western前蛋白样品的准备(参考资料)
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
蛋白样本制备与WB
主要内容
一 蛋白样本制备的目的与重要性
二 蛋白样本制备的总体策略和原则
三 案例分析—细胞总蛋白的提取
1 细胞裂解液配方分析与技术要点 2 表面活性剂的选择
3 蛋白酶抑制剂与其”鸡尾酒”
4 磷酸酶抑制剂
四 蛋白提取产品选择指南
1 核蛋白与转录因子EMSA分析
2 膜蛋白提取
3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒
蛋 白 酶 抑 制 剂 选 择 指 南
4
磷
alkaline phosphatase as well as serine/threonine protein phosphatases such as PP1 and PP2A.
Alkaline phosphatases as well as protein threonine phosphatases (PTPs). 氟化钠 焦磷酸钠 正钒酸钠
表 面 活 性 剂 选 择 指 南
选用表面活性剂考虑的因素
参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂 工作条件下表面活性剂的溶解性 考虑表面活性剂的去除方法 保护蛋白活性时,不仅考虑使用表面活性剂的种类还有浓度 根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类 表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量 使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等 尽量使用毒性较低的表面活性剂 因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离 有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表
DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度. 可以适量加入Glycerine,稳定蛋白.
四 蛋白样本制备产品选择指南
1 核蛋白样本制备
抽提原理 低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白
蛋白印迹法的基本过程
蛋白印迹法的基本过程什么是蛋白印迹法？蛋白印迹法（Western blotting）是一种用于检测特定蛋白质在样品中存在与否以及其相对丰度的实验方法。
它基于免疫学原理，通过将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并利用特异性抗体的结合来检测目标蛋白质的存在和浓度。
蛋白印迹法具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围，常用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域。
下面将介绍蛋白印迹法的基本过程，包括准备样品、电泳分离、转印、固定和检测等步骤。
1. 准备样品蛋白印迹法开始前需要从待检测的生物样品中提取蛋白质。
样品可以是细胞培养物、组织样本、血清或其他体液，根据不同研究目的选择不同样本类型。
提取蛋白质的方法可以采用细胞裂解或切碎组织等方法，以释放蛋白质。
在提取过程中，添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂等辅助试剂可保护蛋白质免受降解。
此外，还需对提取的蛋白质进行测定，以掌握蛋白质的总量。
2. SDS-PAGE电泳分离样品中提取到的蛋白质会在电泳分离中根据分子量（大小）被分离开来。
常用的电泳方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
首先，将样品混合物加入到聚丙烯酰胺凝胶的样品孔中。
电泳时，电场会使得蛋白质带电并向电极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质将被解离成线性状态，并获得相同的电荷密度。
蛋白质在电场作用下，由负极向正极迁移。
而根据蛋白质分子量的不同，迁移速度也不同，从而实现了蛋白质的分离。
3. 转印转印（blotting）是将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到含有蛋白吸附性纸膜的固相材料上的过程。
这个步骤是为了方便后续的特异性抗体结合和信号检测。
转印分为湿法转印和半干法转印两种方法。
湿法转印需要将蛋白分离凝胶与固相材料（通常是尼龙膜或聚乙烯膜）浸泡在缓冲溶液中，然后通过电流使蛋白质从凝胶中转移到固相材料上。
半干法转印采用蛋白质毛细作用实现分离凝胶与固相材料之间的转接。
4. 固定转印完成后，需要对蛋白质进行固定以防止其在后续步骤中的流失。
实验步骤- Western bloting 实验流程 (2012-5临床医
Western blotting实验流程实验流程共分为6步：1 待测蛋白的准备；2 蛋白电泳；3 转膜；4 抗体结合；5 曝光；6 灰度值统计分析。
一、待测蛋白的准备1.细胞蛋白的提取：（1）拿出六孔培养板，去培养液，PBS洗细胞两遍，根据细胞密度每孔加50~100µl细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配），冰上放置10分钟裂解。
（2）将培养板置于冰上，用细胞刮挂下细胞，每孔刮一分钟左右（刮不同孔细胞需用PBS 或水冲洗细胞刮，洗后甩干），收集裂解液于1.5ml EP管中，置于冰上裂解20分钟，期间需用振荡器振荡混匀3次，每次15秒左右（3）12000rpm，4℃冷冻离心5min左右，收集上清置于新EP管，存于-80℃。
2. BCA法蛋白溶液浓度测定（具体步骤按试剂盒说明书）（1）配制BCA工作液：打开37℃恒温箱预热加温，取出BCA标准品与蛋白样品解冻，配BCA工作液，A：B=50：1，A液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*200µl，B液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*4µl，配好后混匀。
