泌体)对疾病进行诊断和评价的技术,目前多通过检测肿瘤标志性的D N A 序列或肿瘤相关R N A 的表达变异进行分析㊂淋巴瘤是淋巴细胞某一分化阶段的恶性克隆性增生所致的肿瘤,为单克隆性,基因重排片段大小相同㊂每个B 淋巴细胞都有其特异的免疫球蛋白(i mm u n o g l o b u l i n ,I g )基因重排序列,T 淋巴细胞有其特异的T 淋巴细胞受体(T C R )重排序列㊂在B 和T 淋巴细胞分化过程中不断进行I g 和TC R 重排,基于此原理,I g /T C R 的重排克隆性检测能够在一定程度上指导对B /T 细胞克隆性的判断㊂使用重排免疫㊃764㊃‘临床荟萃“2019年5月20日第34卷第5期 C l i n i c a l F o c u s ,M a y 20,2019,V o l 34,N o .5Copyright ©博看网. All Rights Reserved.球蛋白重链(I g H)的聚合酶链反应(p l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R)分析对B细胞淋巴瘤中c t D N A的定量具有相对低的灵敏度,限制了它们的临床效用[5]㊂现代平台将用于I g受体V D J区域的通用P C R引物与N G S相结合,从而对多种B细胞淋巴瘤中的c t D N A进行高灵敏度和特异度检测[6-8]㊂2c t D N A的检测方法外周血c t D N A的高通量测序(h i g h-t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g,H T S)已经成为分析肿瘤基因多样性和克隆进化的非侵入性方法[9-12]㊂随着测序技术的进步,N G S可以检测和量化c t D N A,并可以无创评估肿瘤动态[13-15]㊂N G S技术的出现促进了使用患者特异度靶标进行M R D监测的更先进技术的开发㊂人们可以利用任何淋巴恶性肿瘤具有独特的I g或T C R序列这一分子机制[16-19]㊂如果可以建立肿瘤I g或T C R克隆型,那么该序列可以用于鉴定和定量c t D N A,称为I g N G S方法[20]㊂或者,可以寻找在给定患者的肿瘤中存在的体细胞突变或其他遗传异常,并且可以用于追踪c t D N A,称为m u t N G S方法[20-21]㊂I g N G S方法是已经在血液系统恶性肿瘤中进行了广泛测试的C l o n o S e q平台[8,21-22]㊂这项技术和其他类似的研究方法使用一套针对所有可能的I g H V D J重排的通用引物㊂给定患者的I g H V D J克隆型可通过P C R和肿瘤组织(或外周血)的高通量测序分析来鉴定,其克隆型随后可以与外周血样品类似的方式量化该克隆型以测量M R D[20,22-24]㊂该方法最初由于靶向引物序列中的体细胞突变而受到限制,但现在由于改进的引物设计而表现出灵敏度增加[25]㊂目前m u t N G S方法主要是通过深度测序进行癌症个性化分析(c a n c e r p e r s o n a l i z e d p r o f i l i n g b y d e e p s e q u e n c i n g,C A P P s e q),该方法能够检测c f D N A中的疾病特异度突变[26-27]㊂C A P P s e q首先在实体肿瘤中得到验证,利用疾病特异度"选择器",这是一组外显子和内含子靶标,选择用于覆盖特定癌症类型的已知复发突变区域㊂然后在患者的血液样本中对这些目标进行放大和测序,允许基于肿瘤特异度突变的检测来定量肿瘤D N A,并同时确定个体特异度肿瘤突变的情况㊂该方法可以同时测定所有重要类型的突变,包括单核苷酸变(S N V),插入/缺失(插入缺失),拷贝数改变和重排[14,21,26-27]㊂3c t D N A在淋巴瘤中的诊断及预后价值用于淋巴瘤检测的C T成像标准受到低灵敏度的限制,而P E T成像受到低特异度和不可接受的假阳性率的限制㊂两种成像方法都受到辐射暴露,侵入性和使用频率的限制㊂c t D N A的监测克服了这些局限性,其与肿瘤I g基因相关的独特分子序列理论上应该具有100%的特异度[28]㊂3.1c t D N A与淋巴瘤预后相关实验室检查指标的相关性关于淋巴瘤患者外周血c t D N A的研究结果表明,增高的c t D N A水平与疾病进展,症状出现,增高的乳酸脱氢酶(L D H)水平及高龄相关[29]㊂K u r t z等[8]研究弥漫性大B细胞淋巴瘤(d i f f u s e l a r g e B-c e l ll y m p h o m a,D