牛骨胶原在[Emim]Br离子液体中的变性作用

第32卷 第6期 2017年12月

天津科技大学学报

Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 32 No. 6

Dec. 2017

收稿日期：2016–06–16；修回日期：2016–10–02 基金项目：国家自然科学基金资助项目(21476175) 作者简介：张贵芳（1992—），女，河北人，硕士研究生；通信作者：邓 宇，教授，dengyu@tust.edu.cn

牛骨胶原在[Emim]Br离子液体中的变性作用 张贵芳，阮孝慈，邓 宇 (天津科技大学化工与材料学院，天津 300457)

摘 要：1–乙基–3–甲基溴代咪唑([Emim]Br)离子液体对牛骨胶原具有一定的溶解作用，溶解后以水为沉淀剂得到再生物质．对再生物质进行FTIR、UV、SDS-PAGE凝胶电泳，SEM和DSC分析以确定再生物质成分和结构，从而确定牛骨胶原在离子液体中的变性过程．结果表明：再生物质不存在胶原特有的三股螺旋结构，但仍存在肽键结构，为小分子质量多肽，说明溶解过程中离子液体使牛骨胶原变性，不仅对牛骨胶原的网状结构有破坏作用，同时使牛骨胶原三股螺旋结构和肽链遭到破坏，胶原发生不可逆变性． 关键词：离子液体；牛骨胶原；胶原变性；再生；小分子多肽 中图分类号：TQ028.8 文献标志码：A 文章编号：1672-6510(2017)06-0036-05

Denaturation of Bovine Bone Collagen in Ionic Liquids ZHANG Guifang，RUAN Xiaoci，DENG Yu (Collage of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457，China)

Abstract：1-ethyl-3-methylimidazolium bromide([Emim]Br)ionic liquid was used to resolve bovine bone collagen. Deion-ized water was then employed as precipitant to get the regenerated substance．Fourier transform infrared spectros-copy(FTIR)，ultraviolet spectroscopy(UV)，SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)，scanning electron mi-croscope(SEM)and differential scanning calorimetry(DSC)have been used to identify the chemical components and struc-ture of the regenerated substance，which can indicate the denaturation of bovine bone collagen in ionic liquids．The results indicated that the regenerated substance turns out to be small molecular polypeptide without helical structure，but still has peptide bonds．The crystalline portion of the bovine bone collagen was destroyed and the collagen denaturation isirreversible，revealing the ionic liquid could lead to the denaturation of bovine bone. Key words：ionic liquid；bovine bone collagen；collagen denaturation；regeneration；small molecular polypeptide

胶原蛋白(或称胶原)是存在于细胞外间质中，具有三股螺旋结构的蛋白质的总称[1–2]，目前确认的胶原蛋白类型有27种[3–6]．胶原蛋白在食品、美容化妆品、动物养殖、医学等行业都具有广泛应用，所以对胶原蛋白的研究也日益增多．胶原蛋白在高低等动物组织中广泛存在，如脊椎动物线虫、蚯蚓等体表面的角质层，哺乳动物结缔组织如皮、骨、肌腱、韧带、血管．相关调查发现市售胶原蛋白主要源于动物的皮和骨骼，如猪皮、鱼皮、鸡皮和畜骨等[7]．因此，如何高效获取高质量胶原蛋白成为研究重点． 提取胶原蛋白的研究对象主要以猪皮、兔皮、鱼皮、牛肌腱、牛骨、羊骨、猪骨、鸡骨、鱼鳞等为主，提取胶原的方法依据原材料的不同而有所不同，从动物

的结缔组织中提取胶原时多采用酸溶法[8–9]、酶溶 法[10–11]、酸–酶结合法[12–13]；从铬革屑中提取胶原时

可采用碱处理法、碱–酶处理法、氧化法、酸处理法、酸碱交替处理法及酶处理法等[14–16]．在提取动物骨

骼中的胶原蛋白时，先采用酸溶法、酶溶法和碱溶法对骨骼进行预处理，除去骨骼中的羟基磷灰石，然后再提取骨骼中的Ⅰ型胶原蛋白[17–22]．由于离子液体

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20160216 2017年12月 张贵芳，等：牛骨胶原在[Emim]Br离子液体中的变性作用·37· 对有机物具有良好的溶解性，离子液体提取胶原的方法日益成为研究热点．Hu等[23]利用1–乙基–3–甲基咪唑醋酸盐离子液体混合系列钠盐，牛凤英等[24]利用氯代–1–烯丙基–3–甲基咪唑离子液体分别对猪皮进行溶解发现胶原蛋白在离子液体中具有良好的可溶性．郭佳荣等[25]合成3–甲基–1–乙氧羰基甲基咪唑

