儿童特发性血小板减少性紫癜Th亚群细胞因子的测定及意义

现代检验医学杂志第３ｏ卷第５期２０１５年９月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．５，Ｓｅｐｔｅ．２０１５　１４３　儿童特发性血小板减少性紫癜　Ｔｈ亚群细胞因子的测定及意义　

唐玉蓉　，王际亮　，孙婷婷　，伊心浩　（山东省胜利油田中心医院ａ．检验科Ｉｂ．科教科，山东东营２５７０３４）　

摘　要：目的　研究外周血Ｔｈ亚群细胞因子ＩＦＮ一７，ＩＬ一４和ＴＧＦ－ｉ３１在急、慢　ｔ￣－）Ｌ童特发性血小板减少性紫癜中的浓度及　临床意义。方法　应用流式细胞术检测外周血ＩＦＮ一　和ＩＬ４表达水平，采用酶联免疫（ＥＬＩＳＥ）法检测外周血单个核细胞　生成的ＴＧＦ－１３１水平，并与２４例正常对照组检测进行比较。结果　ａＩＴＰ惠儿Ｔｈｌ细胞因子ＩＦＮ一７阳性百分比高于正常　对照组（Ｐ＜Ｏ．０５），ｃｌＴＰ患儿Ｔｈｌ细胞因子ＩＦＮ一７阳性百分比较对照组显著降低（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）。ａｌＴＰ患儿Ｔｈ２细胞因子　ＩＬ一４与正常对照组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），ｃｌＴＰ患儿Ｔｈ２细胞比对照组显著升高（Ｐ＜Ｏ．０５）。ａＩＴＰ和ｃＩＴＰ　Ｔｈ３细胞因子ＴＧＦ－１３１水平均较正常对照组明显降低，ｃｌＴＰ较ａＩＴＰ显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　儿　童急、慢性ＩＴＰ中Ｔｈ细胞因子对其发病机制研究及鉴别诊断有重要价值。　关键词：儿童；特发性血小板减少性紫癜；干扰素一７；白细胞介素一４；转化生长因子一６１；流式细胞术；外周血　

单个核细胞　中图分类号：Ｒ５５４．６；Ｒ３９２．１２文献标志码：Ａ文章编号：１６７１—７４１４（２０１５）０５—１４３—０３　ｄｏｉ：ｉ０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－７４１４．２０１５．０５．０４５　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　

Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　Ｔｈ　Ｓｕｂｓｅｔｓ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎ　ＩＴＰ　０ｆ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ＴＡＮＧ　Ｙｕ－ｒｏｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｊｉ—ｌｉａｎｇ　，ＳＵＮ　Ｔｉｎｇ—ｔｉｎｇ　，ＹＩ　Ｘｉｎ－ｈａｏ　（ａ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ　ｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ　ｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈｅｎｇｌｉ　０ｉｌ　Ｆｉｅｌｄ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｄｏｎｇｙｉｎｇ　２５７０３４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　Ｔｈ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｓｕｂｓｅｔｓ　ｏｆ　ＩＦＮ一　，ＩＬ一４　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ＴＧＦ一６１　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＦＮ一７，ＩＬ－４　ａｎｄ　ＴＧＦ－￣Ｉ（ｐｒｏ—　ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（Ｅ—　ＬＩＳＥ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　２４　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＦＮ一．ｙ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ａＩＴＰ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＦＮ一　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ｃＩＴＰ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜Ｏ．０　１）．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＬ一４　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ａｌＴＰ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＬ一４　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ｃＩＴＰ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＴＧＦ－　口１　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ａＩＴＰ　ａｎｄ　ｃＩＴＰ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈａｔ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｃＩＴＰ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ａＩＴＰ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　Ｔｈ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｕｔｅ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ＩＴＰ　ｉｓ　ｏｆ　ｇｒｅａｔ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｌｄｒｅｎ；ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ；ＩＦＮ一　；Ｉ　４；ＴＧＦ－￣Ｉ；ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅ－　ａｒ　ｃｅｌｌｓ　特发性血小板减少性紫癜（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　ｔｈｒｏｍ－　群细胞及其相应细胞因子的作用，本文对２０１１年　ｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ，ＩＴＰ）是一种自身免疫性血小　１Ｏ月￣２０１３年１Ｏ月我院收治的ＩＴＰ患儿外周血　板减少性疾病，以皮肤、黏膜出血、血小板数目减　７一干扰素（ＩＦＮ一７），ＩＬ一４和外周血单个核细胞的　少，骨髓内巨核细胞成熟障碍、血小板生存时间缩ＴＧＦ一６１进行检测，观察其变化，探讨细胞因子在　短及患者血清或血小板表面常存在血小板表面抗　ＩＴＰ发病机理中的作用及临床意义。　体为临床特征。根据其发病机理、病程长短、预后　１材料与方法　的不同，儿童ＩＴＰ可分为急性（ａＩＴＰ）、慢性（ｃＩＴＰ）　１．１研究对象　本研究共选取ＩＴＰ患儿４４例，　两种。近年来，研究表明ＩＴＰ患者不仅有体液免　其中ａＩＴＰ患儿２４例，男性１Ｏ例，女性１４例，平均　疫异常，也有细胞免疫的异常，其发病机制与淋巴　年龄２．７～１３．４岁；ｃＩＴＰ患儿２０例，男性１１例，　细胞亚群、细胞因子表达及功能变化有着密不可分　女性９例，年龄２．１～１２．３岁，平均年龄７．２３岁，　的关系Ｌ１］。为了探讨儿童ＩＴＰ发病机制中Ｔｈ亚　诊断均符合张之楠［２］主编的《血液病诊断及疗效标　

