工具酶与基因工程
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
基因工程知识点总结
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
考点38 基因工程
第十一单元现代生物科技专题考点38基因工程第一关辨析判别夯基固本1．有关工具酶的判断(1)限制酶只能用于切割目的基因。
()(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。
()(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。
()(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
()(5)限制酶也可以识别和切割RNA。
()(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。
()2．有关载体的判断(1)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。
()(2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。
()(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。
()(4)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。
()(5)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。
()3．有关基因工程原理与操作的判断(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑基因表达载体的序列。
()(2)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。
()(3)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(细胞)。
()(4)抗虫基因即使成功插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。
()(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。
()(6)应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。
()4．有关基因工程应用及蛋白质工程的判断(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，可能获得能产生人干扰素的菌株。
()(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。
()(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。
()(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。
()(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，可定向改变分子的结构。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
新教材高中生物第3章基因工程 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应PCR技术教师用书苏教版选择性必修3
第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。
科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。
社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。
↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。
史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
基因工程(第二章答案)
第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends(or cohesive end)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Star activity星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
5. Klenow fragment Klenow 片段。
Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。
6.Reverse transcriptase反转录酶。
即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。
7.Terminal transferase（末端转移酶）8.Ligase连接酶。
催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
9.T4 polynucleotide kinase（T4多聚核苷酸激酶）催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。
10.Alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。
可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
基因工程常用的工具酶
四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度：
反应温度：
DNA的分子结构：
酶缓冲液组成： 甘油浓度：
MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）： 牛血清白蛋白（BSA）：
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA：
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA：
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶） 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
与识别位点一致 Mg2+
低
高
EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种
基因工程的概念
15.2 基因工程中的工具酶
（二）、限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指Ⅱ型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，
“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制
15.1 基因工程的概念
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用
• • • • • 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique)
15.1 基因工程的概念
转基因植物
15.1 基因工程的概念
转基因动物作 为生物发生器
15.2 基因工程中的工具酶
• 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 • DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 • 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
• 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
• 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 • 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 • 其它酶类 — 用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化， 检测等
AHOPAGCT T-3’ T TCGAPOHA-5’
AHOPAGCT T-3’ T TCGAPOHA-5’
T4 DNA连接酶
5’-AAGCTT 3’-TTCGAA 或 5’-AAGCTT 3’-TTCGAA
AAGCTT-3’ TTCGAA-5’ AAGCTT-3’ TTCGAA-5’
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
第三章基因工程的工具酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶作用的特点： （1）要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA； （2）接受模板指导； （3）需要有引物（3’羟基）的存在； （4）不能起始合成新的DNA链； （5）催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端； （6）催化DNA的合成方向是5’—3’。
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRⅠ 37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G …
33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
5’
Klenow
P-A-A-T-T-C-G-A-G … OH-G-C-T-C …
dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子， 通常是Mg2+ 。
缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的 pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内 。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下 ，其功能最佳。
巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有 用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的 稳定性。