朊病毒致病机理研究进展

朊病毒致病机理研究进展

杨建民,郝永新,宁章勇,赵德明

(中国农业大学动物医学院国家动物海绵状脑病实验室,北京　100094)

摘要:朊病毒病是由一种新型蛋白感染因子引起的人和动物可转移神经退化性疾病,又称海绵状脑病,最终可导致患者死亡。作者就朊病毒的致病机理,从朊病毒学说,致病性、生物学特性进行阐述,并从病原基因遗传结构特点,致病蛋白的结构特点和形成机制作以综述,为该类疾病的防治提供理论依据。

关键词:朊病毒;P rPc;P rP sc;发病机理

中图分类号:S85.2 文献标识码:A 文章编号:167127236(2004)1020034204

自20世纪80年代欧洲疯牛病的爆发到由疯牛病感染而导致人的新型克雅氏病(nvCJD)

(A tw ood,1998)的出现,使得人们越来越重视对

B SE病原朊病毒及朊病毒病的研究。P ru siner等(1982)首次提出的朊病毒假说已逐步得到人们的认可。朊病毒病是由一种新型蛋白感染因子引起的人和动物可转移神经退化性疾病,又称海绵状脑病,最终可导致患者死亡。此类疾病包括人的震颤病,克雅氏病(CJD),吉斯综合征(GSS)和致死性家族失眠症(FF I)以及动物的羊瘙痒病、牛海绵脑病(俗称疯牛病)和鹿、猫、水貂等的海绵状脑病,这些疾病的共同特征是使动物和人产生认知和运动功能的严重衰退直至死亡,其临床和病理特征表现为脑组织的海绵体化、空泡化、星形胶质细胞和小胶质细胞的形成以及致病蛋白的积累(B randner,1996)。

十几年来,人们在探索朊病毒致病机理方面,进行了不懈的努力,现就此方面的研究进展作以综述。1　朊病毒疾病特征

朊病毒病潜伏期长,达数月至数年,甚至数10年。临床上以进行性共济失调、震颤、姿势不稳、痴呆或知觉过敏、行为反常等中枢神经系统症状为特征, 100%死亡。组织病变局限于中枢神经系统,以神经原空泡化、脑灰质的海绵状病变、神经胶质和星状细胞增生、P rP sc蓄积和淀粉样蛋白斑块为特征(B row n,2000)。病变通常两侧对称。

2　朊病毒的提出及其特性

自1936年证明痒病具有传染性以来,人们就力图分离这种传染性因子,进一步阐明其本质。利用梯度离心纯化并经蛋白酶处理后获得的具有感染性和

修回日期:2003206220

作者简介:杨建民(1973-),男,宁夏人,博士生,研究方向:预

防兽医学。电镜可见的两种组分—大分子纤维和一种优势蛋白成分。此大分子纤维即痒病相关纤维(scrap ie associated fib rils,SA F),此优势蛋白成分是一种抗蛋白酶的蛋白质(p ro tease2resistan t p ro tein,P rP)又名朊病毒蛋白(p ri on p ro tein,P rP)(W h ite, 1999)。自P ru siner提出朊病毒学说以来,越来越多的研究证据进一步支持该假说。朊病毒是不含核酸的蛋白质,可通过滤膜,福尔马林溶液不能完全消除其感染性,对核酸酶不敏感,对237nm紫外线非常敏感。这些特征表明感染因子朊病毒可能不含核酸。相反,用蛋白酶K、尿素、SD S等处理则使其失去感染性。致病的朊病毒蛋白P rP sc具有抗蛋白酶有限水解的能力,它特异地出现在被感染动物的脑组织中,呈淀粉样形式存在,经有限酶解后,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其分子量为27～30kD,称P rP27230, P rP27230仍保留其感染性(W ong,1999)。机体感染后不发热、无炎症和特异性免疫应答反应。

3　朊病毒分子生物学性质

基于对P rP27230蛋白质的部分氨基酸序列,对其基因和正常细胞蛋白(P rPc)的基因进行克隆和序列分析,发现正常动物体内由P rP基因编码,P rP 一级结构同朊病毒感染动物的P rP一级结构一致,两种情况下m RNA水平也相似,用抗P rP27230结合,发现P rP蛋白不但存在于未感染的组织细胞,而且以MW33～35kD的糖蛋白存在于许多内脏组织,称之为P rPc。值得注意的是,用有限蛋白酶K 消化时,P rPc完全降解,去掉N端66个氨基酸生成P rP27230(W ads w o rth,1999)。因此,P rP蛋白有至少二种不同的异构体:普遍存在的对蛋白酶敏感的形式P rPc以及只有在感染时才会存在的抗蛋白酶的形式P rP sc。

P rPc分子量33～35kD含有一对二硫键和二个N型复合寡糖链,二硫键和糖基化的残基都在C端。

N端含有由22个氨基酸残基组成的信号肽序列,C 端含有由23个氨基酸组成的糖基磷酸肌醇锚受体结合位点(GP I),已证明糖蛋白P rPc是定位于细胞膜的穴样内陷类结构域(CLD s)。P rP sc具有以下不同于P rPc的生化特性:①不溶于非变性去污剂;②具有相对的抗蛋白酶水解特性;③附着在细胞膜表面,磷酸肌醇磷脂酶C酶解不能使其从膜上释放出来;