L B C L)患者的外周血c t D N A水平与L D H水平相关性发现,L D H和c t D N A用于诊断D L B C L的灵敏度分别为59%和88%,差异有统计学意义(P=0.01)㊂S c h e r e r 等[30]纳入76例D L B C L患者的研究结果亦显示100%的预处理样本可检测到c t D N A,但只有37%的样品具有异常高的L D H,表明c t D N A具有很高的的灵敏度㊂上述2项研究结果均表明,c t D N A用于监测D I B C L的灵敏度较高㊂患者外周血c t D N A水平可以反映D L B C L总体肿瘤负荷,并且与肿瘤分期及I P I相关㊂K u r t z等[31]利用C A P P-S e q检测外周血c t D N A,98%的患者可检测到c t D N A,证明了c t D N A具有潜在的普遍适用性㊂3.2c t D N A检测突变基因c t D N A还可以更精确地反映突变频率较高的等位基因变化情况㊂S c h e r e r 等[30]发现D L B C L患者外周血的c t D N A与肿瘤活组织中的D L B C L相关突变基因的一致率为88%,因此可以通过检测D L B C L患者外周血c t D N A中肿瘤亚型特异度突变基因,进行肿瘤细胞来源分层㊂为有效判断c t D N A用于D L B C L基因分型的可行性,R o s s i等[32]将18例D L B C L患者外周血与肿瘤组织中检测到的突变基因进行比较,结果发现在分析肿瘤组织中已检出的基因突变在外周血c t D N A 中分布时,c t D N A检测灵敏度高达82.8%,而外周血c t D N A中未检测到的突变基因,则在肿瘤组织中通常呈低表达㊂在检测变异等位基因频率(v a r i a n t a l l e l e f r e q u e n c y,V A F)时,V A Fȡ20%的突变基因与V A F<20%的突变基因相比,c t D N A的检测灵敏度显著增高㊂表明c t D N A可以更精确地反映突变频率较高的等位基因的变化情况㊂c t D N A在其灵敏度和特异度上均优于传统检测方法,能够反映肿瘤的异质性和对肿瘤形成有效地动态监测㊂虽然c t D N A检测具有较大优势,但目前仍没有研究结果能够证实其可以完全取代活组织检查成为诊断肿瘤的金标准,c t D N A具有取代活组织检查检测耐药突变基因的潜力,指导患者个体化治疗,或者作为活组织检查的补充,检测新突变基因㊂㊃864㊃‘临床荟萃“2019年5月20日第34卷第5期 C l i n i c a l F o c u s,M a y20,2019,V o l34,N o.5Copyright©博看网. All Rights Reserved.4c t D N A与淋巴瘤微小残留病灶的监测在早期B细胞分化期间,发生I g基因的不同区段的重排㊂每个肿瘤淋巴细胞都具有相同重排的I g H基因,使其成为B淋巴细胞M R D监测的理想肿瘤特异度标记物[33]㊂大部分研究结果证实,c t D N A 对淋巴瘤复发监测与预后评估的灵敏度高于现有的影像学检查技术[28,34-35]㊂监测一系列血液系统恶性肿瘤中的M R D可以筛选出标准治疗后复发风险高的患者㊂4.1c t D N A对套细胞淋巴瘤(m a n t l e c e l l l y m p h o m a,M C L)和滤泡细胞淋巴瘤(f o l l i c u l a r l y m p h o m a,F L)M R D的监测目前,M R D检测被认为对急性淋巴细胞白血病(a c u t el y m p h o c y t i c l e u k e m i a,A L L)的临床决策至关重要㊂在治疗初始阶段检测M R D,结合其他相关的临床和生物学特征,确定患者风险分层[5]㊂最近的证据表明在成熟淋巴肿瘤中N G S技术可以成为基于P C R的M R D 检测的替代方法[37]㊂基于这些证据,利用c t D N A分子技术监测M R D也有望在淋巴瘤患者中实施㊂目前,该方法已应用于A L L及以I g H基因作为靶标的M C L㊂尽管M C L一线管理已经取得了显着的进展,预计中位无进展生存(p r o g r e s s i o n-f r e es u r v i v a l,P F S)时间已超过5年,但目前M C L仍是不可治愈的疾病㊂M C L中的M R D,可以以多种方式监测,例如,可以使用M R D评估来研究c t D N A的定量水平是否在缓解期患者诱导结束时具有预后意义㊂P o t t等[36]研究分析147例M C