分子标记种类及概述

分子标记概述

遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。

早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。

与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

分子标记种类

利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。

一、基于分子杂交的分子标记

这类标记利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。

（一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）

限制性片段长度多态性是出现最早和应用最广泛的DNA标记技术之一。1974年Grodzicker等创立了该技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP 标记非常稳定，它是一种共显性标记，在分离群体中可区分纯合体与杂合体，提供标记位点完整的遗传信息。多种农作物的RFLP分子遗传图谱已经建成。但其分析所需DNA量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，尽管可用非放射性同位素标记方法代替，但成本高、成功率低，且实验检测步骤较多，依然影响其使用、推广。自RFLP 问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。

RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

图7-2 RFLP图谱

（二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）

小卫星DNA（Minisatellite DNA）又称数目可变串联重复序列（V ariable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10—10000不等。多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂交检测出。其缺点是多态性分布集中，数量有限，而且在基因组上分布不均匀，合成探针困难，实验操作繁琐、检测时间长、成本高，因此应用并不广泛。

VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多

小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。

二、基于PCR技术的分子标记

（一）、随机引物的PCR标记

(1) 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）

随机扩增片段长度多态性DNA，是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA 序列为引物，扩增时退火温度降至35℃左右。与其它标记相比，RAPD具有以下优点：a）技术简单，检测速度快；b）成本较低；c）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析；d）操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖基因组的分析；e）不需制备探针、杂交等程序，成本较低；f）DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析），允许快速、简单地分离基因组DNA。同时RAPD也存在一些缺点：a）RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；b）存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；c）RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。

基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。

RAPD已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。

图7-4 RAPD图谱

（2）任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP—PCR)

在AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ，PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR 产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。

AP—PCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。AP—PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。

（3）DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)

DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为5一8 bp)，因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。PCR 扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。

（二）、特异引物的PCR标记

特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的DNA区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为18—24 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组DNA的特定

区域进行多态性分析。

（1）序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)

STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD 那样存在某种模糊性。

（2）简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)

简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。

SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。

（3）序列特异性扩增区(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR)

SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因DNA片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。

（4）单引物扩增反应(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)

SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个引物，但所用的引物是在SSR的基础上设计的。这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异性结合，然后通过P(：R技术扩增SSR之间的DNA序列，凝胶电泳分离扩增产物，分析其多态性。另外，

还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR ( Inverse Sequence—tagged Repeat)技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DIV A序列。

（5）DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)

SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析目的。为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便。

（6）双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints，ddF )

ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。

（7）DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA)

直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。

（8）Inter-Alu PCR like genomic profiling

与SPAR技术相近，也只用一个引物，但所用的引物是在Alu序列（为中等重复序列）的基础上设计的，扩增的是Alu序列之间的DNA序列。

（9）ISTR (inverse sequence-tagged repeat)

这种技术与SPAR技术也相近，也所用的引物是在copia序列〔反向重复序列〕的基础上设计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列。

（10）IFLP (intron fragment length polymorphism)

检测的对象是内含子的长度差异。

（11）RAMPO (random amplified microsatellite polymorphism)

RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近，但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的随机引物（即RAPD引物）对基因组DNA扩增，用电泳将扩增片段分开，然后，把凝胶转移到尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记（或其它标记）的与SSR 互补的寡核苷酸探针（如[CA]8和[ga]8）杂交，放射自显影后可得到新的多态性类型。

（12）RFLP-PCR

先找到RFLP标记后，对RFLP探针进行测序，再合成适当的PCR引物，这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。

(13) SRAP 技术

简单序列重复(Inter-simple sequence repeat)(sequence-specific amplification polymorphism)相关序列扩增多态性(Sequence—related amplifiedpolymorphism，SRAP)是一种新型的基于PCR的标记系统，是由美国加州大学蔬菜系Li与Quiros博士于2001年在芸薹属作物开发出来。该标记通过独特的双引物设计对基因的ORFs(Open reading frames)的特定区域进行扩增，上游引物长17bp，对外显子区域进行特异扩增。下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方面.

三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记

（一）扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )

AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和V os发展起来的一种检测DN A多态性的新方法。

AFLP 是RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA 产生不同大小的DNA片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1—10 bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP 结合了RFLP 和RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。

图7-5 AFLP的银染检测结果

（二）酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS )

CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19—27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。GAPS标记揭示的是特异PGR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。

四、基于DNA芯片技术的分子标记技术

核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)

SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每1000 bp SNP出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测SNP 的最佳方法是DNA芯片技术。SNP 被称为第三代DNA分子标记技术，随着DNA芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技。

分子标记的应用领域

一、基因组作图和基因定位研究

长期以来，各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物，而且图谱分辨率大多很低，图距大，饱和度低，因而应用价值有限。分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一。随着新的标记技术的发展，生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加，图谱上标记的密度也将越来越高。建立起完整的高密度的分子图谱，就可以定位感兴趣的基因。

二、基于图谱克隆基因

图位克隆(Map—bascd cloning))是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表达产物，就可以直接克隆基因。图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用铺平了道路。

三、物种亲缘关系和系统分类中的应用

分子标记广泛存在于基因组的各个区域，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。

四、用于疾病诊断和遗传病连锁分析

1980年，Bostein等成功的将PFLP技术用于镰刀型贫血症的诊断分析，开创了基因诊断的先河。PFLP是以孟德尔方式遗传，因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志。目前，许多与相连锁的致病基因得以定位。小卫星和微卫星因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析。随着高通量SNP检测技术方法的出现，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用。

分子标记技术的展望

目前，分子标记技术已飞速发展，并被广泛应用于动植物的遗传研究中。分子标记中的已在玉米、大豆、鸡、猪等动植物育种和生产中有许多应用研究，主要集中在基因定位、辅助育种、疾病治疗等方面的应用研究工作，取得了一些应用成果。分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研究的热点。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术。而分子标记技术与提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合，必将加速遗传图谱的构建、基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析。