④P rP sc与P rPc的构象表位不同(B row n,2000)。

4　朊病毒蛋白基因结构及转录

朊病毒蛋白是由宿主染色体基因编码的(Cohen,1999)。人的基因定位于第20号染色体的短臂上,鼠的基因也定位于第2号染色体的短臂上。P rP基因是单拷贝基因。朊病毒蛋白m RNA并不是由一个外显子组成,但整个开放阅读框包含在一个单一的外显子中,鼠、牛和羊的P rP基因是由3个外显子和2个内含子组成,而人的P rP基因是由2个外显子和1个内含子组成。P rP基因可能是一个持家基因。P rP的表达是组织依赖型的,鼠的不同组织中P rP m RNA水平各不相同,最高表达量在脑部和胎盘。而鼠脑组织中P rP m RNA主要存在于海马组织的锥形细胞、丘脑和新大脑皮层的大神经元以及蒲肯野氏细胞。此外,子宫肌层和精巢的精细管中也可表达。

5　朊病毒分子遗传特性

目前已获得了40多个物种的P rP核苷酸序列及由此推断出的氨基酸序列。整个开放阅读框的氨基酸序列同源性为70%,而成熟的蛋白质P rP232 231序列同源性为76%。在患病的人中,P rP序列中的突变都是非保守性替代,它们同人的散发性、遗传性及传染性朊病毒疾病相关。研究者最早观察到GSS以常染色体遗传的方式发病。现已证明人类遗传性朊病毒疾病的分子基础是P rP基因的突变。转基因研究结果也证明P rP基因的突变能引起神经退化性疾病。同时,GSS实验动物模型也有力证明了P rP基因突变可引起GSS、nv CJD和FF I。

P rP sc与P rPc都由同一基因编码,其氨基酸序列完全相同。因此P rP sc的形成是一种转录后修饰的过程。通过对P rP sc与P rPc的比较研究结果发现二者并无共价修饰的区别。利用转换红外光谱和圆二色对二者结构进行比较,发现它们在二级结构上有很大区别:P rPc含40%的Α螺旋,而含有很少或几乎不含Β折叠,相反P rP sc则含有43%的Β折叠及30%的Α螺旋。采用分子模式对P rP sc与P rPc 的三维结构进行预测,认为P rPc是一个含有4个Α

螺旋(H1～H4)的球形蛋白。在P rP sc中有2个螺旋H1和H2形成4个Β折叠链。一个二硫键将H3和H4连接在一起,稳定P rP sc和P rPc的结构。

6　PrPsc的形成—朊病毒蛋白的构象转变

研究者提出两种P rP sc形成机理:①“种子”模式机理,认为P rP sc的形成是一种核依赖的聚合过程,即,P rP sc低级聚合物充当种子。在“种子”不存在时,P rPc和P rP sc单体之间发生快速的可逆性构象变化,但P rPc单体构象比P rP sc稳定。当P rP sc “种子”存在时,它可通过与P rP sc单体的结合稳定P rP sc构象,加速P rPc向P rP sc的转变。这种稳定转换过程的最大障碍是起始的核形成过程。此模式能够解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病。②重折叠模式机理,认为P rP sc的形成是模板介导的转换过程。该模式下P rP sc构象比P rPc更稳定,二者之间存在能量屏障。在这种模式中,P rP sc依靠催化P rPc或一个不稳定的中间体的重排来提高转换,以形成更稳定的P rP sc构象。感染性将依赖于P rP sc 结合和催化中间分子转换的能力。这种模式能够解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒疾病。然而这2种模式并不是相互排斥的,在朊病毒繁殖过程中有可能是这2种模式共同作用(H ill,1999)。

体外转变试验不能证明P rPc能够变成有感染性的结构异型体,这使人们怀疑是否在体内有别的因子参与P rPc向P rP sc的转变。后来的试验证实,该蛋白可能是H sp60。

在酵母中发现了一种非孟德尔因子[sp i+],它是类似于哺乳动物朊病毒的一种自我修饰蛋白,其繁殖需要适量伴侣蛋白H sp104的参与(M iu ra, 1999)。过量和缺失的伴侣蛋白H sp104都能导致[sp i+]的失活。这一点可以用来解释在体外系统中,在缺少伴侣蛋白的条件下,朊病毒的诱导效率不高。可以推断,通过改变伴侣蛋白的数量和活性有可能控制朊病毒的感染,以至治疗朊病毒疾病。

7　PrPc的功能与PrPsc的致病作用

B row n则发现,P rPc有超氧化物歧化酶(SOD)的活性,对细胞抵抗氧化逆境有直接作用;并且P rPc变成P rP sc后,其结合铜离子的正常生理功能丧失,致使铜离子游离,对细胞产生毒性作用。

P rP sc具有潜在的神经毒性,其中P rP1062126称为神经肽,单独这一段小肽也能使在体外培养的神经细胞发生凋亡。而大量P rP sc在CN S尤其是在脑内的积累可抑制Cu2+与SOD或其它酶的结合,从而使神经细胞的抗氧化作用下降,P rP sc还可抑