L患者外周血,结果显示M R D 阴性患者和M R D阳性患者2年缓解率分别为88%和64%㊂与M R D阳性组中24%患者的复发相比, M R D阴性组中8%的患者复发㊂仅评估骨髓时, M R D的影响更为突出,分析91例患者骨髓,M R D 阴性患者2年缓解率94%,M R D阳性患者2年缓解率58%㊂F L虽然也不能用常规治疗,但比D L B C L 和M C L更加惰性㊂鉴于这一漫长的过程,缺乏对M R D进行长期随访的高质量前瞻性研究㊂目前大多数研究利用疾病定位易位t(14;18)(q32;q21),其导致B C L2基因与I g H增强子序列的并置,这种易位被认为是淋巴瘤发生的重要驱动因素[37]㊂在大多数研究中,I g H-B C L2的治疗后检测显示出良好的结果㊂可以预见,M R D阴性患者在不同时间点,无论是在引入抗C D20单克隆抗体治疗之前还是之后,在骨髓和外周血中都有比M R D阳性患者更长的P F S[28,38]㊂尽管目前还没有这方面具体的实验数据,我们推测N G S技术也可以应用于F L,利用靶向肿瘤特异性突变或I g重排㊂随着N G S测序技术的发展,希望将M R D检测纳入大量M C L和F L临床试验中,推动治疗决策制定,更接近个性化和动态优化的患者护理的目标㊂4.2c t D N A对弥漫性大B细胞淋巴瘤微小残留病的监测D L B C L是最常见的非霍奇金淋巴瘤(N H L),大多数患者在接受一线治疗后达到缓解,然而在影像学监测疗效并指导干预的情况下,仍有多达40%的患者出现复发,且大多数是无法治愈的,尤其是早期进展或肿瘤负荷显著的患者[39]㊂一些研究表明,监测中持续的M R D阴性可高度预测持续缓解,几乎所有仍处于缓解期的患者都维持M R D阴性[6,8]㊂由于复发始于持续肿瘤的MR D,其低于成像扫描的最低阈值,影响淋巴瘤患者的预后及生存率㊂研究显示,对于可检测到的c t D N A的患者,与从未检测到D N A的患者相比,临床疾病进展的风险比为228㊂此外,监测c t D N A的阳性预测值为88.2%,阴性预测值为97.8%,灵敏度为88.2%,特异度为97.8%㊂患者在出现临床证据之前到肿瘤相关的3.5个月内可检测到c t D N A[6]㊂K u r t z等[31]实验中发现,具有早期分子反应[e a r l y m o l e c u l a r r e s p o n s e,E M R;定义为在一个治疗周期后c t D N A 水平降低>100倍(2-l o g)]和具有主要分子反应的患者(m a j o rm o l e c u l a r r e a c t i o n,MM R;定义为两个周期后>2.5-l o g降低)24个月无病生存(E F S)率分别是83%v s50%和82%v s46%㊂因此,c t D N A定量可以在临床实践中用作个体患者的预后指标,指导患者个体化治疗㊂5c t D N A临床应用前景c t D N A作为一种新的肿瘤标记物,可用于评估监测淋巴瘤预后,指导治疗方案的选择,具有提高患者长期生存率的巨大潜力㊂尽管c t D N A的临床相关性已被验证,但是将该技术应用于常规临床实践仍需要进一步证明其临床有效性,并且建立统一的临床标准㊂N G S分子技术监测M R D的临床可行性仍处于起步阶段㊂特别是,需要确定新开发技术的预后意义㊂事实上,到目前为止,很少有研究报告不同分子工具对临床结果的影响㊂然而,许多发表的研究是在相对较小的一系列患者中进行的,在某些情况下是在回顾性分析中进行的㊂大多数支持新分子工具与患者预后相关的证据来自液体活检应用,特别是对于D L B C L和F L㊂同时以N G S为基础的方法往往用时长㊁成本高,这为其临床应用带来了困难㊂但是随着测序技术的进步,测序所需时间会逐渐缩短,成本会进一步降低㊂目前在淋巴瘤领域的㊃964㊃‘临床荟萃“2019年5月20日第34卷第5期 C l i n i c a l F o c u s,M a y20,2019,V o l34,N o.5Copyright©博看网. All Rights Reserved.c t D N A相关研究主要针对N H L中D L B C L㊁F L及霍奇金淋巴瘤等B细胞淋巴瘤,而对T细胞淋巴瘤研究较少㊂这可能是因为T细胞淋巴瘤的基因突变较多,特异性较差,在疾病进展中容易出现克隆演变,从而使得c t D N A检测相对困难[40]㊂因此, c t D N A在淋巴瘤中的应用仍不成熟,需要更多的研究来进一步论证,亦需要研究更多种类的淋巴瘤,以明确其在全部淋巴瘤中的有效性㊂参考文献:[1] T h o m p s o nC A,G h e s q u i e r e sH,M a u r e rM J,e t a l.U t i l i t y o fr o u t i n e p o s t-t h e r a p y s u r v e i l l a n c e i m a g i n g i n d i f f u s e l a r g eB-c e l ll y m p h o m a[J].JC l i nO n c o l,2014,32(31):3506-3512.