＊作者简介：唐玉蓉（１９７５一），女，学士，副主任技师，从事临床检验领域的研究及检验工作，Ｔｅｌ：０５４６—８７７０１７１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｘｙｙｊｙｋｔｙｒ＠１６３．ｃｏｍ。　通讯作者：伊心浩。　１４４　现代检验医学杂志第３０卷第５期２０１５年９月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．５，Ｓｅｐｔｅ．２０１５　

准》，分组分型参照《实用内科学》第１１版。正常对　照为年龄、性别相近的健康儿童２５例。　１．２试弃】和仪器流式细胞仪为Ｅｐｉｃｓ　ＸＬ型（美　国Ｂｅｃｋｍａｎ　ｃｏｕｌｔｅｒ公司），Ｅｌｘ８０型酶联免疫仪　（美国ＢｉｏＴｅｉｃ公司），藻红蛋白（ＰＥ）一Ｃｙ５一抗人　ＣＤ３单克隆抗体、抗人ＣＤ８单克隆抗体及ＩｇＧ同　型对照、ＰＥ－抗人ＩＦＮ一　单克隆抗体、ＰＥ一抗人ＩＬ－４　单克隆抗体均购自美国ＢＤ公司，淋巴细胞分层　液、伏波酯乙醇（ＰＭＡ）、离子霉素（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）和　蛋白转运抑制剂莫能霉素（ｍｏｎｅｎｓｉｎ）均为Ｓｉｇｍａ　公司的产品，红细胞裂解液（美国ＩｍｍｕｎｏＰｒｏｂｅ公　司），Ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ和Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂ均为Ａｎ　Ｄｅｒ　Ｃｒｕｂ公　司的产品。ＴＧＦ一１７１用ＥＬＩＳＡ检测试剂盒为科华　生物公司产品。　１．３　方法　１．３．１　细胞培养：无菌采集ＩＴＰ患儿肝素抗凝的　静脉血４　ｍｌ，先取１００　ｌ新鲜抗凝血，用ＲＰＭＩ　１６４ｏＥ不含小牛血清一磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）］１：１等　体积稀释。加１／￣ｇ／ｍｌ　ＰＭＡ　１２　ｌ，１￣ｇ／ｍｌ离子　霉素４　ｌ，以及加入１　ｍｇ／ｍｌ的莫能霉素３．４　１，　混匀；３７℃，５　（ｖ／ｖ）ＣＯ：培养箱培养４～６　ｈ。另　取３　ｍｌ新鲜抗凝血，用密度梯度离心法分离ＰＢ—　ＭＣ，用含１０　ｇ／ｄｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０培养液　调整ＰＢＭＣ密度为１×１０。／Ｌ；取２　ｍｌ细胞悬液加　ＰＭＡ（终浓度为５０　ｔ￣ｇ／Ｌ）和离子霉素（终浓度为１　￣ｍｏｌ／Ｌ），置３７℃温箱中培养过夜，收集上清置一　７Ｏ℃冻存待测细胞因子。　１．３．２细胞染色：将上述培养后的外周血细胞平　均分为Ａ，Ｂ二管，各加入２０　ｌ　ＣＤ３，ＣＤ８单抗混　匀，３７℃避光孵育１５　ｍｉｎ；加固定剂Ａ　２００“ｌ　３７℃　避光孵育１５　ｍｉｎ，加ＰＢＳ　３　ｍ１震荡，１　２００　ｒ／ｍｉｎ　离心５　ｍｉｎ。弃上清后，Ａ管和Ｂ管同时加破膜剂　Ｂ　１００　ｌ，Ａ管加抗ＩＦＮ－７，ＩＬ一４，ＴＧＦ一』３１单抗，Ｂ　管加人同型对照ＩｇＧ单抗，３７℃避光孵育１５　ｒａｉｎ，　ＰＢＳ洗涤、离心、弃上清液。最后以ＰＢＳ悬浮细　胞，经流式细胞仪检测样本ＣＤ３＋，ＣＤ８一细胞中　表达ＩＦＮ一７，ＩＬ一４的阳性百分比。所得数据采用　Ｐａｒｔｅｃ软件进行分析，以ＣＤ３＋，ＣＤ８一设门表达　ＣＤ４＋Ｔ细胞（Ｔｈ），分析标本中Ｔｈｌ和Ｔｈ２细胞　占ＣＤ４＋Ｔ细胞的比例。　１．３．３　ＴＧＦ—Ｊ３１检测：取上述冻存的ＰＢＭＣ培养　上清，ＥＬＩＳＡ检测其ＴＧＦ—Ｇ１的水平，操作按试剂　盒说明书进行，酶联仪上测定４５０ｎｍ波长吸光度　（Ａ４５０　）。　１．４统计学分析采用ＳＰＳＳ１０．０软件进行统计　学分析，实验数据用均数±标准差（　±ｓ）表示，各　组数据进行正态检验及方差齐性检验后，采用单因　素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２　结果　表１为ＩＴＰ患儿与正常对照儿童外周血细胞　表１　ＩＴＰ患儿细胞因子与正常对照儿童外周血中细胞因子水平比较（ｘ－＋ｓ）　