（2）配制BCA标准品与标准曲线：用PBS稀释好标准品，按说明书将标准品加入到96孔板中，再补加PBS到一样体积。
（3）配制蛋白样品：每孔加入5µl蛋白原液，补加PBS稀释（稀释可节省蛋白，记住稀释倍数，蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测；蛋白孔可做2~3个平行孔，测量时取平均值较准）（4）加入BCA工作液：每孔各加200µl已配好的工作液，盖上板盖混匀30秒，37℃孵育30min，放好蛋白样品。
（5）测蛋白浓度：打开酶标仪预热10分钟以上，孵育完后取出96孔板冷却到室温，用移液枪去除小气泡，用纸巾擦干96孔板板度水珠，调节酶标仪波长，放入打印纸，打开96孔板板盖，在570nm波长下读取数值，空白孔可设可不设。
（具体按酶标仪操作说明，可以测几次选取）（6）计算浓度：用EXCELL表格制作标准直线方程，计算待测蛋白浓度（若稀释测量的记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度），然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各组蛋白上样体积与细胞裂解液RIPA的补加体积。
western-blot-相关试剂及步骤
Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）:1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。
每管研磨的转速和时间保持一致。
当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm，4摄氏度，30分钟6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。
前者用于测试，后者备用。
-80摄氏度冻存。
注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）：（一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液（二）步骤1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
12% 20-55
3.3
15% 10-20
2.3
18% ≤10 1.3
学湘
中 雅30％丙烯酰胺（ml）
2
2.7
3.3
4.0
5.0
6.0
心 二 1.5MTris－HCl 医 （PH8.8）（ml）
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
院 10％SDS（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
10％AP（ml）
学
学湘
中雅
心二
医
院
一：蛋白定量（实验过程）
加标样+水（共10ul）
中
儿 童 医
南 大 学
样品5ul+水5ul
加入200ul（A+B)工作液，A液：B液=50:1
学湘 中雅
混匀放置37℃培养30min,测OD值，562nm
心二
医
院标样 0
12
46
8
10
(ul)
水(ul) 10
9
8
6
4
2
0
一：蛋白定量（数据处理）
儿 童 医
南用• 在当的浓甘Tr缩氨is胶酸－中到甘：达氨在分进酸离入胶缓分后冲离，系胶由统前于由。分于离等胶速的电pH泳8现.8象，而甘被氨浓酸缩离。解这度是加由大于，
大 学
在电电泳泳迁缓移冲速液度中变主大要超存过在蛋三白种质阴－离SD子S ，复C合l离物子，、甘甘氨氨酸酸和阴C离l离子子以的及界蛋面 白很质快－超S过D蛋S 复白合质物－，SD在S浓复缩合胶物的。p这H时6.8蛋下白，质甘－氨S酸DS只复有合少物量在的分电离离胶，
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
westernblot操作规范
Western blot操作流程1. 样品的准备a 收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对丁某些特定的业细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些业细胞组份蛋白，也可以使用相应的蛋白抽提试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对丁一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
b样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2>< 5X 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5冲勺SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5邓勺SDS-PAGE蛋白上样缓冲液的配置100C或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
如果不立即电泳，样品可放置丁-20 C或者-80 C保存。
2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）a准备SDS-PAGE凝胶[1] .按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。
（注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗一遍，晾干）[2] .装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。
[3] .根据表1确定凝胶浓度体积，按表3配制分离胶溶液。
按表中成分顺序加入烧杯配制。
[4] .小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,灌到足够高度。