[2] H u n t i n g t o n S F,S v o b o d a J,D o s h iJ A.C o s t-e f f e c t i v e n e s sa n a l y s i so f r o u t i n e s u r v e i l l a n c e i m a g i n g o f p a t i e n t sw i t h d i f f u s el a r g eB-c e l l l y m p h o m ai nf i r s tr e m i s s i o n[J].JC l i n O n c o l,2015,33(13):1467-1474.[3] A d a m sH J,N i e v e l s t e i n R A,K w e e T C.P r o g n o s t i cv a l u eo fi n t e r i m a n d e n d-o f-t r e a t m e n t F D G-P E T i n f o l l i c u l a rl y m p h o m a:a s y s t e m a t i c r e v 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ctDNA高通量测序临床实践专家共识(2022年版)
ctDNA高通量测序临床实践专家共识(2022年版)中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会;步宏;邢金良;吴斌;辇伟奇;于津浦;袁响林;张海伟;蔡明;程俊;申鹏;唐万燕;严令华;尤俊;张哲;赵伟鹏【期刊名称】《中国癌症防治杂志》【年(卷),期】2022(14)3【摘要】循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)高通量测序在肿瘤临床诊疗中发挥越来越重要的作用,但其临床检测标准和应用范围尚缺乏统一认识。
中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会组织相关专家,结合国内临床实践,参考国内外文献,从ctDNA生物学特征、检测影响因素,ctDNA高通量测序检测结果的临床应用价值和范围,以及ctDNA高通量测序检测体系的标准化建设等方面进行评述,提出专家意见,经专家组讨论并形成7条专家共识,为ctDNA高通量测序的临床应用和检测提供参考,以促进ctDNA高通量测序的健康规范发展。
【总页数】13页(P240-252)【作者】中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会;步宏;邢金良;吴斌;辇伟奇;于津浦;袁响林;张海伟;蔡明;程俊;申鹏;唐万燕;严令华;尤俊;张哲;赵伟鹏【作者单位】不详;四川大学华西医院;空军军医大学;重庆市中医院;天津医科大学肿瘤医院;华中科技大学同济医学院附属同济医院;重庆大学附属肿瘤医院;华中科技大学同济医学院附属协和医院;南方医科大学南方医院;上海桐树生物科技有限公司;厦门大学附属第一医院;广州燃石医学检验所有限公司【正文语种】中文【中图分类】R730.4【相关文献】1.结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识2.骨与软组织肿瘤二代测序中国专家共识(2021年版)3.中国乳腺癌新辅助治疗专家共识(2022年版)4.《早期乳腺癌女性患者的骨健康管理中国专家共识(2022年版)》专家组5.埋线提升术操作专家共识之强生鱼骨线/螺旋线操作共识(2022年版)因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略与临床意义
含量低，约占整个循环DNA的1%，甚至 只有0.01%。
ctDNA发展简史
1948年首次发现人体血液中存在着循环DNA，癌症患者的循环肿瘤 DNA则发现于1977年。
1994年发现这些DNA含有癌症的标志性突变，证明其来自于肿瘤。 鉴于肿瘤DNA会流入血液，香港中文大学的卢煜明（Dennis Lo）教