注：与对照组比较，　Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ，　Ｐ＜０．０５；与ａＩ　Ｉ　Ｐ组比较，＃Ｐ＜Ｏ．０５。　因子检测结果，统计学分析显示，ａＩＴＰ患儿分泌　主要分泌ＩＬ一４，ＩＬ一５，ＩＬ一６和ＩＬ一１０等，促进Ｂ细胞　

ＩＦＮ一７的ＣＤ３＋，ＣＤ８一细胞（Ｔｈ１）与正常对照组　的分化、成熟和增殖，促进抗体尤其是ＩｇＥ和ＩｇＧ１　比较显著增高（Ｐ＜０．０５），ｃＩＴＰ患儿分泌ＩＦＮ—Ｔ　等抗体的大量产生，介导体液免疫应答口　］。Ｔｈ３　的ＣＤ３＋，ＣＤ８一细胞较对照组显著降低（Ｐ＜　细胞除分泌大量的ＩＬ－４和ＩＬ－１０外，主要高表达　０．０１），三组之间差异有统计学显著性意义（Ｐ＜ＴＧＦ—Ｉ３，可以下调抗原递呈细胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　０．０５），ｃｌＴＰ患儿分泌ＩＬ一４的ＣＤ３＋，ＣＤ８一细胞　ｃｅｌｌｓ，ＡＰＣ）及Ｔｈｌ细胞的活性，起免疫抑制作用。　明显高于对照组（Ｐ＜Ｏ．０５），三组之间差异无统计　ＩＴＰ免疫发病机制迄今尚未完全阐明，以往众多研　学显著性意义。ａＩＴＰ患儿外周血单个核细胞的　究已证实ＩＴＰ免疫活性细胞过度活化、细胞因子　Ｔｈ３细胞因子ＴＧＦ一８１较对照组显著降低（Ｐ＜　过量产生，但有关ＩＴＰ　Ｔｈｌ／Ｔｈ２功能状态仍有争　ｏ．０５），而ｃＩＴＰ患儿的Ｔｈ３细胞因子ＴＧＦ一８１较　论。ＩＦＮ一７主要生物学功能是免疫调节，除了诱导　ａＩＴＰ组显著升高（Ｐ＜０．０５），三组间差异有统计　多种抗原提呈细胞表达ＭＨＣ—Ｉ／Ｉ１分子，活化单　学显著性意义。　核、巨噬细胞并增强其溶菌活性及分泌ＩＬ一１，６，８，　３讨论Ｔｈ细胞是机体免疫应答的中心细胞，按ＴＮＦ—ａ外，还能活化中性粒细胞、ＮＫ细胞，刺激血　其分泌细胞因子的不同可分为ＴｈＯ，Ｔｈｌ，Ｔｈ２和　管内皮细胞和白细胞合成的黏附分子，促进Ｔｈｌ　Ｔｈ３。Ｔｈｌ细胞主要分泌ＴＮＦ—Ｂ，ＩＦＮ一７和ＩＬ一２　细胞发育和抑制Ｔｈ２细胞活化与增殖，刺激Ｂ细　等，主要参与细胞免疫和巨噬细胞活化。Ｔｈ２细胞　胞产生抗体。