氯盐和3–甲基–1–乙氧羰基甲基咪唑溴盐对胶原蛋白粉进行溶解，发现两种离子液体为胶原蛋白的直接溶剂．孙艳丽等[26]以离子液体1–烯丙基–3–甲基咪唑

氯盐为主溶剂，以巯基乙醇为辅助试剂，发现羊毛纤维在该体系中可直接溶解．任厚朋等[27]合成多种离

子液体对丝素蛋白进行溶解并筛选出了1–丁基–3–甲基咪唑乙酸盐和1，3–二甲基咪唑磷酸二甲酯盐两种溶解效果较好的离子液体．以上报道中，醋酸盐类离子液体对胶原的溶解温度多在100,℃以下；卤代离子液体对胶原的溶解温度多在100～160,℃，在水、甲醇、乙醇等再生试剂的作用下可得到结构未发生变化的再生胶原． 离子液体由阴阳离子构成，阴阳离子间存在相当大的库仑力，使得离子液体对许多有机物或无机物具有较强的溶解性．同时离子液体既可以接受电子又可以给出电子，使其可以与许多物质形成氢键，当离子液体与物质形成的氢键强于物质本身的氢键时，就可以达到使物质溶解的目的．本文选用[Emim]Br离子液体对牛骨胶原进行溶解，以水为沉淀剂得到再生物质，并对其进行表征，以确定溶解过程中离子液体

中牛骨胶原蛋白是否会发生变性作用，并探究在变性过程中离子液体对牛骨胶原蛋白产生何种作用．

1 材料与方法 1.1 原料与仪器 N–甲基咪唑，分析纯，临海市凯乐化工厂；溴乙烷，分析纯，天津市光复精细化工研究所；二氯甲烷，分析纯，天津市江天化工技术有限公司；牛骨，实验室自备． JT302N型分析天平，上海精密科学仪器有限公司；RE–52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB–Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DH–101型电热恒温鼓风干箱，天津市中环实验电炉公司；DF–101S型集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器厂；WQF–510型傅里叶变换红外光谱仪

(FTIR)，北京第二光学仪器厂；756,pc型紫外可见分

光光度计(UV)，上海光谱仪器有限公司；DSC7型差示扫描量热仪(DSC)，美国Perkin-Elmer公司；JSM–6380LV型扫描电子显微镜(SEM)，日本电子公司． 1.2 原料牛骨处理 新鲜牛骨用清水清洗，除去残肉、脂肪和结缔组织等，倒入水中加热，水量以浸没骨头为宜，煮沸后使水温保持在70～80,℃约3～4,h以除去骨油．牛骨

晾干砸成长3,cm、宽1,cm小块去除骨髓后用高速多功能粉碎机粉碎5,min，取10～60目骨粉备用． 1.3 [Emim]Br离子液体的制备 以物质的量比1∶1.3分别称取N–甲基咪唑和溴乙烷适量，将二者置于三口烧瓶中混合，加氮气保护，在30,℃水浴中加热回流直至出现浑浊，升温至60,℃反应3,h．回流速度逐渐降低，回流量逐渐减

少，溶液黏度逐渐增大，反应结束时几乎无回流．用旋转蒸发仪除去过量的溴乙烷，待溶液冷却后会出现白色或浅黄色结晶．将得到的离子液体进行称量，计算收率后备用． 1.4 牛骨胶原蛋白在离子液体中的溶解及再生 称取一定量的离子液体和牛骨置于三口烧瓶中，140,℃油浴加热，反应4,h后趁热用铜网过滤，去除未反应的较大颗粒的牛骨粉，待离子液体温度降至30,℃时加入二氯甲烷，充分混合后进行抽滤，滤液为含骨胶原的离子液体． 滤液转移至分液漏斗中，加入蒸馏水充分混合后静置24,h．得到的再生物质用蒸馏水少量多次洗涤以除去残存的离子液体和二氯甲烷，干燥后称量，进行表征． 1.5 再生物质的表征 红外光谱分析：将再生物质与KBr共同压片，进行红外光谱分析，扫描次数为16次，扫描范围为400～4,000,cm–1．

紫外光谱分析：将再生物质溶解在0.5,mol/L的乙酸溶液中进行紫外光谱分析，扫描范围为190～400,nm． SDS-PAGE垂直电泳分析：10%,分离胶，4.8%,浓缩胶；电泳缓冲液为Tris-Gly缓冲液(pH 8.3，0.1%, SDS)；样品缓冲液为0.5,mol/L pH 6.8,Tris-HCl 缓冲液；0.1%,考马斯亮兰R-250甲醇水染色液．电泳采用直流恒压电源，浓缩胶电流为15～20,mA，分离胶电流为30～45,mA，距分离胶底端0.5～1,cm处时停止

电泳． 微观结构观察：取适量再生物质用导电胶固定于