肿瘤诊疗的困境：早期诊断 困难，错过最佳治疗时机； 易复发转移，预后差；放化 疗易产生耐受；缺乏有效的 治疗靶点等。
早诊早治，实时监控、靶向 用药及个体化诊疗是提高肿 瘤远期生存率、降低死亡率 的关键。
肿瘤诊断方法
血清标志物：蛋白类（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白 等），核酸类（microRNA, LncRNA）
ctDNA检测技术
已知突变位点检测 （突变率< 2%）
l数字PCR lBEAMing技术 l标记扩增深度测序 （TAM-Seq） l癌症个体化深度测 序 (CAPP-Seq)
敏感度
未知突变位点检测 （突变率> 2%）
l全基因组测序 l全外显子测序 lRNA末端平行分析 法 l全基因组甲基化测序
数字PCR
CEA: P = 0.03
Comparison of ctDNA, CEA and imaging dynamics in individual study subjects
l 病人都经过多次手术和化疗 l 第一次手术进行局部切除时，
ctDNA含量并没有降低；第 二次手术完全切除时， ctDNA含量大幅下降。 l ctDNA能实时显示病人体内 肿瘤负荷的动态信息，以及 治疗的效果（手术及化疗）。
循环肿瘤细胞与ctDNA在胰腺癌诊疗中应用进展
循环肿瘤细胞与ctDNA在胰腺癌诊疗中应用进展摘要] 胰腺癌是我国常见的极度恶性肿瘤之一，研究表明胰腺癌早期诊疗效果好，能明显改善预后，因此找到敏感性好特异性强的生物标志物临床意义重大。
本文就循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA在胰腺癌患者早期诊断、疗效评估及预防复发转移等上的最新应用进展做一综述。
[关键词] 胰腺癌; 循环肿瘤细胞; 循环肿瘤DNA; 综述近年来，循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA的临床价值越来越受重视，在乳腺癌、食道癌、前列腺癌等各大恶性肿瘤上取得了不错进展，已有很多学者通过对胰腺癌患者外周血的循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA定性定量检测，发现了两者在胰腺癌诊疗过程中的价值。
1 循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）是由肿瘤原发或者转移灶自发脱落或诊疗操作导致落入外周血液循环的肿瘤细胞。
1869年，Ashworth教授在1例肿瘤细胞转移患者的外周血液发现了与原发灶组织细胞生物学特性极其相似的细胞，后来的研究表明，这些细胞源于原发灶，从肿瘤组织脱落入血液循环后由于细胞微环境改变，大部分细胞生存期很短，而存留的细胞具有很强的生存力、侵袭力，往往能发展为微小的癌栓甚至巨大转移灶，成为肿瘤转移的重要原因。
2 循环肿瘤DNA循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）是由肿瘤细胞释放入外周血的基因组片段，与肿瘤组织的生物学特性相关，1977年Leon等发现肿瘤转移患者cfDNA水平高于健康人，且晚期患者水平更高，由于技术限制，研究者们不清楚cfDNA来源及与肿瘤组织的关系，十几年后，研究发现这些DNA来源于原发灶、转移灶及循环血液活的、凋亡或者死亡的肿瘤细胞，且具有肿瘤标志性突变，并称之为循环肿瘤DNA，因此ctDNA用于诊断、监测肿瘤的进展具有重要潜在价值，近期有关 ctDNA的研究进展迅速，有研究发现，在大多数癌症患者ctDNA中有基因突变，根据突变制定个性化治疗方案前景可观而且突变频率与治疗效果也具有相关性。
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刘小龙， 博士、研究员 福建医科大学孟超肝胆医院，中国科学院海西研究院转化医学研究中心
2015.06.12
肿瘤诊疗的困境：早期诊断
困难，错过最佳治疗时机； 易复发转移，预后差；放化
疗易产生耐受；缺乏有效的
治疗靶点等。
早诊早治，实时监控、靶向
用药及个体化诊疗是提高肿 瘤远期生存率、降低死亡率
的关键。
肿瘤诊断方法
血清标志物：蛋白类（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白 等），核酸类（microRNA, LncRNA） 影像学诊断(超声，CT，MRI，PET，PET-CT)
循环肿瘤细胞（circulating tumor cell , CTC）