注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm,即梳齿长再加1 cm。
）[5] .轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。
[6] .凝胶充分聚合。
时间约30~60min,聚合后在覆盖层和凝胶的界面问有一活晰的折光线。
Western blot过程
Western blot一、蛋白样品的制备（所有过程在冰面上进行）1）细胞传代后至少24小时，可换液加药，而后根据药物要处理的时间来确定什么时候提取蛋白。
2）从细胞房取出细胞后于冰面上，以冷的（4℃）PBS冲洗3次培养皿中的细胞,将皿静置后吸去剩余的PBS3）向中皿(大皿150ul)里加入80-100微升的含PMSF（蛋白酶抑制剂）的裂解液（裂解液：PMSF:EDTA=100:1:1），对于易变性的蛋白（如酶）于冰上裂解30Min（或对于不易变性的蛋白，可进行超声裂解，超声2次，每次以有声音的时候开始到无声音的时候结束为一次循环）（原裂解液是10x的，蛋白酶抑制剂和EDTA都是100x的，最终都要稀释成1x的）4）裂解完成后将细胞从培养皿上刮下来，刮完后将培养皿倾斜，让细胞沉降。
5）用枪将其吸取至离心管中用4℃,12000RPM，离心10Min6）将上清转移至干净的离心管中7）取部分样品一般用三蒸水稀释10倍于新的离心管中（要保证够重复3孔的量，即30微升），用于BCA蛋白浓度的测定置于冰面上待用8）用三蒸水配制不同浓度的标准蛋白样品（0 ug/ml、125 ug/ml、250 ug/ml、500 ug/ml、750 ug/ml、1000 ug/ml、1500 ug/ml、2000ug/ml）体系一般在1ml之内。
9）配制BCA工作液（A:B=50：1）,根据样品量制备合适量的BCA工作液（BCA体积：样品体积=10:1）10) 取100微升的BCA工作液，待测样品要重复3孔，而后加入10微升标准样品及待测样品于96孔板，37℃孵育30min11) 全波长扫描仪，于562nm处检测OD值，算得标准曲线，计算待测样品蛋白浓度12）电泳样品的制备，取适量上清，加入适量（1:1）5x蛋白上样缓冲液，（最终上样时要使蛋白上样缓冲液稀释至1X），混匀煮沸10Min （这步可与第十部同时进行,这时可以先煮蛋白后加loading）二、凝胶的制备1）灌胶前，先组装好制胶器，洗净且干燥的玻璃板底板底端对其后，置于支架上。
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仅供借鉴@
1
Western blot前蛋白的准备
1、 取得组织或细胞后，下面用细胞举例：
2、 贴壁细胞先用预冷的PBS洗两遍，之后加入适量的强RIPA
（300ul）（里面加入100×的PMSF）（RIPA的量不能太多，不然所
得蛋白浓度太低），加入RIPA后，将细胞刮下来（组织的话，先
研磨碎，在加RIPA）；（悬浮细胞：先离心，再用PBS重悬后，离
心）
3、 将细胞在RIPA中刮下来后，转移至离心管中，置冰上，裂解
20min；
4、 之后，离心，4度、12500转，10min；
5、 然后，吸取上清，即为所提的粗蛋白；
6、 蛋白浓度的测定，之后将蛋白储存于-80；
7、 从上述所提蛋白中取出一部分，如40ul，加入10ul的5×
loading buffer（蓝色），尽量算出稀释后蛋白的浓度；（高浓度
利于储存！！）
8、 之后将该50ul的蛋白煮沸10min，储存于-20/-80待用；
Western之前蛋白样品的处理：
因为做Western时，各组蛋白上样量，及上样体积都应该一致；
故，根据所用蛋白的浓度来确定样品处理：
仅供借鉴@
2
如：一个蛋白的浓度为：20ug/ul；
一般上样量为20-100ug，上样体积为10-30ul(一般10/20ul)（视情
况而定，如果所跑的蛋白本来表达较高，可以减少上样量；而如果所
跑蛋白表达较少，可以提高上样量），下面以50ug，10ul为准，故要
取出2.5ul蛋白，然后加入1 ×loading buffer将体积补到10ul即
可。是根据上样量，算出所需的蛋白样品体系，之后用1×loading
buffer补齐到上样体积。
Western Blot蛋白样品制备
（一） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培
养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后
弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、 按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与
裂解液混合。）
4、 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常
来回摇动。
仅供借鉴@
3
5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂
解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（二） 组织中总蛋白的提取：
1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、 加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心
5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（三） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下
是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复
洗涤一次。
3、 用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹
以使细胞充分裂解。
4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管
中并置于－20℃保存。