循环肿瘤DNA（ circulating tumor DNA，ctDNA）
利用数字PCR监测肺癌病人中第一 次服用埃罗替尼抗肿瘤药物后的 血浆EGFR突变情况。 经过治疗后，所有病人的EGFR突 变都出现下降，其中有8个病人突 变完全消失。 有6个病人的EGFR突变在后续出 现上升，提前揭示疾病进展。另 外3个病人的EGFR突变没有变 化，病情无明显进展。 数字PCR可以用于评估和监测血浆中ctDNA的特异突变
瘤的动态发展中具有更高的灵敏度。
血浆中ctDNA的含量与预后密切相关，含量越高，病人的5年生存率越低（P<0.001）。 ctDNA含量的增高及CTC数目的增加，病人的预后显著变差，而CA15-3没有预后判断功能。
监测ctDNA的突变率 比监测cfDNA浓度， 对胃癌动态发展的监 控灵敏度更高。
利用区域捕获测序技术检测乳腺癌原发瘤及肝脏转移瘤的基因突变情况，并
监控血液中ctDNA在治疗过程中的动态变化。
ctDNA在监测肿瘤的动态发展中具有更高的灵敏度和特异性； ctDNA能比蛋白类标志物CA15.3更早的预测肿瘤动态发展情况。
相对于传统的影像学及蛋白类血清标志物，通过评估ctDNA的突变频率能更 早、更准确的预测结肠癌患者肿瘤经治疗后的动态发展情况。
只有0.01%。
ctDNA发展简史
1948年首次发现人体血液中存在着循环DNA，癌症患者的循环肿瘤 DNA则发现于1977年。 1994年发现这些DNA含有癌症的标志性突变，证明其来自于肿瘤。
鉴于肿瘤DNA会流入血液，香港中文大学的卢煜明（Dennis Lo）教
授推测胎儿DNA应该也能进入血液。1997年证明孕妇血液中携带着男 性胎儿的Y染色体。该发现允许医生们在怀孕初期通过无创方式检测
能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；
能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移 和复发等方面），并进行个性化的治疗方案指导（如个性化靶向药物用 药，个性化化疗等）。
ctDNA检测技术
已知突变位点检测 （突变率< 2%）
未知突变位点检测
（突变率> 2%）
数字PCR BEAMing技术 标记扩增深度测序 （TAM-Seq） 癌症个体化深度测
BEAMing技术
结合数字PCR与流式技术，利用特异性PCR引物扩增目标突变区后，与磁珠（磁
珠上固定有特异的PCR 引物）混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后， 利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出红色或绿色荧光。使用流
式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。
利用肿瘤组织进行sanger测 序定义肿瘤组织的基因突 变； 再利用Beaming技术检测18 例癌症病人中192份血浆样 本中ctDNA的突变情况，
循环肿瘤DNA(ctDNA)
人体血液循环系统中不断流动的携带一
定特征（包括突变，缺少，插入，重排，
拷贝数异常，甲基化等）来自肿瘤基因 组的DNA片段；
来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、
来自于凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细 胞；4、来自于肿瘤细胞分泌的外排体；
含量低，约占整个循环DNA的1%，甚至
敏感度
全基因组测序 全外显子测序 RNA末端平行分析 法 全基因组甲基化测 序
序 (CAPP-Seq)
数字PCR
将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包
含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩 增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。
病人都经过多次手术和化疗
第一次手术进行局部切除
时，ctDNA含量并没有降 低；第二次手术完全切除 时，ctDNA含量大幅下降。 ctDNA能实时显示病人体内
肿瘤负荷的动态信息，以及
治疗的效果（手术及化 疗）。
标记扩增深度测序（TAM-Seq）
二步扩增： 预扩增：利用特异性引物进行15偱环的 目标区域扩增 标签扩增：利用通用不同特性的接头标 签进行二次扩增 双向重复测序：提高测序精度 突变频率检出率可达2% 敏感性和特异性高于97% 成本较低，利于临床应用
5
微卫星杂合性
ctDNA的分析指标
1 2 3
cfDNA含量
cfDNA完整性 ctDNA突变频率 ctDNA甲基化频率
4
5
微卫星杂合性
乳腺癌病人（尤其在转移性
乳腺癌）的血浆cfDNA的完 整性显著下调，而血浆
cfDNA的浓度显著上调，可
作为早期诊断的标志物，具 有较好的敏感度和特异性。
肝癌病人的血浆中存在两种不同长度的DNA分子：短链DNA分子（<150bp）和长 链DNA分子（ >180bp ）； 短链DNA分子与ctDNA突变率及拷贝数异常相关，且与ctDNA浓度正相关； 长链DNA分子不携带肿瘤相关ctDNA特征，且与ctDNA浓度负相关。
73%, 57%, 48%, 50% 。
相对于原发癌，ctDNA在转移癌中检出率更高，且分期越高，ctDNA检出率也更高；
可用于耐药突变的检测； ctDNA是普遍适用的、敏感和特异的标志物,可用于不同类型癌症患者的临床监测。
N Engl J Med 2013; 368:1199-1209
设计了48对引物去扩增
TP53，EGFR，BARF， KRAS等癌症相关基因的
5995bp突变区域
同时可对10个特异的癌症突 变位点进行监控
用于确定多发癌症患者的复
发病灶 用于监控癌症患者的肿瘤动
态发展
癌症个体化Leabharlann 度测序 (CAPP-Seq) 该方法利用定制化的突变位点
库作为”筛选器”， 对样本进
ctDNA的分析指标
1 2 3
cfDNA含量
cfDNA完整性 ctDNA突变频率 ctDNA甲基化频率
4
5
微卫星杂合性
利用亚硫酸氢盐平行测序检测不 同肿瘤患者（肝癌，乳腺癌，肺 癌，鼻咽癌等）血浆DNA甲基化 发生情况及血浆DNA拷贝数异常 情况，用于肿瘤的诊断及肿瘤负 荷的监测； 血浆中甲基化癌症诊断灵敏度为74% ，特异性为94%，具有较好的癌症诊断应 用价值。
线粒体DNA可用于肝癌的诊断
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):E1317-25. doi: 10.1073/pnas.1500076112. Epub 2015 Feb 2. Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients.
在30例转移性乳腺癌患 者接受系统性治疗的不 同时间点测定血液中的 ctDNA，CA 15-3， CTC 细胞的含量，比较三者 之间的敏感度。
Comparison of Circulating Tumor DNA, CA 15-3, and Circulating Tumor Cells as BloodBased Biomarkers
PLoS One. 2015; 10(4): e0108247.
ctDNA的分析指标
1 2 3
cfDNA含量
cfDNA完整性 ctDNA突变频率 ctDNA甲基化频率
4
5
微卫星杂合性
利用数字PCR检测640例不同癌症病人的血浆ctDNA，在超过75%的病人血液中 检测到ctDNA，原发癌检出率约为50%。 在结肠癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA检出率分别为
灵敏度： 偱环肿瘤DNA：85%
CA 15-3：59%
灵敏度：
偱环肿瘤DNA：90%
偱环肿瘤细胞：67%
Comparison of Circulating Biomarkers to Monitor Tumor Dynamics and Predict Survival.
结论：相对于蛋白类诊断标志物CA15-3及血液中的偱环肿瘤细胞，ctDNA在监测肿
肝癌病人血浆中线粒体DNA的含量显著高于健康人、乙肝及肝硬化患者，对肝癌的 诊断具有较高的灵敏性和特异性，分别达80%和94%，可作为肝癌诊断的有效分子 标记。
J Clin Pathol 2013;66:775-778
American Journal of Clinical Pathology 2015; 143(1):18-24.
泊松分布
●: 阳性微滴（ : 靶标分 1） ○: 阴性微滴（ 0） : 子
有限稀释 一个 待分析的PCR反应体系 成千上万个 独立的PCR反应体系
PCR扩增
泊松分布 阴性微滴比例推算 起始靶分子的绝对量
优点：可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%； 缺点：只能检测已知的突变位点，通量低；
检测灵敏度可达到
0.005%。
术前:13.4%
术后:0.015%
术后(48天):0.11%